Name: 호흡 측정을 위한 마우스 골격근으로부터 미토콘드리아의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-10T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: 학습하세요 마우스 골격근에서 미토콘드리아를 분리하고 호흡을 분석하는 효율적인 방법을. 이 프로토콜은 다중 샘플 동시 처리가 가능하며 노화, 약물 테스트, 암 연구 등 다양한 생물학적 연구에 활용됩니다.

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우리는 후안 J. 테나 (Juan J. Tena)에게 균질 기와 CABD Proteomics 및 축산 시설을 기술 지원으로 사용해 주신 것에 대해 감사드립니다. 이 작업은 스페인 교육, 문화 및 스포츠부에서 FPU16/03264 - J.D.H..C., 협회 Française contre les Myopathies (AFM)를 통해 C.V.-G.에 대한 펠로우십 보조금 #22450, 기관 보조금 MDM-2016-0687 (Maria de Maeztu Excellence Unit, CABD의 유전자 규제 및 Morphogenesis 부서) 및 BFU2017-83150-P를 J.J.C에 지원했습니다. Junta de Andalucía 보조금 P18-RT-4572, 유럽 연합의 FEDER 자금 지원 프로그램 및 스페인 과학, 혁신 및 대학부는 RED2018-102576-T를 P.N.에 부여합니다.

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저자는 공개 할 이해 상충이 없다고 선언합니다.

미토콘드리아 호흡을 연구하는 데 사용되는 모든 방법에는 한계가 있습니다. 따라서 특정 실험 질문에 가장 적합한 방법을 선택하는 것이 중요합니다. 이 연구는 미토콘드리아 기능을 조사하기 위해 다양한 호흡 분석을 수행하기 위해 마우스 골격근에서 미토콘드리아를 분리하는 업데이트되고 상세한 프로토콜을 제공합니다. 실제로, 마이크로플레이트 기반 기술을 사용하여 분리된 미토콘드리아에서 미토콘드리아 생물에너지학에 대한 연구는 재현성, 신뢰성 및 복잡성 측면에서 조직 특이적 호흡을 연구하는 데 가치가 있습니다. 또한, 분리된 미토콘드리아의 사용은 기질 가용성에 대한 통제력을 부여하여, 근본적인 생물학적 과정에 대한 이해를 용이하게 한다. 단리된 미토콘드리아를 사용하는 또 다른 긍정적인 측면은 대부분의 막횡단 ATPases가 손실됨에 따라 ADP 주사 후 생성된 ATP가 새로운 ADP로 다시 전환되지 않기 때문에 상태 III을 연구할 수 있다는 것이다. 더욱이, 본원에 기재된 분석에서, 올리고마이신은 잠재적인 비특이적 ATP 합성을 차단하기 위...

미토콘드리아는 세포의 주요 대사 소기관입니다1. 이 특수 막 밀폐 된 소기관은 영양 분자를 사용하여 OXPHOS에 의한 아데노신 삼인산염 (ATP) 형태로 에너지를 생산합니다. 이 과정은 ETC2에서 일련의 산화 환원 반응에서 공여체 분자로부터의 전자의 전달에 의존합니다. CoQ는 항산화 기능을 나타내는 모든 세포막과 순환 지단백질에서 내인성으로 생산되는 유일한 산화환원 활성 지질입니다3. 그것은 ETC의 필수 구성 요소이며, NADH 의존성 복합체 I 및 FADH2 의존성 복합체 II에서 복합체 III로 전자를 전달하지만, 많은 다른 환원 효소는 여러 세포 대사 경로의 필수 단계로서 미토콘드리아 CoQ를 유비퀴놀로 환원시킬 수 있습니다4,5.
이 과정 전반에 걸쳐, 전기화학적 양성자 구배가 미토콘드리아 내막을 가로질러 생성되며, 이는 ATP 신타제 복합체 V2에 의해 생물학적 활성 에너지로 변환된다. 결과적으로, 미토콘드리아 기능 장애는 주로 높은 에너지 요구 사항, 즉 뇌, 심장 및 골격근에 영향을 미치는 무수한 병리학 적 상태로 이어집니다6,7. 따라서 미토콘드리아 생물 에너지를 정확하게 분석하여 건강과 질병, 특히 골격근과 같은 에너지가 높은 조직에서 그 역할을 조사하는 방법을 개발하는 것이 기본입니다.
클락형 산소전극은 미토콘드리아 호흡8의 연구에 고전적으로 사용되어 왔다. 그러나 이 시스템은 고분해능 기술로 점차 대체되어 왔으며, 애질런트 시호스 XF 분석기와 같은 마이크로플레이트 기반 산소 소비 기술이 특히 인기가 높습니다9. 골격근 분야에서, 이러한 연구는 전형적으로 배양된 세포, 주로 C2C12 불멸화 마우스 근원세포 세포주 또는 위성 세포로부터 유래된 일차 배양물10,11에서 수행된다. 그러나, 이들 연구는 특히 미토콘드리아 생물학을 조사할 때, 특히 특정 모욕, 비유전학적 개입 또는 유전자 조작에 대한 조직 수준에서 기능하는 상황을 완전히 재검토하지 않는다.
또한, 세포의 호흡 분석은 ATP의 미토콘드리아 외 수요 및 분석 기질 또는 신호 전달 사건을 포함한 추가 요인으로 인해 더 복잡하며, 이는 결과의 해석을 오도 할 수 있습니다. 대안적으로, 근육으로부터 갓 분리된 근섬유의 단일 또는 다발을 사용하는 것도 가능하다. 그러나 격리 방법은 기술적으로 도전적이며 몇 가지 근육 유형에서만 가능합니다. 이 경우, 굴곡근 디지토럼 브레비스 (FDB)와 신근 디지토럼 롱 어스 (EDL) 근육이 주로 사용되지만10,12,13, 몇 가지 보고서는 다른 근육 유형의 사용을 설명하지만14,15.
골격근 절편의 생체에너지 프로파일링도 보고되었다16. 이 방법의 가장 큰 장점은 손상되지 않은 근육을 연구 할 수 있다는 것입니다 (저자는 섬유를 통한 슬라이싱이 분리 된 근섬유와 비교할 때 결과를 방해하지 않는다는 것을 보여줍니다). 그러나, 기질 및 분석 억제제에 대한 미토콘드리아 접근은 제한되고, 따라서, 단지 몇 가지 파라미터만이 측정될 수 있다16. 마지막으로, 분리된 미토콘드리아도 마찬가지로 채용될 수 있다9,17,18,19. 이 경우 미토콘드리아는 세포 질 환경을 잃어 기능에 영향을 줄 수 있습니다. 대조적으로,이 방법은 기질 및 억제제에 대한 접근을 보장하고, 많은 샘플 유형의 분석을 가능하게하며, 일반적으로 더 적은 물질을 필요로합니다.
이 논문에서는 마이크로플레이트 기반 호흡 측정 분석을 사용하여 마우스 골격근으로부터 분리된 미토콘드리아의 생체에너지 프로파일링을 수행하는 방법을 설명합니다(그림 1). 특히, 세 가지 프로토콜이 상세하다: ETC와 OXPHOS 기계류 사이의 결합 정도를 평가하는 커플링 어세이, CA; 전자 유동 분석법, 개별 ETC 복합체의 활성을 측정하는 EFA; 및 미토콘드리아 β산화능을 결정하기 위한 BOX 분석법을 포함한다. 특히, 기존의 호흡 측정 방법과 비교하여 소량의 샘플 만 필요합니다. 여기에 사용된 격리 프로토콜은 다른 곳에 공개된 방법18에서 수정되었습니다.

<table><tbody><tr><td>ADP</td><td>Sigma</td><td>A5285</td><td>재고 -20 &deg; C</td></tr><tr><td>AKT 항체</td><td>세포 신호 기술</td><td>C67E7</td><td>토끼 (숙주 종)</td></tr><tr><td>anti-Goat HRP</td><td>Sigma</td><td>401504</td><td>Rabbit (숙주 종)</td></tr><tr><td>anti-Mouse HRP</td><td>Cell Signaling</td><td>#7076</td><td>말 (숙주 종)</td></tr><tr><td>Antimycin A</td><td>Sigma</td><td>A8674</td><td>Stock at -20 &deg; C</td></tr><tr><td>anti-Rabbit HRP</td><td>Cell Signaling</td><td>#7074</td><td>염소(숙주 종)</td></tr><tr><td>아스코르브산</td><td>Sigma</td><td>A5960</td><td>RT</td></tr><tr><td>Bactin 항체</td><td>Sigma</td><td>MBS4-48085</td><td>염소(숙주 종)</td></tr><tr><td>Bio-Rad 단백질 분석 키트 II</td><td>Bio-Rad</td><td>5000002</td> 여기에는 표준 곡선 BSA, 분획 V에 <td>대한 알려진 농도의 BSA 5x Bradford 시약과 BSA가 포함됩니다</td></tr><tr><td>. 지방산이 없는</td><td>Calbiochem</td><td>126575</td><td>재고 4 &deg; C</td></tr><tr><td>C 튜브</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td>보라색 뚜껑</td></tr><tr><td>Calnexin 항체</td><td>ThermoFisher</td><td>MA3-027</td><td>마우스 (숙주 종)</td></tr> <tr><td>D-mannitol</td><td>Sigma</td><td>M4125</td><td>RT</td></tr><tr><td>재고 EDTA</td><td>BDH</td><td>280254D</td><td>재고 4 &deg; C</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E-4378</td><td>RT</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma</td><td>C2920</td><td>재고 -20 &deg; C</td></tr><tr><td>gentleMACS Dissociator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>균질화기</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>RT</td></tr><tr><td>HSP70 항체</td><td>Proteintech</td><td>10995-1-AP</td><td>토끼 (숙주 종)</td></tr> <tr><td>LDH-A 항체</td><td>Santa Cruz 생명 공학</td><td>SC27230</td><td>염소 (숙주 종)</td></tr><tr><td>염화마그네슘</td><td>ChemCruz</td><td>sc-255260A</td><td>RT 주식</td></tr><tr><td>말산</td><td>시그마</td><td>P1645</td><td>RT 마이크로</td></tr><tr><td>플레이트 분광 광도계</td><td>BMG LABTECH GmbH</td><td>POLARstar OMEGA S/N 415-0292</td><td>RT 재고</td></tr><tr><td>Milli-Q water</td><td>Millipore 시스템</td><td>F7HA17757A</td><td>초순수</td></tr><tr><td>mtTFA 항체</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td></td><td>SC23588 염소(숙주 종)</td></tr><tr><td>Na+/K+-ATPase &alpha; 1 항체</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB300-14755</td><td>Mouse (Host species)</td></tr><tr><td>Oligomycin</td><td>Sigma</td><td>O4876</td><td>재고 -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Palmitoyl-L-carnitine</td><td>Sigma</td><td>P1645</td><td>재고 -20 &deg; C</td></tr><tr><td>PBS 정제</td><td>시그마</td><td>P4417-100TAB</td><td>RT</td></tr><tr><td>칼륨 이수소 인산</td>염 <td>ChemCruz</td><td>sc-203211</td><td>RT</td></tr><tr><td>수산화 칼</td>륨 <td>시그마</td><td>60377</td><td>재고 RT</td></tr><tr><td>Pyruvic acid</td><td>Sigma</td><td>107360</td><td>재고 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma</td><td>R8875</td><td>재고 -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Seahorse XF24 미토콘드리아 플럭스 분석기</td><td>Agilent Technologies</td><td>420179</td><td>XFe24 모델</td></tr><tr><td>Seahorse XFe24 FluxPak mini</td><td>Agilent Technologies</td><td>102342-100</td><td>키트에는 카트리지, 마이크로플레이트 및 캘리브런트 솔루션이 포함되어</td></tr> 있습니다. <tr><td>석시네이</td>트 <td>시그마</td><td>S7626</td><td>RT</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td>RT</td></tr><tr><td>TIMM23 항체 재고</td><td>Abcam</td><td>ab230253</td><td>토끼 (숙주 종)</td></tr> <tr><td>TMPD</td><td>Sigma</td><td>T7394</td><td>재고 -20 &deg; C</td></tr><tr><td>TOMM20 항체</td><td>Abcam</td><td>ab56783</td><td>Mouse (Host species)</td></tr><tr><td>VDAC 항체</td><td>Abcam</td><td>ab15895</td><td>Rabbit (Host species)</td></tr></tbody></table>

호흡 측정을 위한 마우스 골격근으로부터 미토콘드리아의 분리

Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays

대부분의 세포 에너지는 세포 요구에 반응하여 조절되는 미토콘드리아 산화 인산화 (OXPHOS) 시스템에 수렴하는 다양한 경로에 의해 포도당, 지방산 및 아미노산의 분해를 통해 얻어집니다. 지질 분자 코엔자임 Q (CoQ)는 일정한 산화 / 환원 사이클을 통해 전자 수송 사슬 (ETC)의 복합체 III로 전자를 전달함으로써이 과정에서 필수적입니다. 미토콘드리아 상태 및 궁극적으로, 세포 건강은 호흡 측정법을 사용하여 ETC 산소 소비를 측정함으로써 평가될 수 있다. 이들 연구는 전형적으로 수일 동안 배양된 확립된 또는 일차 세포주에서 수행된다. 두 경우 모두에서, 수득된 호흡 파라미터는 임의의 주어진 기관 또는 조직에서 정상적인 생리학적 조건으로부터 벗어났을 수 있다.
추가적으로, 골격근으로부터 분리된 배양된 단일 섬유의 본질적인 특성은 이러한 유형의 분석을 방해한다. 이 논문은 마우스 골격근에서 갓 분리 된 미토콘드리아에서 호흡 분석을위한 업데이트되고 상세한 프로토콜을 제시합니다. 우리는 또한 프로세스의 모든 단계에서 발생할 수있는 잠재적 인 문제에 대한 솔루션을 제공합니다. 여기에 제시된 방법은 다양한 트랜스제닉 마우스 모델의 산소 소모율을 비교하고 약물 치료 또는 노화 또는 성별과 같은 다른 요인에 대한 미토콘드리아 반응을 연구하는 데 적용될 수 있습니다. 이것은 미토콘드리아 생물 에너지 대사 및 조절에 관한 중요한 질문에 응답하는 실현 가능한 방법입니다.

여기에 제시된 프로토콜은 마우스 골격근으로부터 미토콘드리아의 분리를 통해 미토콘드리아 호흡의 생체내 분석을 허용한다. 이 방법의 개요는 그림 1에 나와 있습니다. 뒷다리에서 골격근을 해부한 후(그림 2), 조직은 등장성 조건 하에서 직렬 원심분리를 통해 균질화되고 미토콘드리아가 정제됩니다. 단리 과정 동안 수득된 상이한 분획의 순도는 상이한 소기관 마커에 대한 항체를 사용하는 웨스턴 블롯에 의해 분석될 수 있다. 도 3A는 단리된 분획에서 별개의 단백질 집단을 나타내는 상이한 분획으로부터의 일반적인 단백질 프로파일을 도시한다.
도 3B는 모든 미토콘드리아 함량이 미토콘드리아 분획 내에 있다는 것을 보여주며, 이는 미토콘드리아 분획 외부(VDAC 및 TO...

여기에서는 마우스 골격근으로부터의 미토콘드리아를 분리하는 상세한 방법과 마이크로플레이트 기반 호흡 측정법을 사용하여 산소 소모율(OCR)에 의한 호흡의 후속 분석을 설명한다. 이 파이프 라인은 미토콘드리아 대사에 대한 여러 환경 또는 유전 적 개입의 효과를 연구하는 데 적용될 수 있습니다.

Most of the cell&#39;s energy is obtained through the degradation of glucose, fatty acids, and amino acids by different pathways that converge on the ...

이 단어는 마우스 골격근에서 미토콘드리아를 처리 할 때 호흡 분석을 설명합니다. 이 프로토콜은 정제 시간을 상당히 줄이고 여러 샘플을 동시에 처리 할 수 있습니다. 유나이티드 배경의 여덟 성별의 동물로부터의 미토콘드리아는 이 프로토콜을 사용하여 절단될 수 있어 매우 다양한 실험 조건에서 호흡에 대한 연구가 가능하다.이 방법은 노화, 약물 검사, 암 또는 발달을 포함하여 미토콘드리아 기능이 관련된 모든 연구 분야에 적합합니다. 그것은 심지어 다른 조직과 유기체에도 적응할 수 있습니다. 미토콘드리아를 손상으로부터 보호하기 위해 절차 중에 얼음 위에 모든 것을 올려 모든 물질이 차가워 지도록하십시오.얼음 위에 시료 당 3 개의 50 밀리리터 비커를 놓고 비커 하나에 PBS 10 밀리리터, 비커 두 개에 10 밀리리터의 10 밀리리터 EDTA PBS, 비커 3에 네 밀리리터 IB1을 첨가하십시오. 안락사 된 마우스의 오른쪽 뒷다리에 모피가 흘리는 것을 방지하기 위해 70 % 에탄올을 뿌리고 사지를 코르크 해부 보드에 테이프로 붙인 다음 왼쪽 앞다리를 테이프로 붙입니다. 무릎에서 발끝까지 피부를 통해 멸균 된 일회용 메스로 절개하십시오.발목 높이에서 이빨이 달린 포셉으로 피부를 잡고 발목 주위에 미세한 가위로 자릅니다. 한 손에는 미세한 팁 핀셋으로 피부를 기저 근육에서 떼어 내고 다른 손에는 이빨이 달린 포셉으로 잡아 당깁니다. 발목에서 무릎까지 모든 골격근을 해부하고 미세한 핀셋과 가위를 사용하여 경골 전방 근육의 모든 결합 조직을 제거하십시오.신근 디지토럼 롱 근육의 네 개의 원위 힘줄을 찾아 발가락에 삽입하는 것에 가깝게 단면화하십시오. 경골 전방 원위 힘줄을 찾아 발목 아래에 삽입 할 수 있도록 자릅니다. 경골 전방 및 신근 디지토럼 롱 힘줄을 발목 위로 당겨 느슨한 끝을 해방시킵니다.힘줄의 느슨한 끝을 잡고 뼈의 나머지 근육 구조에서 근육을 위로 당겨서 근육을 완화시킵니다. 이 근육의 근위 힘줄을 무릎 뚜껑에 최대한 가깝게 자르십시오. 마우스를 거꾸로 뒤집어 위장관 및 발바닥 근육 추출을 진행하십시오.이두근, 대퇴골 및 위장관 사이에 형성된 주머니를 잡고 미세한 가위를 사용하여 근위 위장관 힘줄을 시각화하기 위해이 근육을 분리하십시오. 미세한 가위로 원위 아킬레스 건을 잡고 조심스럽게 자릅니다. 근위 위장관 힘줄을 자르고 밑창으로 풀어줍니다.조심스럽게 남아있는 근육을 해부하고 초기 위치에 마우스를 다시 고정하

isolation-mitochondria-from-mouse-skeletal-muscle-for-respirometric

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 프로토콜은 골격 근육에서 격리 mitochondria의 호흡을 연구하는 절차를 설명합니다. 이 방법은 Scorrano에서...

골격근에서 Mitochondrial 절연

광근의 lateralis의 조직 검사, 정제 미토콘드리아의 준비, 호흡계 프로파일 링하는 방법이 설명되어 있습니다. 작은 부피의 근육 사용은 임상 연구 애플리케이션이 기술에 적합하다.

경피적 바늘 생검에 의해 획득 골격근 조직에서 고립 된 미토콘드리아의 준비 및 호흡계 평가

제시된 방법은 최소한의 마우스 골격근에서 분리된 미토콘드리아를 사용하여 마이크로플레이트 기반 호흡 측정 분석 모음의 수행을 위한 단계별 지침을 제공합니다. 이러한 분석은 일반적으로 사용되는 동물 모델에서 미토콘드리아 산소 소비량의 기계론적 변화/적응을 측정할 수 있습니다.

높은 처리량 마이크로 호흡 측정을위한 마우스 골격근의 최소 수량에서 미토콘드리아 격리 사용

여기에서는 소량의 마우스 골격근에서 고품질의 정제된 미토콘드리아를 분리할 수 있도록 이전에 보고된 방법의 변형을 제시합니다. 이 절차는 마이크로플레이트 기반 호흡기 분석 중에 높은 기능으로 호흡하는 고도로 결합된 미토콘드리아를 생성합니다.

높은 처리량 마이크로 호흡 측정을위한 마우스 골격근의 최소 수량에서 미토콘드리아의 분리

여기서, 마취된 돼지에서 대퇴사두근 표본을 채취하고 미토콘드리아를 차등 원심분리로 분리합니다. 그런 다음 미토콘드리아 호흡 사슬 복합체 I, II 및 IV의 호흡수를 고해상도 호흡 측정을 사용하여 결정합니다.

고해상도 호흡율 측정을위한 차동 원심 분리에 의한 골격근에서 본래 미토콘드리아의 분리

미토콘드리아는 골격 근육에서 높은 수준의 페노티픽 가소성을 나타내는 주요 대사 세포기관입니다. 사이토솔에서 단백질의 수입은 세포기관 생물 발생을 위한 중요한 통로입니다, 망상의 확장 및 미토콘드리아 기능의 유지에 필수적입니다.  따라서, 단백질 수입은 세포 건강의 기압계 역할을 한다.

골격 근육 미토콘드리아의 단백질 수입 능력 측정

마이크로 해부 explants 기술은 골격 근육 줄기 세포의 원천으로 청소년, 성인이나 배아 근육에서 proliferative 골격근 세포를 분리를위한 강력하고 안정적​​인 방법입니다. 유니 클리,이 세포는 clonally 생체내 이식에 사용되는 골격 근육 줄기 세포 라인을 생산하기 위해 파생되었습니다.

성인 및 배아 골격근의 Microexplant 문화 및 골격 근육 줄기 세포의 분리

효소 분리, fibro / adipogenic 및 murine 골격근에서 myogenic progenitors의 유동세포계측법에 의해 표면 라벨 및 정화를위한 방법.

골격근에서 Progenitors의 정화

여기에 제시된 방법은 고 에너지 레이저 펄스와 시간을 통해 이러한 부상과 회복의 후속 분석 라이브 zebrafish 배아의 정확한 부상을 포함한다. 우리는 또한 유전자 하나의 표시 또는 골격근 세포의 그룹이 동안 레이저 광 유도 손상 후 추적 할 수있는 방법을 보여줍니다.

Zebrafish 배아 골격근의 레이저 쏜 부상

myofibers의 절연과 문화는 황금...

성인 골격근의 개인 Myofibers 및 위성 세포의 분리와 문화

학습하세요 마우스 골격근에서 미토콘드리아를 분리하고 호흡을 분석하는 효율적인 방법을. 이 프로토콜은 다중 샘플 동시 처리가 가능하며 노화, 약물 테스트, 암 연구 등 다양한 생물학적 연구에 활용됩니다.

호흡 측정을 위한 마우스 골격근으로부터 미토콘드리아의 분리

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