Name: 세포외 플럭스 분석을 이용한 단일 3D 미세조직 구상체의 미토콘드리아 에너지 대사 탐구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: 배우세요 3D 암 세포 구상체에서 미토콘드리아 에너지 대사를 탐구하는 방법입니다. Seahorse 세포외 플럭스 분석을 사용하여 단일 구상체 수준에서 정확한 대사 데이터를 수집하고 암 치료 표적을 식별할 수 있습니다.

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저자는 선언 할 이해 상충이 없습니다.

주요 결과 및 결과 이 논문은 XFe96 XF 분석기와 함께 일련의 암 유래 세포주를 사용하여 단일 3D 구상체의 미토콘드리아 에너지 대사를 조사하는 상세한 프로토콜을 제공한다. 강제 응집을 위한 세포 기피제 기술을 사용하여 A549, HepG2/C3A, MCF7 및 SK-OV-3 세포 구상체의 신속한 배양을 위한 방법이 개발되고 기술된다. 이 프로토콜은 (1) 스페로이드 배양 프로토콜의 최적화 및 기술 제조업체의 특정 스페로이드 분석 마이크로 플레이트로의 스페로이드 처리 및 전달을 포함하여 XF 기술로 스페로이드 대사를 조사하는 많은 고려 사항을 해결합니다. (2) 사용되는 호흡기 화합물의 농도 및 시간 의존성 화합물 침투; (3) 사용되는 주사 전략; (4) 실험 그룹 간의 데이터를 정규화하는 방법. 이러한 모든 고려 사항은 현재 논문에서 검토되었으며 아래에서 더 자세히 논의됩니다. 이러한 방법은 XFe96 Flux 분석기를 사용하여 단일 3D 구상체를 사용하여 일관된 대사 산소 플럭스 데...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/63346">Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids using Extracellular Flux Analysis</a>. The Representative Results section was updated.
Figure 5 was updated from:
<img alt="Oxygen consumption rate (OCR) graphs with oligomycin effects on A549, HepG2/C3A, MCF-7, SK-OV-3 cells." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63346/63346fig05.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 5"> 
Figure 5: Single or sequential injection of mitochondrial respiratory compounds. Cancer-cell-derived spheroids of MCF-7, HEPG2/C3A, SK-OV-3, and A549 were placed into wells of an XFe96 spheroid microplate in XF RPMI and probed for OCR using the Agilent Seahorse XFe96 analyzer. OCR was measured 5x, after which 2 µg/mL oligomycin (injection Port A: green trace) or 5 µM BAM15 (injection Port A: blue trace or injection port B: green trace) to inhibit the mitochondrial ATP synthase and determine maximal respiratory capacity, respectively. Kinetic OCR data are expressed as % basal (A-D). Maximal respiratory capacity (OCRmax) was calculated as a factor of basal OCR by the equation: OCRmax = OCRBAM15 / OCRbasal. OCRmax was obtained from OCR averages across measurement cycles 8-10 post BAM15 injection with (green bars) and without (blue bars) oligomycin. Data are averages ± SEM from 3-8 individual well replicates across the spheroid assay microplate. Abbreviations: OCR = oxygen consumption rate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63346/63346fig05large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Oligomycin effect on OCR in cancer cell lines; comparison graph; metabolic activity analysis." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63346/63346fig5v2.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 5"> 
Figure 5: Single or sequential injection of mitochondrial respiratory compounds. Cancer-cell-derived spheroids of MCF-7, HEPG2/C3A, SK-OV-3, and A549 were placed into wells of an XFe96 spheroid microplate in XF RPMI and probed for OCR using the Agilent Seahorse XFe96 analyzer. OCR was measured 5x, after which 2 µg/mL oligomycin (injection Port A: green trace) or 5 µM BAM15 (injection Port A: blue trace or injection port B: green trace) to inhibit the mitochondrial ATP synthase and determine maximal respiratory capacity, respectively. Kinetic OCR data are expressed as % basal (A-D). Maximal respiratory capacity (OCRmax) was calculated as a factor of basal OCR by the equation: OCRmax = OCRBAM15 / OCRbasal. OCRmax was obtained from OCR averages across measurement cycles 8-10 post BAM15 injection with (green bars) and without (blue bars) oligomycin. Data are averages ± SEM from 3-8 individual well replicates across the spheroid assay microplate. Abbreviations: OCR = oxygen consumption rate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63346/63346fig5v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63346">Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids using Extracellular Flux Analysis</a>. The Representative Results&#160;section was&#160;updated.

Erratum: Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids using Extracellular Flux Analysis

생물학적 연구에서 시험관 내 모델의 발전은 지난 20 년 동안 빠르게 진행되었습니다. 이러한 모델에는 이제 오르간-온-칩 양식, 오가노이드 및 3D 미세조직 구상체가 포함되며, 이들 모두는 시험관내 및 생체내 연구 사이의 번역을 개선하기 위한 공통적인 초점이 되었다. 고급 시험관 내 모델, 특히 구상체의 사용은 조직 공학, 줄기 세포 연구, 암 및 질병 생물학 1,2,3,4,5,6,7 및 유전 독성 학 8,9,10, 나노 물질 독성학 11을 포함한 안전성 테스트를 포함한 여러 연구 분야에 걸쳐 있습니다. 12,13,14, 및 약물 안전성 및 효능 시험8,15,16,17,18,19.
정상 세포 형태학은 생물학적 표현형과 활성에 매우 중요하다. 세포를 3D 미세조직 구상체로 배양하면 세포가 형태학, 표현형 기능 및 아키텍처를 채택할 수 있으며, 이는 생체 내에서 관찰되는 것과 비슷하지만 고전적인 단층 세포 배양 기술로 포획하기는 어렵습니다. 생체내 및 시험관내 둘 다에서 , 세포 기능은 세포 미세환경에 의해 직접적으로 영향을 받는데, 이는 세포 통신 및 프로그래밍에 한정되지 않는다(예를 들어, 세포-세포 접합 형성, 세포 틈새를 형성할 기회); 즉각적인 환경에서 호르몬 및 성장 인자에 대한 세포 노출 (예를 들어, 염증 반응의 일부로서 세포 사이토카인 노출); 물리적 및 화학적 매트릭스의 조성 (예를 들어, 세포가 뻣뻣한 조직 배양 플라스틱 또는 탄성 조직 환경에서 성장하는지 여부); 그리고 가장 중요한 것은 세포 신진 대사가 영양과 산소에 대한 접근뿐만 아니라 젖산과 같은 대사 폐기물의 처리에 의해 어떻게 영향을 받는지입니다.
대사 플럭스 분석은 정의된 시험관내 시스템 내에서 세포 대사를 검사하는 강력한 방법입니다. 특히, XF 기술은 무손상 세포 및 조직의 세포 생물 에너지학의 실시간 변화를 실시간으로 분석 할 수있게합니다. 많은 세포 내 대사 사건이 수초에서 분 정도 내에 발생한다는 것을 감안할 때, 실시간 기능적 접근법은 시험관 내에서 손상되지 않은 세포 및 조직에서 세포 대사 흐름의 실시간 변화를 이해하는 데 가장 중요합니다.
이 논문은 강제 응집 접근법을 사용하여 시험관내 3D 스페로이드 모델로서 암 유래 세포주 A549 (폐 선암종), HepG2/C3A (간세포 암종), MCF-7 (유방 선암종) 및 SK-OV-3 (난소 선암종)을 배양하기 위한 프로토콜을 제공한다 (그림 1). 또한 (i) 애질런트 XFe96 XF 분석기를 사용하여 단일 3D 구상체의 미토콘드리아 에너지 대사를 조사하는 방법을 자세히 설명하고, (ii) 단일 3D 구상체를 사용하여 XF 분석을 최적화하는 방법을 강조하고, (iii) 이 접근법을 사용하여 3D 스페로이드 대사를 조사하는 데 있어 중요한 고려 사항 및 한계에 대해 논의합니다. 가장 중요한 것은,이 논문은 산소 소모율 (OCR)의 계산이 산화 인산화 및 세포 구상체에서 미토콘드리아 기능을 결정할 수있게 해주는 데이터 세트가 수집되는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜에 대해 분석되지는 않았지만 세포외 산성화 속도 (ECAR)는 XF 실험에서 OCR 데이터와 함께 측정되는 또 다른 매개 변수입니다. 그러나 ECAR은 종종 XF 데이터 세트에서 잘못 해석되거나 잘못 해석됩니다. 우리는 기술 제조업체의 기본 접근 방식에 따라 ECAR 계산의 한계에 대한 논평을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>A549</td><td>ECACC</td><td>&nbsp;#86012804</td><td>폐암 세포주</td></tr><tr><td>Agilent Seahorse XF RPMI 배지, pH 7.4</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td>103576-100</td><td>XF 분석 배지(1mM HEPES 포함), 페놀 레드, 중탄산나트륨, 포도당, L-글루타민 및 피루브산 나트륨 없음</td></tr><tr><td>Agilent Seahorse XFe96 세포외 플럭스 분석기</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td>-</td><td>단일 스페로이드의 스페로이드 산소 흡수율 측정용 기기</td></tr><tr><td>Antimycin A</td><td>Merck Life Science</td><td>A8674</td><td>미토콘드리아 호흡기 복합체 III 억제제</td></tr><tr><td>BAM15</td><td>TOCRIS bio-techne</td><td>5737</td><td>미토콘드리아 프로트노포어 언커플러</td></tr><tr><td>Black-walled microplate</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655076</td><td>형광 기반 분석용</td></tr><tr><td>CELLSTAR 세포 발수 표면 96 U 웰 마이크로플레이트</td><td>Greiner Bio-One</td><td>650970</td><td>스페로이드 생성을 위한 마이크로플레이트</td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 3D 세포 생존도 분석</td><td>Promega</td><td>G9681</td><td>3D 마이크로조직 스페로이드의 세포 생존율 측정을 위한</td></tr> 분석 <tr><td>Cultrex Poly-D-Lysine</td><td>R& D Systems, 생명공학 브랜드</td><td>3439-100-01</td><td>XFe96 스페로이드 마이크로플레이트를 코팅하기 위한 분자 세포 접착제,</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>, Merck Life Sciences</td><td>G8270</td>, <td>세포 배양 성장 및 XF 분석 배지</td></tr><tr><td>Dulbecco' s DMEM(Modified Eagle Medium)</td><td>Gibco</td><td>11885084</td><td>HepG2/C3A 스페로이드용 배양 배지</td></tr><tr><td>EVOS XL 코어 이미징 시스템</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMEX1000</td><td>위상차 이미징 현미경</td></tr><tr><td>EZ-PCR 마이코플라즈마 테스트 키트</td><td>Biological</td><td>Industries 20-700-20</td><td>세포 배양에서 마이코플라스마 스크리닝</td></tr><tr><td>FIJI는 이미지일 뿐입니다</td>. 대조<td>된 이미지의 J 분석</td><td></td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Merck Life Science</td><td>F7524</td><td>세포 배양 배지 보충제</td></tr><tr><td>HepG2/C3A</td><td>ATCC</td><td>&nbsp;#CRL-10741</td><td>부모 HepG2 세포주의 클론 유도체인 간 암종 세포주,</td></tr><tr><td>Lactate-Glo</td><td>Promega</td><td>J5021</td><td>스페리드 배양 배지 내 젖산 측정을 위한</td></tr> 분석(<tr><td>200mM 용액)</td><td>Merk Life Sciences</td><td>세포 배양 성장 및 XF 분석 매체를 위한</td> <td>G7513</td> 보충제</tr><tr><td>M50 실체 현미경</td><td>Leica Microsytems</td><td>LEICAM50</td><td>입체 해부 micrscope; spheorid 처리에 사용됨</td></tr><tr><td>MCF-7</td><td>ECACC#</td><td>86012803</td><td>유방 선암 세포주</td></tr><tr><td>올리고마이신 Streptomyces diastatochromogenes</td><td>Merck Life Science</td><td>O4876</td><td>ATP 합성효소 억제제</td></tr><tr>세포 배양 배지에 항생제 첨가 <td>Penicilin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td> 세포 <td>배양 배지에 항생제</td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA 분석 키트</td><td>Initrogen</td><td>P7589</td><td>스페로이드의 dsDNA 분석</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Merck Life Science</td><td>R8875</td><td>미토콘드리아 호흡기 복합체 I 억제제</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>21875091</td><td>A549, MCF7 및 SK-OV-3에 대한 배양 배지 스페로이드</td></tr><tr><td>Seahorse Analytics</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td>빌드 421</td><td>https://seahorseanalytics.agilent.com</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 스페로이드 FluxPak</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td>102905-100</td><td>각 Seahorse XFe96 스페로이드 FluxPak 내용물: Seahorse XFe96 스페로이드 마이크로플레이트(102978-100) 6개, XFe96 센서 카트리지 6개, Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL(100840-000) 1병</td></tr><tr><td>, 혈청학 피펫: 세포 배양을 위한 5, 10 및 25 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>606107; 607107 760107</td><td>소모품</td></tr><tr><td>SK-OV-3</td><td>ECACC</td><td>&nbsp;#HTB-77</td><td>난소 선암 세포주</td></tr><tr><td>피루브산나트륨(100mM 용액)</td><td>Merck Life Science</td><td>S8636</td><td>세포 배양 성장 및 XF 분석 보조제</td></tr><tr><td>배지 T75 cm2 세포 배양 플라스크</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658175</td><td>세포 배양 유지를 위한 조직 배양 처리 플라스크</td></tr><tr><td>TrypLExpress</td><td>Gibco</td><td>12604-021</td><td>세포 해리 시약</td></tr><tr><td>웨이브 컨트롤러 소프트웨어</td><td>Agilent Technologies 주식회사</td><td>-</td><td></td></tr><tr>스<td>페이드 처리를 위한 넓은 입구가 있는</td> <td>와이드 오리피스 팁</td><td>STARLAB International GmbH</td><td>E1011-8400</td> 피펫 팁</tr></tbody></table>

세포외 플럭스 분석을 이용한 단일 3d 미세조직 구상체의 미토콘드리아 에너지 대사 탐구

Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis

구상체라고 불리는 3차원 (3D) 세포 응집체는 최근 몇 년 동안 시험관 내 세포 배양의 최전선이되었습니다. 세포를 2차원, 단세포 단층(2D 배양)으로 배양하는 것과는 달리, 스페로이드 세포 배양은 세포외 매트릭스 단백질의 발현, 세포 신호전달, 유전자 발현, 단백질 생산, 분화 및 증식을 포함하여 생체 내에 존재하는 생리적 세포 구조 및 특성을 촉진, 조절 및 지원한다. 3D 배양의 중요성은 종양학, 당뇨병, 줄기 세포 생물학 및 조직 공학을 포함한 많은 연구 분야에서 인정 받고 있습니다. 지난 십 년 동안 구상체를 생산하고 신진 대사 기능과 운명을 평가하기 위해 개선 된 방법이 개발되었습니다.
세포외 플럭스(XF) 분석기는 XF24 섬 포획 플레이트 또는 XFe96 스페로이드 마이크로플레이트를 사용하여 구상체와 같은 3D 미세조직에서 미토콘드리아 기능을 탐색하는 데 사용되었습니다. 그러나, XF 기술을 이용한 구상체에서 미토콘드리아 에너지 대사를 조사하는 뚜렷한 프로토콜과 최적화는 상세히 설명되지 않았다. 이 백서에서는 XFe96 XF 분석기가 있는 스페로이드 마이크로플레이트를 사용하여 단일 3D 구상체에서 미토콘드리아 에너지 대사를 조사하기 위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. XF 기술은 서로 다른 암 세포주를 사용하여 크기가 다른 것뿐만 아니라 다른 부피, 세포 번호, DNA 함량 및 유형의 3D 구상체에서 세포 호흡을 구별 할 수있는 것으로 입증되었습니다.
올리고마이신, BAM15, 로테논 및 안티마이신 A의 최적의 미토콘드리아 이펙터 화합물 농도는 3D 구상체에서 미토콘드리아 에너지 대사의 특정 파라미터를 조사하는 데 사용됩니다. 이 백서에서는 또한 구상체에서 얻은 데이터를 정상화하는 방법에 대해 논의하고 XF 기술을 사용하여 스페로이드 대사를 탐구 할 때 고려해야 할 많은 고려 사항을 다룹니다. 이 프로토콜은 고급 시험관 내 스페로이드 모델에 대한 연구를 추진하는 데 도움이됩니다.

잘 형성되고 컴팩트한 구상체를 얻기 위해, 각 세포주는 시딩 밀도 및 배양 기간 동안 개별적으로 최적화되었다(도 3). A549, HepG2/C3A 및 SK-OV-3 세포주는 초기에 느슨한 응집체를 형성하였고, 이는 배양 7일 후까지 명확하게 정의된 둘레를 갖는 둥근 구상체로 진행되지 않았다. 반대로, MCF-7 세포는 3일 이내에 구상체를 형성할 수 있었다. 모든 스페로이드 모델에 대한 배양 기간 후의 초기 세포 시딩 밀도와 스페로이드 부피 사이에는 명확한 상관관계가 있었다. 스페로이드 크기 및 형태학은 시딩 밀도에 최적화되었다. 형태학과 원형성은 모든 모델에서 스페로이드 크기가 증가함에 따라 감소하기 시작했습니다. 세포주에 대한 시딩 전략은 A549 및 SK-OV-3 세포에 대해 4 × 103 세포/웰에서 최적화되었다; HepG2 / C3A 세포는 이전에 다른 곳에서 1 × 10 3 세포 / 웰로 최적화되었으며 MCF-7 세포는 모든...

이 프로토콜은 사용자가 Seahorse 세포외 플럭스 분석을 사용하여 3D 암 세포주 유래 구상체에서 미토콘드리아 에너지 대사를 조사하는 데 도움이됩니다.

세포외 플럭스 분석을 이용한 단일 3D 미세조직 구상체의 미토콘드리아 에너지 대사 탐구

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing ...

우리의 프로토콜을 통해 연구자들은 미토콘드리아 에너지 대사와 원활한 구상체를 조사하여 여러 가지 세포주, 세포 수 및 표현형뿐만 아니라 현장 약물 발견 및 암 연구에서 약물 치료를 비교할 수 있습니다. 우리의 연구는 세포 단층 실험에 비해 우수한 생리 모델을 제공하는 3D 구상체를 사용하여 미토콘드리아 에너지 대사를 탐구하기위한 상세한 프로토콜을 제시합니다. 생물학적 관찰은 유리체 구상체에서 생체 내 종양으로 외삽하고 스페로이드 종양 대사를 표적으로 할 수있는 경로를 식별 할 수 있습니다.예를 들어, 구상체 성장 동안 탄수화물 유용성. 모든 데이터 해마 세포 외 플럭스 96 기기는 매우 민감합니다. 분석 플레이트 내의 시험관내 구상체 위치화는 단일 스페로이드 수준에서 정확한 데이터를 얻는 데 가장 중요하다.4x 배율에서 위상 대비가 있는 반전된 광학 현미경을 사용하여 스페로이드 생존력을 확인하여 시료 간의 온전한 스페로이드 구조, 형태학 및 전반적인 균일성을 보장합니다. 센서 카트리지에 수분을 공급하려면 약 20밀리리터의 교정제를 원뿔형 튜브에 넣습니다. 교정제가 들어있는 원뿔형 튜브를 이산화탄소가 아닌 섭씨 37도 인큐베이터에 밤새 놓습니다.분석 키트의 내용물을 꺼내십시오. 센서 카트리지를 유틸리티 플레이트 옆에 거꾸로 놓습니다. 200 마이크로리터의 멸균 이중 증류수를 다채널 P300 피펫을 이용하여 유틸리티 플레이트의 각 웰에 피펫한다.센서 카트리지를 유틸리티 플레이트 위에 놓습니다. 각 웰의 수위가 센서 프로브를 잠글 수 있을 만큼 충분히 높은지 확인합니다. 조립된 센서 카트리지를 이산화탄소가 아닌 섭씨 37도 인큐베이터로 옮기고 밤새 그대로 둡니다.스페로이드 분석 마이크로플레이트를 코팅하기 위해, 패혈성 기술을 사용하여 스페로이드 마이크로플레이트의 웰 당 밀리리터 당 30 마이크로리터의 멸균 0.1 밀리그램의 폴리-D-라이신 용액을 첨가한다. 스페로이드 마이크로플레이트의 각 웰에서 용액을 흡인하고, 플레이트를 반전시킨 다음, 티슈 페이퍼 위에 단단히 두드려 잔류 용액을 제거합니다. 플레이트의 각 웰을 200 마이크로 리터의 멸균 이중 증류수로 씻으십시오.최종 세척 후, 마이크로플레이트를 뒤집어 티슈 페이퍼 위에 단단히 두드려 잔류 물을 제거한다. 플레이트를 나중에 사용하기 전에 30 분 동안 공기 건조시킵니다. 원고에 기재된 대로 XF RPMI 배지를 준비한다.보충된 XF RPMI 분석 배지를 분석 한 시간 전에 섭씨 37도로 예열합니다. 코팅된 스페로이드 분석 마이크로플레이트를 이산화탄소가 아닌 섭씨 37도 인큐베이터에서 예열한다. 교정제와 센서 카트리지가 들어있는 원뿔형 튜브를 공기 인큐베이터에서 꺼냅니다.유틸리티 플레이트에서 센서 카트리지를 분리하고 작업 표면에 거꾸로 놓습니다. P300 다채널 피펫을 사용하여 유틸리티 플레이트에서 물을 흡인하고 버립니다. 200 마이크로리터의 예열 교정제를 유틸리티 플레이트의 각 웰에 첨가하십시오.센서 카트리지를 유틸리티 플레이트에 올려 놓으면 센서가 캘리브란트에 잘 잠겨 있는지 확인합니다. 조립된 센서 카트리지를 포트 주입 용액을 로드할 준비가 될 때까지 비이산화탄소, 섭씨 37도 인큐베이터로 옮깁니다. 인큐베이터에서 스페로이드 배양 플레이트를 꺼내어 현미경으로 구상체를 관찰하여 스페로이드 전달 단계 전에 무결성을 보장합니다.180 마이크로리터의 예온 분석 배지를 임의의 배경 보정 웰을 포함하는 스페로이드 플레이트의 각 웰에 로딩한다. 일곱 센티미터의 페트리 접시를 세 밀리리터의 분석 배지로 부분적으로 채운다. 96 웰 배양 플레이트에서 구상체를 페트리 접시로 옮기고, 넓은 오리피스 피펫 팁이 로딩된 다채널 피펫을 사용하고, 부피를 10 내지 50 마이크로리터로 설정한다.넓은 오리피스 피펫 팁이 장착 된 단일 채널 피펫터의 부피를 20 마이크로 리터로 설정하고 조심스럽게 단일 구상체를 흡인하십시오. 팁을 이 스페로이드 분석 마이크로플레이트의 각 웰의 중앙에 직접 배치하고 모세관 작용이 피펫 팁으로부터 스페로이드를 인출하도록 허용한다. 피펫터의 내용물을 페트리 접시에 다시 피펫팅하여 현미경으로 진화를 확인하십시오.일단 이 모든 구상체가 스페로이드 분석 마이크로플레이트로 옮겨지면, 플레이트를 최소 한 시간 동안 섭씨 37도 비이산화탄소 인큐베이터로 옮긴다. 원고에 기재된 바와 같이 각 화합물의 작업 스톡 농도를 준비하고, 완전히 보충된 예열 XF RPMI 분석 배지를 사용한다. 보정된 P100 다중 채널 피펫을 사용하여 각 화합물의 작업 용액 20 마이크로리터를 모든 해당 포트에 분배했습니다.센서 카트리지를 로드하기 위한 분석기를 준비합니다. 잘 형성된 콤팩트한 구상체를 얻기 위해, 각 세포주는 시딩 밀도 및 배양 기간 동안 개별적으로 최적화되었다. 최적화된 시딩 전략에서, SK-OV-3의 스페로이드 부피는 7마이크로미터 큐베이션으로 약 5.46 x 10이었고, A549의 경우 1.45 x 10 내지 8마이크로미터 큐베이션이었다.모든 스페로이드 유형은 초기 시딩 밀도와 스페로이드 부피 사이의 선형 상관 관계를 가졌다. 완벽한 스페로이드 대칭은 1.0의 원형을 가지며 1.0으로부터의 편차는 원형성의 손실을 나타냈다. 모든 스페로이드 유형에 대해 산소 소모율은 스페로이드 크기에 따라 증가했으며 MCF-7 구상체에서 가장 높고 SK-OV-3 구상체에서 가장 낮은 스페로이드 부피와 선형적으로 상관 관계가 있습니다.MCF-7 구상체는 실험 전반에 걸쳐 비히클 제어에 반응하지 않았다. MCF-7 구상체에서의 산소 소모율은 밀리리터 당 0.5 마이크로그램의 첫 번째 주사 후 5개의 측정 사이클 후에 올리고마이신으로 낮아졌다. BAM15에 반응하여, 산소 소모율은 두 번째 주입 전에 증가하였다.반면 로테논과 안티마이신 A의 조합은 그것을 낮췄다. 기저 미토콘드리아 호흡을 정확하게 조사하기 위한 프로토콜입니다. ADP 인산화 호흡, 누출 호흡, 결합 효율, 최대 호흡 용량 및 예비 호흡 용량은 암 유래 3D 구상체를 사용하여 개발되었습니다.모든 호흡기 화합물은 웰 당 분당 산소의 20 내지 30 피코몰의 평균 꾸준한 기저 호흡률을 드러내는 선택된 화합물에 대한 예상된 동역학적 산소 소모율 프로파일을 산출하였다. 마이크로플레이트 내의 구상체의 위치와 화합물 주입 후 측정주기 번호는 화합물 첨가 사이에 호흡률이 안정한지 확인하기 위함이다. 언커플러와 함께 미토콘드리아 호흡 능력을 탐구 할 때, 집중력이 중요할뿐만 아니라 미토콘드리아 에너지 대사를 조사하는 실험에서 언커플러 전에 일반적으로 첨가되는 올리고 마이신의 존재하에 호흡을 분리 할 수있는 능력도 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

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3D 스페로이드의 세포외 플럭스 분석: 췌장 종양 스페로이드의 대사 활성을 측정하는 방법

여기, 췌장암 세포 및 섬유 아 세포, 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 대사 기능을 측정 하 여 다음의 3 차원 (3D) 회전 타원 체 공동 문화의 준비에 대 한 메서드를 설명 합니다.

준비 및 췌장암 세포 및 섬유 아 세포의 3 차원 회전 타원 체 공동 문화의 변화 분석 결과

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Explanted 망막 조직 세포 외 유출 분석을 사용 하 여 신진 대사 에너지의 측정

이 프로토콜의 목표는 어떻게 다양 한 요인에에서 산소 소비를 변경할 수 있습니다 검사 마우스 신생아 cardiomyocytes 모델 시스템으로 사용 하는 방법을 보여 줍니다.

세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 기본 교양된 마우스 신생아 Cardiomyocytes에 산소 소비 속도 분석

이 작품에서는, 우리는 마이크로 플레이트 기지를 둔 호흡측정과 조합하여 재조합 퍼프렌고리신 O를 사용하여 미토콘드리아 호흡 기질 플럭스를 시험하기 위하여 수정된 프로토콜을 기술합니다. 이 프로토콜을 통해 메트포르민이 두 개의 다른 종양 세포주의 미토콘드리아 호흡에 어떻게 영향을 미치는지 보여줍니다.

재조합 퍼프렌고리신 O-퍼메아빌화 세포에서 미토콘드리아 기질 플럭스 측정

여기에 제시된 방법은 HSPC의 세포외 산성화 속도 (ECAR) 및 산소 소비 속도 (OCR)를 실시간으로 측정하기 위해 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 비 부착성 마우스 조혈 줄기 및 원시 전구 세포 (HSPCs)에서 세포 생물 에너지를 평가하기위한 최적화 된 프로토콜을 요약합니다.

세포외 플럭스 분석기를 사용한 마우스 조혈 줄기 및 원시 전구 세포의 세포 생체 에너지 평가

대사 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 마우스와 인간 호중구 및 HL60 세포의 미토콘드리아 호흡을 측정하는 단계적 프로토콜을 설명합니다.

호중구의 미토콘드리아 생물에너지 프로파일의 실시간 측정

여기에서는 골수, 비장 및 경색된 심장에서 대식세포를 추출하고 이후에 살아있는 세포의 대사 플럭스를 평가하는 방법을 자세히 설명합니다.

비장 및 심장 대식세포와 골수 단핵구의 생체 외 대사 플럭스 분석

여기에서 우리는 세포외 플럭스 분석을 통해 3차원(3D) 신경아교종 스페로이드와 이미징 기반 정규화를 통합하는 대사 프로파일링 플랫폼을 구축합니다. 이 접근법을 통해 약물 치료에 대한 종양 대사 반응을 보다 정확하게 평가할 수 있으며 잠재적인 내성 메커니즘에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

약물 스크리닝을 위한 3차원 뇌종양 스페로이드의 대사 프로파일링의 발전

이 프로토콜은 1차 마우스 미세아교세포에서 대사 재프로그래밍을 정량화하기 위해 해당분해 스트레스 검사를 비용 효율적으로 수행하는 방법을 설명합니다. 분리 및 염증 자극 후, 신선하게 준비된 pH 조정 시약을 사용해 세포외산성화 속도(ECAR)를 측정한 후, 단백질 정규화를 통해 당해질 변화를 정확하고 재현 가능하게 평가합니다.

세포외 플럭스 분석법을 이용한 1차 미세아교세포의 당화 연구

배우세요 3D 암 세포 구상체에서 미토콘드리아 에너지 대사를 탐구하는 방법입니다. Seahorse 세포외 플럭스 분석을 사용하여 단일 구상체 수준에서 정확한 대사 데이터를 수집하고 암 치료 표적을 식별할 수 있습니다.

세포외 플럭스 분석을 이용한 단일 3D 미세조직 구상체의 미토콘드리아 에너지 대사 탐구

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