Name: Langendorff 준비에서 신생아 뮤린 하트의 사용을위한 수정 된 기술 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: 배우세요 신생아 뮤린 하트의 수정된 Langendorff 준비 기술을 통해 심장 발달의 중요한 시기에 생리학적 및 약리학적 반응을 연구하는 방법을. 이 기법은 10일령에서 역행 관류를 신속히 확립하여 심근세포 분리 및 허혈-재관류 연구에 활용됩니다.

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NIH/NINDS R01NS112706 (R.L.)

컬럼비아 대학 의료 센터의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인은 설명 된 모든 방법에 대해 획득되었습니다. 야생형 C57Bl/6 수컷 출생 후 10일째 마우스를 연구에 사용하였다.
1. 랑겐도르프 장치의 제조
<ol><li>복잡성을 최소화하려면 일정한 흐름 또는 일정한 압력을 통해 Langendorff 장치 (재료 표 참조) 내에서 재순환되지 않는 산소화 방향제를 사용하십시오.<ol>
<li>120 mmol/L의 NaCl, 4.7 mmol/L의 KCl, 1.2 mmol/L의 MgSO4, 1.2 mmol/L의KH2PO4, 1.25 mmol/L의 CaCl2, 25 mmol/L의 NaHCO3 및 11 mmol/L의 글루코스를 함유하는 크렙스-헨셀릿 완충액(KHB)을 사용하여 pH 7.4에서 글루코스를 사용하고(표 참조), Langendorff 장치 내에서O2의 95% 및CO2의 5%와 평형화시키고 37°C에서 유지한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>일정한 흐름 접근법의 경우, ~2.5 mL∙min-1에서 연속 유량을 유지한다. 참고: 이 유속은 10일령(P10) 마우스 심장의 평균 체중이 ~30mg 17,18인 것을 감안할 때 ~75-80 mL/g∙min의 관상동맥 흐름에 근사합니다.</li>
</ol>2. 대동맥 캐뉼라의 제조
<ol><li>신생아 마우스 대동맥 캐뉼라를 26G 스테인레스 스틸 바늘로 제작 하십시오 (재료 표 참조). 날카로운 가위를 사용하여 바늘 끝을 잘라 끝을 무디게 만듭니다. 바늘 루멘의 직경을 압착하거나 제한하지 않도록주의하십시오. 절단면을 부드럽게하고 실험실 벤치 탑의 무딘 끝을 부드럽게 긁어 내고 투 - 앤 - 이리 (to-and-fro) 동작을 사용하여 버를 제거하십시오. 참고 : 현미경 버와 날카로운 가장자리는 신생아 마우스 대동맥을 찢어 대동맥 판막을 손상시킬 수 있으므로 제거해야합니다. 또는 미세한 모래 사포를 사용하십시오.</li>
	<li>제작 된 캐뉼라를 Langendorff 장치에 부착하고 흐름과 저항을 평가하십시오. 알려진 기간 동안 버퍼 양을 수집하고 측정하여 캐뉼라를 통한 유속을 측정하십시오. 실제 유량이 설정된 유량 2.5 mL min-1과 동일한지 확인하십시오.</li>
	<li>아래 단계에 따라 KHB가 흐르는 캐뉼라를 가로 지르는 압력 차이를 정량화하십시오.<ol>
<li>제작된 캐뉼라가 부착되어 있거나 부착되지 않은 상태에서 시스템의 압력을 측정합니다.</li>
		<li>캐뉼라를 가로지르는 압력 차이를 유량으로 나누어 옴의 법칙15에 따라 캐뉼라 저항을 얻습니다.</li>
		<li>제작된 캐뉼라 저항이총 저항 6의 ~16.0 ± 1.9 mmHg∙min∙mL-1을 포함하는지 확인하십시오. 과도한 저항은 잠재적으로 손상된 캐뉼라 루멘을 암시합니다. 참고 : 샘플 계산 :캐뉼러가있는 P - 캐뉼라가없는 P = ΔP. P가 = 48이고 P가 = 8이면 ΔP = 40입니다. 2.5 mL min-1의 유속(Q)에서 40개의 캐뉼라 저항의 ΔP는 R =ΔP/Q = 40/2.5 = 16을 사용하여 16 mmHg∙min∙mL-1과 같다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>26G 캐뉼러를 제거하고 고압 튜브 ( 재료 표 참조)를 Langendorff 장치의 캐뉼레이션 부위에 부착하십시오. 대동맥 캐뉼라를 튜브의 원위 끝에 부착하십시오. 튜브와 캐뉼라를 산소가 공급된 완충액으로 공기 배출하여 모든 기포가 제거되도록 합니다. 참고 : 이러한 방식으로 고압 튜브를 사용하면 캐뉼라를보다 먼 위치로 확장 할 수 있습니다. 이것은 설정에 인접한 해부 현미경으로 대동맥 통조림을 허용하는 데 필요합니다 (그림 1).</li>
</ol>3. 장기 수확
<ol><li>항응고 마우스는 헤파린 (10 kU / kg)의 복강 내 (IP) 주사를 통해 ( 물질 표 참조) 1 mL 주사기에 26 G 바늘을 사용하여 관상 동맥 미세 혈전의 형성을 방지합니다. 마취제 주사를 진행하기 전에 헤파린이 순환 할 때까지 몇 분 정도 기다리십시오.</li>
	<li>1 mL 주사기에 26 G 바늘을 사용하여 IP 주사로 동물을 마취하십시오. 참고 : 무호흡증과 후속 저산소증을 피하기 위해 마취 주사 후 동물을주의 깊게 모니터링하는 것이 중요합니다. Pentobarbital (70 mg / kg)은 무호흡19,20을 유도하지 않고 진정의 빠른 발병을 허용하므로 마취제의 신뢰할 수있는 선택입니다. 다른 마취제는 사용된 투여량이 무호흡증(21)을 유발하지 않는 한, 이용될 수 있다. 조사관은 대체 진정제 최면제가 심장 기능에 미치는 영향22,23을 고려해야합니다. 안락사의 주요 모드로서의 자궁 경부 탈구는 사전 cannulation 저산소증과 허혈을 연장시킬 수 있습니다.</li>
	<li>마우스를 supine 위치에 놓고 의식 상실시 즉시 팔다리를 고정하십시오. 작은 게이지 피하 주사 바늘을 사용하여 각 사지를 고정하십시오. 동물이 발가락 꼬집음에 반응하지 않자마자 수확을 시작하십시오. 동물은 초기 해부 중에 자발적으로 호흡해야합니다.</li>
	<li>동물의 너비를 가로 질러 횡방향 아시푸스 절개를 만들어 직선 해부 가위를 사용하여 복강을 노출시킵니다 ( 재료 표 참조). 참고 : 절차가 생존 수술을 나타내는 경우 멸균 기술은 필요하지 않습니다.<ol>
<li>횡격막을 우월하게 확인하고 앞부분을 완전히 절개하십시오. 흉곽을 두개 방향으로 중간 겨드랑이 선을 따라 양측으로 자릅니다. 조수에게 포셉으로 xiphoid 과정을 파악하고 흉골과 갈비뼈를 두개골로 반사하여 흉부 장기를 노출하도록 요청하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>간 위의 적외선 횡격막 열등한 정맥 카바 (IVC)를 확인하십시오. IVC를 곡선 홍채 가위로 횡단하면서 홍채 포셉으로 근위 세그먼트에서 약간의 전방 및 두개 장력을 유지하십시오 ( 재료 표 참조).<ol>
<li>IVC를 흉강 밖으로 당기면서 구부러진 홍채 가위를 사용하여 척추의 전방 표면을 따라 후방으로 자릅니다. 심장이 동원되면 가위를 앞쪽으로 각도를 맞추고 큰 혈관을 우월하게 절단하여 심장과 폐를 완전히 제거하십시오. 참고 :이 방법은 블록에서 심장과 폐의 신속한 박출을 허용합니다 .
</li>
	</ol>
</li>
	<li>즉시 얼음처럼 차가운 KHB 또는 식염수에 시편을 잠급니다. 심장은 몇 초 안에 박동을 멈춰야합니다.</li>
</ol>4. 통조림
<ol><li>종이 타월 한 장을 자르고 얕은 페트리 접시의 바닥에 놓아 통조림 중에 심장을 안정시키는 마찰을 제공하십시오. 얼음처럼 차가운 KHB를 적셔 심장이 그것에 달라 붙지 않도록하십시오.<ol>
<li>준비된 페트리 접시를 해부 현미경 아래에 놓고 초점을 조정하십시오. 고압 연장 튜브에 부착 된 대동맥 캐뉼라를 해부 현미경 아래에 놓고 허브 주위에 느슨하게 묶인 5-0 실크 봉합사와 함께 놓습니다 ( 재료 표 참조). 참고 : 공기로 채워진 폐가 떠 다니며 적출 된 장기를 움직일 수 있기 때문에 페트리 접시의 체액의 양을 제한하기 위해주의를 기울여야합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>적출 된 흉부 장기를 페트리 접시에 넣으십시오. 현미경으로 흉선의 흰 광택과 두 개의 엽으로 흉선을 확인하고 흉선이 앞쪽에 있고 우월하도록 표본의 방향을정하십시오 24. 이것은 심장의 적절한 방향을 보장 할 것입니다.</li>
	<li>포셉을 사용하여 흉선의 엽을 무뚝뚝하게 분리하여 큰 혈관을 노출시킵니다. 대동맥 아치의 구별되는 분지 특징을 찾아 대동맥을 식별하십시오. 참고 : 어두운 보라색 색조는 종종 우심실과 폐동맥을 구분합니다. 오름차순 대동맥은 주요 폐동맥과 오른쪽 심방 사이에 있습니다.</li>
	<li>미세한 날카로운 가위로 대동맥을 횡단하십시오 ( 재료 표 참조) 쇄골 하부 동맥 이륙에 바로 근접하십시오. 참고 : 대동맥이 대동맥 판막에 너무 가깝게 횡단되면 캐뉼라를 확보 할 수있는 대동맥 조직이 충분하지 않습니다. 대안적으로, 대동맥이 너무 높게 횡단되는 경우, 방향제는 하나 이상의 대동맥 가지(예를 들어 쇄골하 동맥)로부터 누출될 수 있다.</li>
	<li>보석상 스타일의 미세한 곡선 포셉을 사용하여 횡단 된 대동맥을 부드럽게 잡 으십시오 (재료 표 참조). 조심스럽게 26G 무딘 바늘로 대동맥을 캐뉼레이트하여 대동맥 판막이 손상되지 않도록주의하십시오. 캐뉼라 주변의 미세한 곡선 포셉으로 대동맥을 잡아 제자리에 고정하십시오. 대동맥의 조절이 확립되면 허혈성 시간을 제한하기 위해 역행 관류를 시작하십시오. 참고 : 심장은 뛰기 시작해야하며 심근에서 혈액이 배출되고 KHB가 관상 동맥에 침투함에 따라 창백해질 것입니다. 자발적으로 뛰지 못하거나, 심실 약혼의 존재 또는 심장의 색 변화가 부족하면 잘못 배치 된 캐뉼라를 나타냅니다.</li>
	<li>조수에게 느슨하게 묶인 봉합사의 끝을 잡고 캐뉼라 주위의 대동맥을 조심스럽게 감싸도록 요청하십시오. 대동맥 조직의 양과 해부학 적 고려 사항에 따라 곡선 미세 포셉 위 또는 아래에 봉합사를 꼬집습니다 (캐뉼라를 제자리에 고정). 봉합사를 조이고 관상 동맥 흐름의 적절성을 확인하십시오.</li>
	<li>Langendorff 장치에서 고압 튜브를 분리합니다. 캐뉼라의 허브를 잡고 고압 연장 튜브에서 무딘 바늘을 분리하십시오. 캐뉼라의 허브를 장치에 빠르게 부착하십시오. 참고 : 심장을 떼어 내거나 캐뉼라에 공기를 불어 넣지 않도록주의해야합니다.</li>
	<li>심장이 일반적인 위치에서 Langendorff 장치에 매달려 적절한 관류가 확인되면 폐, 흉선 및 과도한 조직을 조심스럽게 다듬으십시오. 관상 동맥 부비동 유출물이 자유롭게 물방울을 떨어 뜨릴 수 있도록 올바른 아트리움을 절개하십시오.</li>
</ol>5. 기능 측정
<ol><li>5-0 실크 봉합사 (구부러진 바늘에 부착)의 끝에 작은 매듭을 만드십시오. 바늘로 파라핀 필름 (2-3 mm x 2-3 mm)의 작은 조각을 관통하고 파라핀을 매듭 된 끝으로 밀어 넣습니다. 조심스럽게 바늘을 심실의 정점을 통과시키고 파라핀 필름이 심실의 측벽에 맞을 때까지 심장을 통해 봉합사를 당깁니다. 참고 : 파라핀 필름은 매듭이 심장을 찢고 심실을 통과하는 것을 방지하는 데 도움이됩니다.</li>
	<li>Langendorff 장치의 물이 채워진 온난 한 재킷의 개구부를 통해 바늘을 통과시킵니다. 이제 심장을 감싸고 따뜻하게 할 수 있습니다.</li>
	<li>관상 동맥 부비동 물방울을 피하는 방식으로 힘 변환기 ( 재료 표 참조)에 바늘을 부착하십시오. 봉합사를 조정하여 이완기 장력 또는 긴장 추적의 nadir로 표시된 바와 같이 1-2g의 기저 장력을 적용하십시오. 참고 : 캐뉼라에서 심장을 당기거나 대동맥을 비틀어서 관상 동맥 관류를 손상시키지 마십시오.</li>
	<li>심전도를 기록하기 위해 심장의 우수하고 열등한 극에 표면 전극을 놓습니다. 참고: Bio Amp에 연결된 유연한 표면 전극을 위해 바늘을 제거한 소아 임시 심막 페이싱 와이어를 사용하십시오( 재료 표 참조).</li>
	<li>분석을 위해 관상동맥 부비동 유출물을 24 G IV 카테터를 사용하여 샘플링 한다(표 참조).</li>
	<li>키르히호프의 법칙25에 따라 관상동맥 저항을 얻기 위해 전체 시스템 저항에서 캐뉼라 저항을 뺍니다.</li>
</ol>

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본 연구는 고립 된 신생아 마우스 심장에서 성공적인 대동맥 통조림과 역행 관류를 설명합니다. 중요한 것은 연구자들이 젊은 뮤린 나이와 작은 심장 크기가 이전에 제시 한 장벽을 극복 할 수있게 해줍니다8. 설계가 복잡하지는 않지만 상당한 수준의 기술 기술이 필요합니다. 가장 기술적으로 능숙한 조사관조차도 필연적으로 도전 할 핵심 단계는 대동맥을 캐뉼레이션하고 캐뉼라를 제자리에 고정시키는 것입니다. 신생아 통조림의 어려움은 대동맥 내강의 작은 크기 때문만은 아닙니다. 오름차순 대동맥의 비교적 짧은 길이 (대동맥 판막과 오른쪽 쇄골 하부 이륙 사이의 대동맥 조직)는 조사관이 대동맥 캐뉼라를 정확하게 제어하도록 도전 할 수 있으며 팀원 간의 신중한 조정이 필요합니다. 이 지역 내에서 캐뉼라를 적절하게 배치하고 확보하지 못하면 준비를 망칠 수 있습니다. 예를 들어, 캐뉼라를 너무 깊게 진행하면 대동맥 판막이 손상되거나 심실 내 캐뉼레이션이 발생할 수 있습니다. 대동맥 아치 내에 캐뉼라를 너무 얕...

생체 외 심장 제제는 한 세기 이상 생리, 병리 생리학 및 약리학 연구의 필수품이었습니다. 1860년대 엘리아스 시온(Elias Cion)의 연구에서 비롯된 오스카 랑겐도르프(Oskar Langendorff)는 역행 관류를 위해 분리된 개구리 모델을 채택하여 대동맥 뿌리에 압력을 가하여 산소화된 향수1로 관상동맥 흐름을 제공했다. 그의 적응을 사용하여, Langendorff는 관상 동맥 순환과 기계적 기능 사이의 상관 관계를 입증 할 수있었습니다2. 나중에 Langendorff 기법이라고 불리는 생체 외 역행 관류 된 심장은 생리 학적 조사의 초석으로 남아 있으며, 잠재적 인 혼란이없는 상태에서 고립 된 심장을 강력하게 연구하기 위해 단순성을 활용했습니다. Langendorff 준비는 심장이 배출 될 수 있도록 (소위 "일하는 심장"이라고 함)을 허용하고 향수가 재순환 할 수 있도록 추가로 수정되었습니다3. 그러나 관심의 주요 생리 학적 종점은 변하지 않았습니다. 이러한 종점에는 수축 기능, 전기 전도, 심장 대사 및 관상 동맥 저항의 측정이 포함됩니다 4.
원래 개구리 심장 준비에서 심장 기능을 평가하기 위해 Langendorff는 심장의 정점과 힘 변환기 사이에 연결된 봉합사를 사용하여 종축에서 심실 수축에 의해 생성 된 긴장을 측정했습니다. 5 등각 수축은 심실 충전이 없을 때 심장에 가해지는 기저 긴장으로 이러한 방식으로 정량화되었습니다. 접근법의 개선은 등공 수축 동안 심근 성능을 평가하기 위해 좌심방을 통해 좌심실에 유체로 채워진 풍선을 배치하게했다6. 심장 리듬과 심박수를 평가하기 위해 표면 리드를 심장의 극에 배치하여 조사관이 심전도를 기록 할 수 있도록합니다. 그러나 의무적 인 거부를 감안할 때 상대적 서맥을 기대할 수 있습니다. 외인성 페이싱은 이를 극복하고 실험1 사이의 심박수 변동성을 제거하는 역할을 할 수 있다. 또 다른 결과 측정, 심근 대사는 관상 동맥 향수 및 유출물의 산소 및 대사 기질 함량을 측정하고 그 차이를 계산하여 평가할 수 있습니다7. 관상 동맥 유출물에서의 젖산 정량화는 저산소증, 저관류, 허혈 재관류 또는 대사 교란으로 보이는 바와 같이 혐기성 대사 기간을 특성화하는 데 도움이 될 수 있습니다7.
Langendorff의 독창적 인 연구는 고양이를 주요 주제로 사용하여 생체 외 포유류 심장에 대한 연구를 가능하게했습니다5. 고립 된 쥐 심장에 대한 평가는 1900 년대 중반에 하워드 모건 (Howard Morgan)과 함께 인기를 얻었으며, 하워드 모건 (Howard Morgan)은 1967년 5 년에 '일하는 마음'쥐 모델을 자세히 설명했습니다. 마우스의 사용은 기술적 복잡성, 조직 취약성 및 상대적으로 작은 뮤린 심장 크기 때문에 25 년 전에 시작되었습니다. 마우스 연구와 관련된 도전에도 불구하고, 유전자 조작의 더 낮은 비용 및 용이성은 이러한 뮤린 생체외 제제의 호소 및 수요를 증가시켰다. 불행히도이 기술의 적용은 성인 동물로 제한되었으며, 4 주령의 어린 마우스는 아주 최근까지 생체 외 연구에 활용 된 가장 어린 피험자였습니다 8,9. 청소년 생쥐는 성인에 비해 "상대적으로 미성숙"하지만, 발달 생물학 연구의 대상으로서의 유용성은 출생 댐에서 젖을 떼고 곧 사춘기10을 시작할 것이기 때문에 제한적입니다. 청소년기는 포도당과 젖산에서 지방산11로 심근 기질 이용에서 출생 후 전이를 훨씬 넘어서 발생합니다. 따라서, 신생아 심장의 대사 변화에 대한 대부분의 정보는 역사적으로 토끼 및 기니피그(11)와 같은 더 큰 종에서의 생체외 작용으로부터 기인한다.
실제로 Langendorff 준비에 대한 대안적인 접근법이 존재합니다. 여기에는 전체 장기 기능 데이터 및 문맥이 결여된 시험관내 실험 또는 생체내 연구가 포함된다. 이것은 필수 마취제의 심혈관 및 호흡 효과, 신경 체액성 입력의 영향, 핵심 온도의 결과, 동물의 영양 상태 및 기질 가용성12,13과 같은 혼란스러운 변수로 인해 기술적으로 도전적이고 복잡 할 수 있습니다. Langendorff 접근법은 그러한 혼란스러움이없는 경우보다 통제 된 방식으로 생체 외 방식으로 격리 된 관류 된 심장에 대한 연구를 허용하기 때문에 강력한 조사 도구로 간주되어 왔으며 앞으로도 계속되고 있습니다. 따라서 여기에 제시된 기술은 연구자들에게 신생아 뮤린 심장의 생체 외 연구를위한 실험적 접근법을 제공하고 재관류 시간을 제한합니다.
발달 기간 동안 심장을 조사하는 것은 심근 성숙 중에 발생하는 광범위한 생화학적, 생리적 및 해부학 적 전이를 고려할 때 중요한 고려 사항입니다. 혐기성 대사에서 산화적 인산화로의 이동, 기질 이용의 변화, 세포 증식에서 비대로의 진행은 미성숙 심장에서 유일하게 발생하는 역동적인 과정이다(11,14). 발달하는 심장의 또 다른 중요한 측면은 필요한 기간 동안 직면 한 스트레스 요인이 신생아 심장에서 더 높은 반응을 일으키고 성인기의 모욕에 대한 미래의 감수성을 변화시킬 수 있다는 것입니다15. 이전 연구는 Langendorff가 관류 된 신생아 심장을 연구하기 위해 신생아 쥐, 양 및 토끼를 활용했지만,이 종의 발달 생물학 연구16의 중요성을 감안할 때 생쥐 사용을 허용하는 진보가 필요합니다. 이러한 요구를 해결하기 위해, 10 일 된 동물을 사용하는 최초의 뮤린 Langendorff-perfused 신생아 심장 모델이 최근에 확립되었습니다6. 여기에 제시된 것은 성공적인 대동맥 절개술을 가능하게하고 고립 된 신생아 뮤린 심장의 역행 관류를 확립하는 방법입니다. 이러한 접근법은 약리학, 허혈-재관류, 또는 전체 기관 기능에 초점을 맞춘 대사 연구에 활용될 수 있거나, 심근세포의 단리를 위해 적응될 수 있다.

<table><tbody><tr><td>설치류 Langendorff 장치</td><td>Radnoti</td><td>130102EZ</td><td></td></tr><tr><td>24G 카테터</td><td>BD</td><td>381511</td><td></td></tr><tr><td>26G 바늘 1mL 주사기 콤보</td><td>BD</td><td>309597</td><td></td></tr><tr><td>26G 강철 바늘</td><td>BD</td><td>305111</td><td></td></tr><tr><td>5-0 실크 봉합</td>사 <td>Ethicon</td><td>S1173</td><td></td></tr><tr><td>바이오 앰프</td><td>ADInstruments</td><td>FE135</td><td></td></tr><tr><td>바이오 케이블</td><td>ADInstruments</td><td>MLA1515</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901-100G</td><td></td></tr><tr><td>순환 온수 목욕</td><td>Haake</td><td>DC10</td><td></td></tr><tr><td>곡선 홍채 가위</td><td>Medline</td><td>MDS10033Z</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Nikon</td><td>SMZ-2B</td><td></td></tr><tr><td>찾기 스프링 가위</td><td>Kent</td><td></td><td></td>INS600127</tr><tr><td>Force Transducer</td><td>ADIntruments</td><td>MLT1030/D</td><td></td></tr><tr><td>포도</td>당 <td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-100G</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sagent</td><td>400-01</td><td></td></tr><tr><td>고압 튜빙</td><td>Edwards Lifesciences</td><td>50P184</td><td></td></tr><tr><td>아이리스 드레싱 집게</td><td>Kent</td><td>INS650915-4</td><td></td></tr><tr><td>Jeweler 스타일 곡선 미세 집게</td><td>Miltex</td><td>17-307-MLTX</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>시그마-알드리치</td><td>P3911-25G</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662-25G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-25G</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014-25G</td><td></td></tr><tr><td>롤러 펌프</td><td>Gilson</td><td>Minipuls 3</td><td></td></tr><tr><td>스트레이트 해부 가위</td><td>Kent</td><td>INS600393-G</td><td></td></tr><tr><td>임시 심장 페이싱 와이어</td><td>Ethicon</td><td>TPW30</td><td></td></tr><tr><td>와이드 레인지 포스 트랜스듀서</td><td>ADInstruments</td><td>MLT1030/A</td><td></td></tr></tbody></table>

langendorff 준비에서 신생아 뮤린 하트의 사용을위한 수정 된 기술

Modified Technique for the Use of Neonatal Murine Hearts in the Langendorff Preparation

생체외 역행 관류 심장의 사용은 한 세기 전에 오스카 랑겐도르프에 의해 개발 된 이래로 허혈 재관류 조사의 초석이었습니다. 이 기술은 지난 25 년 동안 마우스에 적용되었지만,이 종에서의 사용은 성인 동물로 제한되었습니다. 신생아 뮤린 대동맥을 지속적으로 캐뉼레이트하는 성공적인 방법의 개발은 유전자 변형 가능하고 저렴한 종에서 심장 발달의 중요 기간 동안 고립 된 역행 용혈 심장에 대한 체계적인 연구를 가능하게합니다. Langendorff 제제의 수정은 허혈성 시간을 최소화하면서 신생아 뮤린 심장에서 재관류의 정식 및 확립을 가능하게합니다. 최적화를 위해서는 해부 현미경 및 변형된 상업적으로 이용가능한 바늘을 사용하여 신생아 마우스 대동맥의 성공적인 캐뉼레이션을 허용하기 위해 두 사람 기술이 필요합니다. 이 접근법의 사용은 3 분 이내에 역행 관류를 안정적으로 확립 할 것입니다. 신생아 마우스 심장의 취약성과 심실 공동 크기는 풍선을 사용하여 발생하는 심실 내 압력의 직접적인 측정을 방해하기 때문에 봉합사에 의해 좌심실의 정점에 연결된 힘 변환기를 사용하여 종방향 수축 장력을 정량화해야합니다. 이 방법을 통해 조사관은 격리 된 정수 흐름 역행 - 관류 된 신생아 뮤린 심장 준비를 성공적으로 확립하여 생체 외 방식으로 발달 심장 생물학을 연구 할 수 있습니다. 중요하게도, 이 모델은 신생아 심장에서 허혈-재관류에 대한 생리학적 및 약리학적 반응을 조사하는 강력한 도구가 될 것이다.

P10 마우스는 인간 유아기26,27에서 시점을 모델링하기 위해 사용되었다. 15개의 분리된 C57Bl/6 신생아 마우스 하트를 수확하고 성공적으로 캐뉼레이션하였다. 심장은 가온된 산소화된 KHB의 2.5 mL min-1의 연속 흐름으로 관류되었다. 글루코스 추출, 산소 소비, 젖산 생산, 심박수, 관류 압력 및 관상 동맥 저항성과 같은 생리학적 파라미터를 포함하는 대사 파라미터를 측정하였다. 표면 전극을 사용하여 연속 심전도를 기록하여 고유 속도와 리듬을 결정할 수있었습니다 (그림 2). 종축에서의 수축력은 Langendorff 28에 의해 기술된 방법을 사용하여 결정되었다.
대사 평가는 관류의 적절성을 평가하기 위해 수행되었다. 산소 추출 퍼센트는 퍼퓨세이트...

본 프로토콜은 생체외 신생아 뮤린 심장의 대동맥 캐뉼레이션 및 역행 관류를 기술한다. 해부 현미경과 무딘 작은 게이지 바늘을 사용하는 두 사람 전략은 신뢰할 수있는 통조림을 허용합니다. 종방향 수축 장력의 정량화는 좌심실의 정점에 연결된 힘 변환기를 사용하여 달성된다.

Langendorff 준비에서 신생아 뮤린 하트의 사용을위한 수정 된 기술

The use of the ex-vivo retrograde perfused heart has long been a cornerstone of ischemia-reperfusion investigation since its development by Oskar ...

이러한 접근법은 신생아 생체외 마우스 심장의 역행 관류를 삼분 이내에 확실하게 확립한다. 따라서 연구의 가능한 가장 어린 나이를 몇 주에서 출생 후 10 일로 줄입니다. 이 고립 된 역행 관류 모델은 유 전적으로 수정 가능하고 저렴한 종에서 심장 발달의 중요한시기에 신생아 심장을 연구 할 수있게합니다.이 모델은 신생아 심장에서 허혈 - 재관류에 대한 생리 학적 및 약리학 적 반응의 연구에 도움이되지만. 또한 심근세포 분리에도 활용될 수 있다. 신생아 마우스 대동맥 캐뉼라를 제작하려면 날카로운 가위를 사용하여 팁을 자르고 26 게이지 스테인레스 스틸 바늘의 끝을 무릎 꿇고 바늘 루멘의 직경을 크림프하거나 제한하지 않도록주의하십시오.그런 다음 절단면을 부드럽게하여 실험실 벤치 상단의 무딘 끝을 부드럽게 긁어 내고 이리저리 움직여 버를 제거하십시오. 다음으로, 제작된 캐뉼러를 Langendorff 장치에 부착하고 유동 및 저항을 평가합니다. 캐뉼러를 통한 유속을 측정하여 일분 간격으로 버퍼 양을 수집하고 측정합니다.Krebs-Heneseleit 버퍼가 흐르는 동안 캐뉼라를 가로지르는 압력 차이를 정량화하려면 캐뉼라가 부착되거나 부착되지 않은 시스템의 압력을 측정하십시오. 그런 다음 다음 공식을 사용하여 캐뉼라 저항을 계산하십시오. 다음으로, Langendorff 장치로부터 26 게이지 캐뉼러를 제거하고 장치의 캐뉼레이션 부위에 고압 튜브를 부착하십시오.그런 다음 대동맥 캐뉼라를 튜브의 원위 단부에 부착하고 튜브와 캐뉼라를 산소화 버퍼로 공기내어 모든 기포가 제거되도록합니다. 관상 동맥 미세 혈전의 형성을 방지하려면 1 밀리리터 주사기에 26 게이지 바늘을 사용하여 10 일 된 마우스 강아지에게 헤파린을 복강 내 주사하십시오. 마취제 주사를 진행하기 전에 헤파린이 순환 할 때까지 몇 분 정도 기다리십시오.다음으로, 마취 된 마우스를 수핀 위치에 놓고 의식 상실시 즉시 팔다리를 고정하십시오. 동물이 발가락 꼬집음에 반응하지 않는 즉시 수확을 시작하십시오.동물은 초기 해부 중에 자발적으로 호흡합니다. 직선 해부 가위를 사용하여 복강을 노출시키는 동물 너비를 가로 질러 횡방향 아시 포이드 절개를 만듭니다.조수에게 포셉으로 xiphoid 과정을 파악하도록 요청한 다음 흉곽을 두개 방향으로 중간 겨드랑이 선을 따라 양측으로 자르고 흉골과 갈비뼈를 두개골로 반사하여 흉부 장기를 노출시킵니다. 횡격막을 우월하게 확인한 후 앞부분을 완전히 절개하십시오. 간 위의 방사선 실용성 열등한 정맥 카바를 확인하고 곡선 아이리스 가위로 횡단하면서 아이리스 포셉으로 근위 세그먼트의 두개 긴장으로 약간의 내부를 유지하십시오.그런 다음 구부러진 아이리스 가위를 사용하여 척추의 내부 표면을 따라 후방으로 자르고 열등한 정맥 카바를 흉강 밖으로 당깁니다. 심장이 동원되면 가위를 앞쪽으로 각도를 맞추고 큰 혈관을 우월하게 절단하여 심장과 폐를 완전히 제거하십시오. 즉시 얼음처럼 차가운 Krebs-Henseleit 완충액 또는 식염수에 시편을 잠급니다.심장은 몇 초 안에 박동을 멈춰야합니다. 얕은 페트리 접시의 바닥에 종이 타월 한 장을 놓아 마찰을 일으켜 통조림 중에 심장을 안정시킵니다. 종이 타월에 얼음처럼 차가운 크렙스-헨셀릿 버퍼를 적셔 심장이 그것에 달라붙지 않도록 하십시오.준비된 페트리 접시를 해부 현미경 아래에 놓고 초점을 조정하십시오. 이제 해부 현미경 아래에 고압 연장 튜브에 부착 된 대동맥 캐뉼라를 허브 주위에 느슨하게 묶은 5-0 실크 봉합사와 함께 놓습니다. 적출 된 흉부 장기를 페트리 접시에 넣은 후 흰 광택과 두 개의 엽으로 흉선을 확인하고 흉선이 앞쪽에 있고 우월하도록 표본의 방향을 정하십시오.다음으로, 포셉을 사용하여 큰 혈관을 노출시키는 흉선의 엽을 무뚝뚝하게 분리합니다. 그런 다음 대동맥 아치의 구별되는 분기 특징을 찾아 대동맥을 확인하고 미세한 날카로운 가위를 사용하여 쇄골 하부 동맥 이륙에 근접하여 대동맥을 횡단합니다. 이제 보석상 스타일의 미세한 곡선 포셉을 사용하여 횡단 된 대동맥을 부드럽게 잡고 26 게이지 무딘 바늘로 대동맥을 조심스럽게 캐뉼레이트하여 대동맥 밸브가 손상되지 않도록주의하십시오.미세한 곡선 포셉을 사용하여 캐뉼라 주변의 대동맥을 잡고 허혈성 시간을 제한하기 위해 역행 관류를 시작하십시오. 조수에게 느슨하게 묶인 봉합사의 끝을 잡고 캐뉼라 주위의 대동맥을 조심스럽게 감싸도록 요청하십시오. 미세한 곡선 포셉 위 또는 아래에 봉합사를 조인 다음 봉합사를 조이고 관상 동맥 흐름의 적절성을 확인하십시오.Langendorff 장치에서 고압 튜브를 분리하고 캐뉼라의 허브를 잡고 고압 연장 튜브에서 무딘 바늘을 분리하십시오. 그런 다음 캐뉼라의 허브를 장치에 빠르게 부착하십시오. 심장이 일반적인 위치에서 Langendorff 장치에 매달려 있으면 적절한 관류가 확인됩니다.폐, 흉선 및 과도한 조직을 조심스럽게 다듬으십시오. 그런 다음 관상 동맥 부비동 유출물이 자유롭게 물방울을 떨어 뜨릴 수 있도록 오른쪽 아트리움을 절개하십시오. 5-0 실크 봉합사 끝에 작은 매듭을 만든 다음 바늘로 파라핀 필름의 작은 조각을 관통하고 파라핀을 매듭 된 끝으로 밀어 넣습니다.조심스럽게 바늘을 심실의 정점을 통과시키고 파라핀 필름이 심실의 측벽에 맞을 때까지 심장을 통해 봉합사를 당깁니다. Langendorff 장치의 물이 채워진 온난 한 재킷의 개구부를 통해 바늘을 통과시켜 심장을 감싸고 따뜻하게 할 수 있도록하십시오. 그런 다음 관상 동맥 부비동 물방울을 피하면서 힘 변환기에 바늘을 부착하십시오.봉합사를 조정하여 이완기 긴장 또는 나디르 의도 추적에 의해 지시 된대로 하나 내지 두 그램의 기저 장력을 적용하십시오. 그런 다음 심전도를 기록하기 위해 심장의 우수하고 열등한 극에 표면 전극을 놓습니다. 마지막으로, 분석을 위해 관상동맥 부비동 유출물을 24 게이지 정맥내 카테터를 사용하여 샘플링한다.표면 전극은 연속 심전도를 기록하는 데 사용되었으며, 이는 고유 속도와 리듬을 결정할 수있었습니다. 적절하게 관류 된 모든 심장은 부비동 리듬으로 자발적으로 뛰고 있습니다. 이 관류 전략은 무시할 수있는 젖산 생산과 낮은 비율의 산소 추출 및 포도당 소비를 감안할 때 신생아 마우스 심장의 신진 대사 요구를 충족 시켰습니다.평균 탈핵된 고유 심박수 및 평균 관찰된 대동맥 관류 압력과 같은 생리학적 변수 수단도 또한 기록되고 계산되었다. 신생아 준비의 일관성을 보장하기 위해 재관류를 시작하는 데 필요한 시간, 부정맥 지속 시간 및 대동맥 관류 압력과 같은 일부 배제 기준을 고려해야합니다. 관류의 확립 후, 약물 전달, 허혈 - 재관류 손상의 유도, 대사 산물의 변화 또는 심근 세포 분리를위한 효소제의 전달과 같은 개입이 발생할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 문서 potentiometric 염료 (DI - 8 - ANEPPS)를 사용 Langendorff - perfused 쥐 심장의 표면에 광학 이미지 조치 가능성이 운동에 높은 시간적 및 공간적 해상도 기법을 설명합니다.

Langendorff - perfused 랫 하트의 광학 매핑

이 비디오에서는 고립된 쥐 심장의 Langendorff 역행 관류를 수행합니다. 시술 중, 상행 대동맥에 삽입된 캐뉼라를 사용하여 관상 동맥을 통해 관류 용액으로 역행하여 심장의 심장 활동을 유지합니다. 이 모델은 심장의 심장 병리 생리학을 연구하는 데 사용됩니다.

Langendorff 역행성 심장 관류: 고립된 쥐 심장을 관류하는 생체 외 기술

기본 마우스 심근 문화는 근원 섬유 조직과 기능의 조사를 위해 중요한 도구 중 하나입니다. 다음 프로토콜은 신생아 마우스 마음에서 차 심근의 격리와 문화를 설명합니다. 얻어진 심근 배양 이후 역학적, 생화학 및 세포 생물학의 다양한 분석을 위해 사용될 수있다.

분리 및 문화 신생아 마우스 심근

이 프로토콜은 출생 후 1일차 마우스의 좌심실에서 심근경색의 외과적 유도에 의한 재현성이 높은 심장 재생 모델을 설명합니다. 이 방법은 저체온 마취 유도와 좌측 전방 하행 관상 동맥 결찰을 포함합니다.

신생아 쥐의 심근 경색, 심장 재생의 모델

이 연구에서 우리는 재생 연구에 사용되는 소설, 신생아, 쥐의 심장 발판을위한 방법론을 제공합니다.

신생아 심장 공사장 공중 발판 : 회생 연구 소설 행렬

우리는 선행 관류 기술에 의해 고품질의 개별 마우스 심장 세포를 격리하기위한 simple 방법을 개발했습니다. 이 방법은 Langendorff가 없으며 심실 및 심방 심근 세포 또는 심장 섬유아세포 또는 선조와 같은 간질 세포를 분리하는 데 유용합니다.

마우스에서 심근세포 절연을 위한 영양 관류 방법

우리는 신생아 심장 대식세포 분리 및 이식을 위한 프로토콜을 성인 마우스 심혼으로, 심장 수리를 승진시키는 유망한 방법이 될 수 있었습니다.

신생아 마우스 심장 대식세포를 성인 마우스로 이식

이 프로토콜은 성인 마우스에서 심방 및 심실 근세포의 동시 격리를 위한 대동맥 통조림의 깊이를 포함하는 Langendorff 방법의 변형을 설명합니다.

성인 마우스에서 심방 및 심실 근세포의 동시 격리를위한 랑엔도르프 방법의 수정

세포 및 분자 기능 실험을 위한 심장학의 황금 표준은 심근 세포입니다. 이 기사에서는 마우스 심근 세포를 분리하기 위한 비 Langendorff 기술에 대한 적응에 대해 설명합니다.

마우스 심근 세포를 일관되게 분리하는 간단하고 효과적인 방법

여기에 제시된 프로토콜은 체외 관류 시스템을 사용하여 냉간 보존 후 기증자 심장의 우심실 및 좌심실 기능을 안정적으로 정량화하기 위한 프로토콜입니다.

Langendorff 모델에서 생체 외 쥐 뇌실 기능 평가

배우세요 신생아 뮤린 하트의 수정된 Langendorff 준비 기술을 통해 심장 발달의 중요한 시기에 생리학적 및 약리학적 반응을 연구하는 방법을. 이 기법은 10일령에서 역행 관류를 신속히 확립하여 심근세포 분리 및 허혈-재관류 연구에 활용됩니다.

Langendorff 준비에서 신생아 뮤린 하트의 사용을위한 수정 된 기술

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