Name: 토양 샘플에서 엔토모병원성 곰팡이를 분리하는 방법의 비교 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: 학습하세요 곰팡이 분리법을 통해 토양에서 곤충병원성 곰팡이를 분리하는 효율적인 방법을 탐구하세요. Galleria mellonella 미끼를 사용하여 Metarhizium 및 Beauveria 균주를 분리하고 생물농약 개발에 기여하는 생태학적 다양성을 이해하세요.

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이 연구는 브라질의 Coordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Financial code 001, Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) (프로젝트 번호 E-26/010.001993/2015) 및 Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) 브라질에서 자금을 조달했습니다.

본 연구가 브라질 유전 유산에 접근함에 따라이 연구는 AA47CB6 코드로 유전 유산 및 관련 전통 지식 관리 (Sisgen)를위한 국가 시스템에 등록되었습니다.
1. 토양 샘플링
<ol><li>작은 삽을 사용하여 800g의 토양 (입사 보조 식물 뿌리 유무에 관계없이)을 10cm 깊이로 수집하십시오. 실험이 시작될 때까지 실온에서 폴리프로필렌 백에 보관하십시오. 참고 : EPF가 근권 능력을 갖고있다고보고됨에 따라 작은 뿌리도 수집 할 수 있습니다. 샘플의 처리가 빠를수록 곰팡이 포자가 시간이 지남에 따라 덜 생존 할 수 있기 때문에 더 좋습니다. 본 연구에서, 샘플은 수집 후 7일 이내에 분석되었다.</li>
	<li>GPS를 사용하여 위도 및 경도에서 수집된 샘플의 위치를 식별하고 토양의 유형(예: 초원, 토착 열대 우림, 호숫가 또는 농경지)에 따라 수집 지역을 분류합니다.</li>
</ol>2. 엔토모병원성 진균에 대한 분리 방법
<ol><li>CTC 선택적 인공 배지를 사용한 분리.<ol>
<li>CTC 배지 [0.5 g/L의 클로람페니콜, 0.001 g/L의 티아벤다졸, 0.25 g/L의 시클로헥시미드9로 보충된 감자 덱스트로스 한천 플러스 효모 추출물(PDAY)]을 준비하려면, 모든 시약을 개별적으로 칭량하고, 증류수에 혼합하고, 오토클레이브에서 배지를 멸균한다. 생물안전 캐비닛에서, 배지 23mL를 60mm x 15mm 페트리 플레이트에 플레이트로 플레이트한다. 주의: CTC 시약을 칭량하는 동안 사이클로헥시미드와 클로람페니콜이 독성이 있으므로 실험실 코트, 마스크, 장갑 및 고글을 사용하십시오.</li>
		<li>0.35 ± 0.05 g의 각 토양 샘플 (뿌리 유무에 관계없이)을 무게로 측정하여 1.5 mL 마이크로 튜브에 넣으십시오.</li>
		<li>생물 안전 캐비닛에 멸균 0.01 % (vol / vol) 폴리옥시 에틸렌 소르비탄 모노 올레 에이트 수성 현탁액 1 mL를 토양과 와류가 들어있는 마이크로 튜브에 30 초 동안 첨가하십시오.</li>
		<li>50 μL의 상청액을 제거하고 CTC 배지로 페트리 플레이트의 중앙에 피펫팅한다. 현탁액을 멸균된 Drigalski 주걱(직경 6 mm)을 사용하여 배지의 표면에 균질하게 분산시킨다. 참고: 각 토양 샘플에 대해 적어도 세 번의 반복실험을 준비해야 합니다.</li>
		<li>플레이트를 어둠 속에서 기후 챔버 (25± 1°C, 상대 습도 ≥80%)에서 인큐베이션하고, 배양 7, 14, 및 21일 후에 진균 콜로니의 성장을 관찰한다.</li>
		<li>EPF를 찾는 곰팡이 식민지의 대형학 및 미세 형태를 관찰하십시오. 순수한 배양물이 얻어질 때까지 EPF 배양물을 감자 덱스트로스 한천 배지와 0.05% 클로람페니콜(PDAC)로 옮긴다. 참고: EPF 콜로니를 식별하기 위해 3단계에서 아래에 표시된 설명 키를 사용하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>곤충 미끼를 사용한 격리<ol>
<li>표면 소독 된 G. mellonella 및 T. molitor 후기 단계 유충을 사용하십시오. 살균을 위해 유충을 0.5 % 차아 염소산 나트륨에 1 분 동안 담그십시오. 멸균수를 사용하여 애벌레를 두 번 씻으십시오. 참고: 네 번째 단계의 G. 멜로넬라 유충이 본 연구에 사용되었다. T. molitor 애벌레 단계는 표준화되지 않았다.</li>
		<li>플라스틱 냄비를 사용하여 미끼를 조립하십시오. 수집 된 토양 250g을 각 플라스틱 냄비에 넣으십시오 (너비 98mm x 높이 47mm x 길이 142mm). 각 종의 15 마리의 유충 (T. molitor 및 G. mellonella)을 분리하고 플라스틱 냄비 당 5 마리의 애벌레를 퇴적시킵니다. 냄비를 25 ± 1 °C, 상대 습도 ≥ 80 %에 어둠 속에서 보관하십시오. 참고: 냄비 뚜껑에 10개의 작은 구멍(직경 2mm)을 뚫어 환기가 가능합니다. 날카로운 가열 철 장치를 사용하여 구멍을 뚫을 수 있습니다.</li>
		<li>애벌레와 토양의 최대 접촉을 허용하기 위해 격일로 토양을 균질화하십시오. 참고 : 수분은 애벌레의 곰팡이 감염을 지원하는 데 중요합니다. 토양의 수분을 유지하려면 필요할 때마다 토양 표면에 멸균 증류수를 뿌리십시오. 토양 샘플을 물에 담그지 마십시오.</li>
		<li>죽은 곤충을 찾는 냄비를 매일 분석하십시오. 참고 : 곤충이 감염되지 않았는지 확인하기 위해 무척추 동물 병리학 적 징후를 위해 식민지에 남아있는 유충을 매일 관찰하십시오. 대안으로, 멸균 토양을 가진 대조 냄비는 곤충 유충의 건강 상태를 검사하기 위한 연구에 포함될 수 있다.</li>
		<li>죽은 곤충을 제거하고 1 분 동안 0.5 % 차아 염소산 나트륨으로 피상적으로 살균하십시오. 멸균 곤충을 25≥ 1°C에서 7일 동안 습한 챔버(상대 습도 ± 80%)에 두어 엔토모병원성 진균(mycosis)의 외장화를 지지한다.</li>
		<li>진균증에 따라, 곤충 표면에서 conidia를 수확하십시오. 미생물 루프를 사용하여 침엽수를 입체 현미경으로 PDAC 배지 위에 놓습니다. 대안으로, 감염된 전체 유충을 PDAC 배지 상에 놓는다. 배양 플레이트를 25± 1°C 및 상대 습도 80%≥ 기후 챔버에서 인큐베이션한다.</li>
		<li>EPF의 동일성을 확인하기 위해 플레이트 상의 진균 콜로니의 거대 형태학 및 미세형태를 관찰한다. 순수한 진균 콜로니가 얻어질 때까지 PDAC에서 배양을 반복한다. 참고: EPF 콜로니를 식별하기 위해 3단계에서 아래에 표시된 설명 키를 사용하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>3. EPF (Metarhizium spp. 및 Beauveria spp.)의 식별
<ol><li>플레이트 상의 진균 배양물의 거시형태학적 특성(즉, 콜로니의 표면 및 역, 이들의 형상, 가장자리, 성장 속도, 색상, 질감, 확산성 안료, 삼출물, 및 공중 코니디아)을 25±1°C 및 상대 습도 80%에서 14일 후에 분석≥다.</li>
	<li>공중 침엽수를 슬라이드 배양물(microculture technique)16으로 옮겨 25± 1°C 및 상대습도 80%≥에서 3일 동안 락토페놀 블루로 염색하여 미세한 특징(즉, 원추골의 배열, conidiophores, conidia의 모양 및 크기)17,18,19,20을 관찰하였다.</li>
	<li>EPF 동정을 확인하기 위해 광학 현미경을 이용하여 400x에서 현미경 진균 구조를 관찰하였다. 참고: EPF에 대한 형태학적 키는 Bischoff et al., Rehner et al., Seifert et al., 및 Humber17,18,19,20에 의한 보고에 기재되어 있다. 곰팡이 식민지의 매크로 및 미세 형태학은 속 수준에서 필라멘트 균류를 확인하는 데 사용되는 가장 빈번한 기준입니다. EPF의 속에 따라, 이러한 형태학적 특성이 바뀔 것이다. 험버20은 곰팡이 엔토모병원균의 주요 속(genera)에 대한 식별 열쇠를 제시한다. 예를 들어, 메타리지움 spp. 콜로니는 일반적으로 원형, 분말성이며, 녹색의 다양한 색조를 나타내며, 삼출물을 나타낼 수 있습니다. 현미경적으로,이 콜로니는 컴팩트 한 hymenium을 형성하는 광범위하게 분지되고 조밀하게 얽혀있는 conidiophores에 원통형 - 타원형 코니디아 (conidiophores)에 원통형 세포 정점을 가지고 있으며, 평행 사슬에서 원통형으로 타원형 코니디아가 기둥 또는 판상 덩어리를 형성합니다. Beauveria spp. 식민지는 일반적으로 흰색, 분말 또는 면화와 같습니다. 그들은 지그재그 방향으로 정점으로 연장되는 확장 된 기저 부분을 가진 원추형 세포를 나타냅니다. Beauveria conidiophores는 지구 모양의 코니디아의 조밀 한 클러스터를 형성합니다. 분자 분석은 종 수준에서 EPF의 확인에 필요합니다.</li>
	<li>종 수준에서 분류 식별을 위해 분리 물에 대한 분자 분석을 수행하십시오. 본 연구에서 분리된 EPF 균주, 즉 Metarhizium spp. 및 Beauveria spp.의 경우, Bischoff et al.17 및 Rehner et al.18의 보고에 기초하여 분자 분석을 수행한다.</li>
	<li>단리물을 EPF로 확인한 후, 단리물을 진균 배양물 집합체에 침착시킨다. 본 연구에서, 단리물은 리우데자네이루 연방 농촌 대학의 미생물 통제 연구소 (LCM)로부터의 엔토모병원성 진균 배양물 수집물에 침착되었다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 이해 상충이 없습니다.

자연 및 농업 토양 서식지는 EPF22 및 우수한 자연 저수지의 전형적인 환경입니다. 본 연구에서, 곤충 미끼 대 선택적 배지를 사용하는 EPF 분리의 두 가지 방법이 다루어졌다. 격리를위한 첫 번째 단계는 토양 샘플의 수집입니다. 토양 샘플의 적절한 저장 및 확인이 중요합니다. 위도, 경도, 토양 유형 및 생물 군계에 대한 정보는 역학, 모델링 및 지리 공간 과목23,24을 포함하는 연구에 필수적입니다. 수집 후, 이러한 토양 샘플에서 코니디아의 생존력이 결국 감소 할 수 있기 때문에 샘플을 가능한 한 빨리 (바람직하게는 7 일 이내에) 처리하는 것이 좋습니다. CTC를 이용한 EPF 분리의 중요한 단계는 a) 배양 후 1 및 2 주 후에 CTC 플레이트의 조사 (1 주간은 나중 단계에서 다른 진균 콜로니가 EPF 발달을 좁힐 수 있기 때문에 중요합니다), b) 그들의 거시 형태학...

토양은 엔토모병원성 진균(EPF)을 포함한 여러 미생물의 공급원입니다. 이 특정 곰팡이 그룹은 절지 동물 숙주, 특히 곤충을 식민지화하고 종종 죽일 수있는 능력에 의해 인식됩니다1. 분리, 특성화, 독성 균주의 선택 및 등록 후, EPF는 절지 동물 해충 방제를 위해 대량 생산되며, 이는 경제적 관련성2을 지원합니다. 따라서, EPF의 분리는 생물농약의 개발을 위한 첫 번째 단계로 간주된다. Beauveria spp. (Hypocreales : Cordycipitaceae)와 Metarhizium spp. (Hypocreales : Clavicipitaceae)는 절지 동물 해충 방제에 사용되는 가장 일반적인 곰팡이입니다3. EPF는 토양, 눈에 보이는 진균증을 가진 절지 동물, 식민지화 된 식물 및 식물 근권 4,5에서 성공적으로 분리되었습니다.
EPF의 분리는 또한이 특정 그룹의 다양성, 분포 및 생태학을 연구하는 데 유용 할 수 있습니다. 최근 문헌들은 EPF의 사용이 과소평가되고 있으며, 식물 생장을 개선하고4, 토양으로부터 독성 오염물질을 제거하고, 약6에서 사용될 수 있는 능력과 같은 EPF의 몇몇 비전통적 응용을 인용하고 있다. 본 연구는 곤충 미끼를 사용하여 토양에서 EPF를 분리하는 효율과 인공 배양 배지 7,8,9를 비교하는 것을 목표로합니다. EPF 격리의 맥락에서 곤충 미끼로 갤러리아 멜로 넬라 L. (Lepidoptera : Phyralidae)의 사용은 잘 받아 들여졌습니다. 이 유충은 전 세계적으로 과학계에서 숙주 - 병원체 상호 작용10,11을 연구하기위한 실험 모델로 사용됩니다. Tenebrio molitor L. (Coleoptera : Tenebrionidae) 유충은 독성과 관련된 연구 및 EPF의 격리를위한 또 다른 곤충 모델로 간주됩니다.이 곤충은 저렴한 비용으로 실험실에서 희귀하기 쉽기 때문에 7,12.
다양한 PCR 기술을 사용하는 것과 같은 배양-독립적인 방법은 토양13,14를 포함하는 그들의 기질 상의 EPF를 검출하고 정량화하는데 적용될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 이들 진균 콜로니를 적절하게 단리하기 위해, 이들의 기질은 선택적인 인공 배지(9) 상에서 배양되어야 하거나, 샘플에 존재하는 진균은 민감한 곤충(15)을 사용하여 미끼화될 수 있다. 한편, CTC는 클로람페니콜, 티아벤다졸 및 시클로헥시미드로 보충된 효모 추출물이 풍부한 감자 덱스트로스 한천으로 구성된 도딘이 없는 인공 배지입니다. 이 배지는 Fernandes et al.에 의해 개발되었다. 9 토양에서 자연적으로 발생하는 Beauveria spp. 및 Metarhizium spp.의 회수를 극대화합니다. 한편, G. mellonella 및 T. molitor 유충은 또한 토양으로부터 EPF 분리 물을 얻기 위한 미끼로서 성공적으로 사용될 수 있다. 그럼에도 불구하고 Sharma et al.15에 따르면,이 두 미끼 곤충의 병용 사용과 비교를보고하는 연구는 거의 없습니다. 포르투갈 포도원 토양은 Metarhizium robertsii (Metscn)의 상당한 회복을 나타냈다. T를 사용하는 소로킨. G. 멜로넬라 유충과 비교하여 몰리터 유충; 대조적으로, Beauveria bassiana (Bals. -Criv.) Vuill 격리는 G. mellonella 미끼15의 사용과 관련이 있습니다. 따라서, 어떤 EPF 분리 방법(즉, G. mellonella-bait, T. molitor-bait 또는 CTC 배지)을 사용할지에 대한 결정은 연구의 목표 및 실험실 인프라에 따라 고려되어야 한다. 본 연구의 목표는 토양 샘플로부터 EPF를 분리하기 위한 곤충 미끼 대 인공 선택 배지 사용의 효과를 비교하는 것이다.

<table><tbody><tr><td>오토클레이브</td><td>Phoenix Luferco</td><td>9451</td><td></td></tr><tr><td>생물 안전 캐비닛</td><td>Airstream ESCO</td><td>AC2-4E3</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>기후 챔버</td><td>Eletrolab</td><td>EL212/3</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>RBR</td><td>3871</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7698</td><td></td></tr><tr><td>Drigalski 주걱</td><td>Marienfeld</td><td>1800024</td><td></td></tr><tr><td>GPS 앱</td><td>지리적 위치 앱</td><td>2.1.2005</td><td></td></tr><tr><td>락토페놀 블루 솔루션</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>61335</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>Zeiss Axio 스타 플러스</td><td>1169 149</td><td></td></tr><tr><td>현미경 카메라</td><td>Zeiss Axiocam 105 컬러</td><td>426555-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>현미경 softwere</td><td>Zen lite Zeiss 3.0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>Olen</td><td>k5-7105-1</td><td></td></tr><tr><td>Microtube</td><td>브랜드</td><td>Z336769-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>페트리 플레이트</td><td>Kasvi</td><td>K30-6015</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁</td><td>Vatten</td><td>VT-230-200C/VT-230-1000C</td><td></td></tr><tr><td>피펫</td><td>HTL - Labmatepro</td><td>LMP 200 / LMP 1000</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 냄비</td><td>프라페스타 데카르트&아큐트; veis</td><td>8314</td><td></td></tr><tr><td>폴리 프로필렌 백</td><td>Extrusa</td><td>38034273 / 5561</td><td></td></tr><tr><td>감자 포도당 한천</td><td>Kasvi</td><td>K25-1022</td><td></td></tr><tr><td>프리즘 소프트웨어 9.1.2</td><td>그래프 패드</td><td></td><td></td></tr><tr><td>삽</td><td>Tramontina</td><td>77907009</td><td></td></tr><tr><td>Tenebrio mollitor</td><td>Safari</td><td>QP98DLZ36</td><td></td></tr><tr><td>Thiabendazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8904</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Vetec</td><td>60REAVET003662</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Biomixer</td><td>QL-901</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>Kasvi</td><td>K25-1702</td><td></td></tr></tbody></table>

토양 샘플에서 엔토모병원성 곰팡이를 분리하는 방법의 비교

Comparison of Methods for Isolating Entomopathogenic Fungi from Soil Samples

본 연구의 목표는 토양 샘플로부터 엔토모병원성 진균(EPF)을 분리하기 위한 곤충 미끼 대 인공 선택적 배지 사용의 효과를 비교하는 것이다. 토양은 절지 동물 해충을 조절할 수있는 Metarhizium 및 Beauveria 속에 특히 속하는 EPF를 포함한 미생물의 풍부한 서식지입니다. 곰팡이를 기본으로하는 생물학적 제품은 주로 농업 절지 동물 해충 방제를 위해 시장에서 구입할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 높은 고유 생물 다양성에도 불구하고, 단지 몇 가지 균주만이 전 세계적으로 상업적 바이오 제품에 사용된다. 본 연구에서, 524개의 토양 샘플을 클로람페니콜, 티아벤다졸 및 시클로헥시미드(CTC 배지)로 보충된 효모 추출물이 풍부한 감자 덱스트로스 한천에서 배양하였다. 진균 콜로니의 성장은 3주 동안 관찰되었다. 모든 Metarhizium 및 Beauveria EPF는 속 수준에서 형태학적으로 확인되었습니다. 추가적으로, 일부 단리물은 종 수준에서 분자적으로 확인되었다. 이 524 개의 토양 샘플 중 스물 네 개는 곤충 미끼 방법 (갤러리아 멜로 넬라 및 테네브리오 몰리터)을 사용하여 EPF 발생에 대해 조사되었습니다. 총 51개의 EPF 균주(41개의 메타리지움 spp. 및 10개의 보베리아 spp.)를 524개의 토양 샘플로부터 분리하였다. 모든 곰팡이 균주는 농경지 또는 초원에서 분리되었습니다. 비교를 위해 선택된 24개의 샘플 중 91.7%는 갤러리아 미끼를 사용한 EPF에 대해 양성이었고, 62.5%는 테네브리오 미끼를 사용했으며, 41.7%는 CTC를 사용하여 양성이었다. 우리의 결과는 곤충 미끼를 사용하여 토양에서 EPF를 분리하는 것이 CTC 배지를 사용하는 것보다 더 효율적이라는 것을 시사했습니다. EPF의 식별 및 보존 외에도 분리 방법의 비교는 생물 다양성에 대한 지식에 긍정적 인 영향을 미칩니다. EPF 컬렉션의 개선은 과학 발전과 기술 혁신을 지원합니다.

브라질 리우데자네이루 주에서 2015년부터 2018년까지 가축 목초지(165개 샘플), 토착 열대 우림(90개 샘플), 호숫가(42개 샘플), 경작/농경지(227개 샘플)와 같은 총 524개의 토양 샘플이 초원에서 수집되었습니다. EPF에 대해 양성인 샘플의 지리적 좌표에 대한 세부사항은 보충 표 1에 제시되어 있다.
524개의 토양 샘플 중 500개의 샘플은 CTC 배지를 통해서만 분석되었으며, 24개의 샘플은 세 가지 형태의 분리(갤러리아-미끼, 테네브리오-미끼 및 선택적 CTC 배양 배지)를 사용하여 동시에 분석되었기 때문에 이러한 방법의 상대적 효율을 평가할 수 있었습니다. 총 51개의 EPF 균주를 524개의 샘플로부터 분리하였다(메타 리지움 spp. 41개 및 보베리아 spp. 10개). (그림 1). 일부 단리물의 미세형...

엔토모병원성 진균 콜로니는 테네브리오 미끼, 갤러리아 미끼 및 선택적 인공 배지, 즉 클로람페니콜, 티아벤다졸 및 시클로헥시미드(CTC 배지)로 보충된 효모 추출물이 풍부한 감자 덱스트로스 한천을 사용하여 열대 토양 샘플로부터 분리된다.

The goal of the present study is to compare the effectiveness of using insect baits versus artificial selective medium for isolating entomopathogenic ...

엔토모병원성 진균의 분리는 생물농약 개발에 중요하며, 이 특정 집단의 다양성, 분포 및 생태학을 연구하는 데 도움이 될 수 있다. 곤충 미끼를 사용하여 엔토모 병원성 곰팡이를 분리하는 것은 저렴한 비용과 매우 효율적인 방법으로 간주됩니다. 클로람페니콜, 티아벤다졸, 시클로헥시미드, 인공 매체는 도딘을 사용하지 않으며 토양 샘플 공정에서 더 적은 공간을 필요로합니다.중요한 단계에는 다른 곰팡이가 발달중인 곤충 병원성 곰팡이가 좁아지고 곤충 병원성 곰팡이가 생기는 것을 방지하기 위해 한 주와 두 주 후에 CTC 플레이트를 조사한 다음 매크로 형태학 및 마이크로 형태학을 기반으로 엔토모 병원성 곰팡이 식민지를 확인하는 것이 포함됩니다. 작은 삽을 사용하여 800 그램의 토양을 10 센티미터 깊이까지 수집하여 시작하십시오. 실험이 시작될 때까지 실온에서 폴리프로필렌 백에 샘플을 보관하십시오.작은 뿌리는 또한 엔토모병원성 진균이 근권권 능력을 갖는 것으로 알려져 있기 때문에 수집될 수 있다. 클로람페니콜, 티아벤다졸, 시클로헥시미드 또는 CTC 선택적 인공 배지를 사용하여 곰팡이를 분리하려면 뿌리가 있거나없는 토양 샘플의 무게가 0.35 그램입니다. 이 샘플을 1.5 밀리리터 마이크로튜브에 넣으십시오.생물 안전 캐비닛에서 작업하는 동안 토양을 포함하는 마이크로 튜브에 멸균 0.01 부피 퍼센트 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트 수성 현탁액 1 밀리리터를 넣고 튜브를 30 초 동안 와류시킵니다. 완료되면 CTC 배지로 페트리 플레이트의 중앙에 상층액 50 마이크로리터를 피펫팅하고 제거한다. 그런 다음 여섯 밀리미터 직경의 멸균 Drigalski 주걱을 사용하여 현탁액을 배지 표면에 균질하게 분산시킵니다.플레이트를 섭씨 25도, 어둠 속에서 최소 80 %의 상대 습도로 기후 챔버에서 배양하십시오. 7일, 14일, 및 21일의 배양 후에, 진균 콜로니의 성장을 위한 플레이트를 관찰하였다. 표면 소독 된 갤러리아 멜로 넬라 (Galleria mellonella)와 테네브리오 몰리터 말기 유충을 곤충 미끼로 사용하여 곰팡이를 분리합니다.유충을 0.5 % 차아 염소산 나트륨에 담그고 살균하십시오. 그런 다음 멸균 된 물로 애벌레를 두 번 씻으십시오. 수집 된 토양 250 그램이 들어있는 뚜껑에 직경 10 밀리미터의 작은 구멍 10 개가있는 플라스틱 냄비에 미끼를 조립하십시오.격일로 토양을 균질화하여 애벌레와 토양이 최대한 접촉 할 수 있도록하고 매일 냄비를 분석하여 죽은 곤충을 찾습니다. 냄비에서 죽은 곤충을 제거한 후 곤충을 0.5 % 차아 염소산 나트륨으로 1 분 동안 피상적으로 살균하십시오. 진균증을 선호하려면 멸균 된 곤충을 7 일 동안 상대 습도 80 % 및 섭씨 25 도의 습한 챔버에 두십시오.진균증에서 곤충 표면에서 conidia를 수확하고 미생물 학적 루프의 도움으로 0.05 % 클로람페니콜 또는 PDAC 배지를 함유 한 감자 덱스트로스 한천 배지에 코니디아를 입체 현미경으로 놓습니다. 대안으로, 감염된 전체 유충을 PDAC 배지 상에 놓는다. 배양 플레이트를 앞서 설명된 바와 같이 기후 챔버에서 인큐베이션한다.배양 14일 후, 원고에 기재된 바와 같이 플레이트 상에서 진균 배양물의 거시적 형태학적 특성을 분석함으로써 EPF 종을 동정한다. 다음으로 공중 침엽수를 80 % 상대 습도 및 섭씨 25도에서 사흘 동안 슬라이드 배양물로 옮깁니다. 사흘 후 슬라이드를 락토페놀 블루로 염색하여 현미경 특징을 관찰하였다.광학 현미경으로 400 배에서 conidia의 배열, conidiophores, 모양 및 크기와 같은 곰팡이 구조를 관찰하고 EPF 식별을 확인합니다. 이 연구에서, 메타리지움 및 비베리아 종의 51개의 EPF 균주를 524개의 토양 샘플로부터 분리하였다. 대표적인 분석은 메타리지움 종과 비베리아 종의 몇몇 단리물의 미세형태학적 특성을 보여준다.24개의 토양 샘플에서 EPF의 발생은 세 가지 다른 분리 방법을 사용하여 연구되었다. 갤러리아 멜로 넬라 미끼는 격리에서 더 효율적인 것으로 판명되었으며, 테네브리오 몰리터 미끼와 CTC 배지가 그 뒤를 이었다. 동일한 24 개의 토양 샘플은 Beaveria 종의 회복은 보이지 않았지만 Metarhizium 만 나타났습니다.기억해야 할 가장 중요한 것은 공중 침엽수를 슬라이드 코트로 옮겨 현미경 특징을 관찰하고 형태 학적 키를 사용하여 엔토모 병원성 곰팡이 식별을 확인하는 것입니다. 추가의 방법은 도딘과 같은 오염물의 성장을 감소시키기 위해 특정 화학물질과 함께 다른 선택적 인공 매체의 사용을 포함한다. 뛰어난 바이오 방제 특성을 가진 새로운 곰팡이 분리 물을 찾는 것은 절지 동물 해충 방제에서 곰팡이 효과를 높이고 무척추 동물 병리학 분야에서 더 많은 질문을 탐구하는 데 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

곤충 병원성 선충은 곤충의 다양한 기생 토양에 서식하는 회충 있습니다. 각각의 토양 샘플 및 감염된 곤충 사체에서 선충의 복구를 위해 곤충 유혹하고 수정 된 화이트 트랩, 우리는 두 가지 기술을 사용하여 토양 선충의 분리에 사용되는 샘플링 방법을 보여줍니다.

토양 샘플링과 곤충 병원성 선충의 분리 (Steine​​rnematidae, Heterorhabditidae)

여기서는 농업에서 해충 방제를위한 "최적의"곤충 병원성 균류 인 Metarhizium anisopliae 의 분리, 확인, 스크리닝 및 선택을 포함한 효과적인 제균제 개발에 관한 지식 기반 개발과 관련된 여러 단계를보고합니다 .

개발<em&gt; 메타 리지 움 anisopliae</em&gt; Mycoinsecticide로서의 : 분리에서 현장 성능까지

여기서 우리는 토양 샘플에서 entomopathogenic 균류 (EPF)를 분리하고 선택하는 데 사용 된 식사 벌레 (Tenebrio molitor)-미끼 시스템을 기반으로 프로토콜을 제시합니다. 효과적인 코니디아 번호(ECN) 포뮬러는 현장에서 해충 미생물 조절을 위한 생리적 특성에 기초하여 높은 스트레스 내성 EPF를 선택하는 데 사용된다.

토양 샘플에서 내토모 병원성 곰팡이의 격리 및 선택 및 곤충 해충에 대한 곰팡이 독성의 평가

이 프로토콜은 7 일 이내에 대규모 토양 샘플 세트에서 효모와 곰팡이 Aspergillus fumigatus를 배양하는 효과적이고 신속한 방법입니다. 이 방법은 실험에 필요한 다양한 인큐베이션 배지 및 온도를 수용하도록 쉽게 변형 될 수 있습니다.

곰팡이 개체군 구조를 조사하기 위해 토양에서 배양 가능한 효모와 곰팡이를 분리합니다.

여기에서, 우리는 재석회화 물질의 분해에 관여하는 곰팡이 균주를 찾기 위해 토양 생물 다양성을 스크리닝하기위한 프로토콜을 제시합니다. 첫째, 휴믹산 또는 리그노셀룰로오스 상에서 성장할 수 있는 곰팡이 균주가 분리된다. 그들의 활성은 효소 분석과 탄화수소 및 플라스틱과 같은 오염 물질에 대해 테스트됩니다.

석회화 물질의 분해에 관여하는 곰팡이에 대한 토양 생물 다양성으로부터의 분리 및 스크리닝

현재 논문은 식물 관련 내생균의 분리, 분리물의 장기 보존, 형태학적 특성 분석 및 후속 분자 식별 및 균유전체 분석을 위한 전체 DNA 추출을 위한 상세하고 적절한 프로토콜을 제공하는 것을 목표로 합니다.

Mycoheterotrophic 식물에서 내생균 균류를 식별하기 위한 분리, 특성화 및 전체 DNA 추출

여기에서 우리는 숲 나무 천공충에서 곤충병원성 균류를 얻기 위한 프로토콜과 딱정벌레목 모델 곤충을 사용하여 곤충병원성 활성을 평가하는 대체 방법을 제시합니다. 이 방법은 자연 산림에서 나무를 뚫는 곤충 해충으로부터 곤충 병원성 곰팡이 자원을 탐사하는 데 효율적이고 편리합니다.

Isolation, Behavioral Identification, and Pathogenicity Assessment of Entomopathogenic Fungi from a Forest Wood Borer(포레스트 우드 보어의 곤충병원성 곰팡이의 격리, 행동 식별 및 병원성 평가)

칼리에서 패치 클램프 커패시턴스 레코딩을위한 방법

이 동영상은 Arabidopsis 14 일 된 모종의 조직에서 그대로 protoplasts를 분리하는 절차를 보여줍니다. 격리 protoplasts 적어도 96h 위해 그대로 유지하고 대신 한 달 된 성숙한 식물의 모종으로부터 격리되는 감안할 때,이 절차는 그대로 protoplasts가 필요한 assays을 신속.

14 일 된 모종의 조직에서 Protoplasts의 분리 Arabidopsis thaliana</em

플라스크에 세포의 준수 속도에 따라 musculoskeletal 부드러운 조직에서 분리 성인 줄기 세포.

소프트 Musculoskeletal 조직에서 줄기 세포를 분리

학습하세요 곰팡이 분리법을 통해 토양에서 곤충병원성 곰팡이를 분리하는 효율적인 방법을 탐구하세요. Galleria mellonella 미끼를 사용하여 Metarhizium 및 Beauveria 균주를 분리하고 생물농약 개발에 기여하는 생태학적 다양성을 이해하세요.

토양 샘플에서 엔토모병원성 곰팡이를 분리하는 방법의 비교

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