Name: eGFP 태그 단백질을 사용하여 초파리 광수용체 세포에서 막 단백질 밀매를 연구하기 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: 배우세요 Drosophila 복안에서 eGFP 태그 광수용체 단백질의 막 밀매를 비침습적 심층 가상동공 영상과 수침 현미경법으로 연구하는 방법. 이 기술은 유전성 망막 퇴행과 실명의 분자 기전을 이해하는 데 중요한 통찰을 제공합니다.

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우리는 수년에 걸쳐 우리의 학생 연구원에게 감사하고 싶습니다. 특히 Nina Meyer, Sibylle Mayer, Juliane Kaim 및 Laura Jaggy는이 프로토콜에서 대표적인 결과로 활용되었습니다. 여기에 제시된 우리 그룹의 연구는 Deutsche Forschungsgemeinschaft (Hu 839/2-4, Hu 839/7-1)에서 Armin Huber에게 보조금으로 지원되었습니다.

<ol><li>Wang, X., Huang, T., Bu, G., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+protein+trafficking+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration.+9%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of protein trafficking in neurodegeneration.</a> Molecular Neurodegeneration. 9. 9, 31(2014).</li>
<li>Schopf, K., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+protein+trafficking+in+Drosophila+photoreceptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Membrane protein trafficking in Drosophila photoreceptor cells.</a> European Journal of Cell Biology. 96 (5), 391-401 (2017).</li>
<li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+photoreceptor+array+of+the+dipteran+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">The photoreceptor array of the dipteran retina.</a> Trends in Neurosciences. 9, 419-423 (1986).</li>
<li>Wang, T., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototransduction+and+retinal+degeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv+-+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Phototransduction and retinal degeneration in Drosophila.</a> Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 454 (5), 821-847 (2007).</li>
<li>Xiong, B., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodopsin+homeostasis+and+retinal+degeneration%3A+lessons+from+the+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Rhodopsin homeostasis and retinal degeneration: lessons from the fly.</a> Trends in Neurosciences. 36 (11), 652-660 (2013).</li>
<li>Bähner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-regulated+subcellular+translocation+of+Drosophila+TRPL+channels+induces+long-term+adaptation+and+modifies+the+light-induced+current%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Light-regulated subcellular translocation of Drosophila TRPL channels induces long-term adaptation and modifies the light-induced current.</a> Neuron. 34 (1), 83-93 (2002).</li>
<li>Cronin, M. A., Lieu, M. -H., Tsunoda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+stages+of+light-dependent+TRPL-channel+translocation+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Two stages of light-dependent TRPL-channel translocation in Drosophila photoreceptors.</a> Journal of Cell Science. 119, 2935-2944 (2006).</li>
<li>Meyer, N., Joel-Almagor, T., Frechter, S., Minke, B., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+translocation+of+the+eGFP-tagged+TRPL+channel+in+Drosophila+photoreceptors+requires+activation+of+the+phototransduction+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Subcellular translocation of the eGFP-tagged TRPL channel in Drosophila photoreceptors requires activation of the phototransduction cascade.</a> Journal of Cell Science. 119, Pt 12 2592-2603 (2006).</li>
<li>Oberegelsbacher, C., Schneidler, C., Voolstra, O., Cerny, A., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+TRPL+ion+channel+shares+a+Rab-dependent+translocation+pathway+with+rhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Drosophila TRPL ion channel shares a Rab-dependent translocation pathway with rhodopsin.</a> European Journal of Cell Biology. 90 (8), 620-630 (2011).</li>
<li>Wagner, K., Smylla, T. K., Lampe, M., Krieg, J., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+D+and+retromer+promote+recycling+of+TRPL+ion+channel+via+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Phospholipase D and retromer promote recycling of TRPL ion channel via the endoplasmic reticulum.</a> Traffic. , (2021).</li>
<li>Franceschini, N., Kirschfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Les+ph%C3%A9nom%C3%A9nes+de+pseudopupille+dans+l%27oeil+compose+de+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Kybernetik%22%5BJournal%5D)">Les phénoménes de pseudopupille dans l'oeil compose de Drosophila.</a> Kybernetik. 9 (5), 159-182 (1971).</li>
<li>Pichaud, F., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+visualization+approach+for+identifying+mutations+that+affect+differentiation+and+organization+of+the+Drosophila+ommatidia%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A new visualization approach for identifying mutations that affect differentiation and organization of the Drosophila ommatidia.</a> Development. 128 (6), 815-826 (2001).</li>
<li>Smylla, T. K., Wagner, K., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+fluorescent+proteins+for+functional+dissection+of+the+Drosophila+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Application of fluorescent proteins for functional dissection of the Drosophila visual system.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), (2021).</li>
<li>Meyer, N. Mechanisms of the light-dependent translocation of the ion channel TRPL in the photoreceptors of Drosophila melanogaster: Dissertation for obtaining the academic degree Dr. rer. nat. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22University+of+Karlsruhe+%28TH%29%22">University of Karlsruhe (TH)</a>. , Karlsruhe. (2005).</li>
<li>Meyer, N., Oberegelsbacher, C., Dürr, T. D., Schäfer, A., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+eGFP-based+genetic+screen+for+defects+in+light-triggered+subcelluar+translocation+of+the+Drosophila+photoreceptor+channel+TRPL%5BTitle%5D)+AND+%22Fly%22%5BJournal%5D)">An eGFP-based genetic screen for defects in light-triggered subcelluar translocation of the Drosophila photoreceptor channel TRPL.</a> Fly. 2 (1), 36-46 (2008).</li>
<li>Zheng, L., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lola+regulates+cell+fate+by+antagonizing+Notch+induction+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Lola regulates cell fate by antagonizing Notch induction in the Drosophila eye.</a> Mechanisms of Development. 125 (1-2), 18-29 (2008).</li>
<li>Hibbard, K. L., O'Tousa, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+the+cytoplasmic+DEAD+box+helicase+Dbp21E2+in+rhodopsin+maturation+and+photoreceptor+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">A role for the cytoplasmic DEAD box helicase Dbp21E2 in rhodopsin maturation and photoreceptor viability.</a> Journal of Neurogenetics. 26 (2), 177-188 (2012).</li>
<li>Huang, Y., Xie, J., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Fluorescence-based+genetic+screen+to+study+retinal+degeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A Fluorescence-based genetic screen to study retinal degeneration in Drosophila.</a> PloS One. 10 (12), 0144925(2015).</li>
<li>Zhao, H., Wang, J., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+V-ATPase+V1+subunit+A1+is+required+for+rhodopsin+anterograde+trafficking+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">The V-ATPase V1 subunit A1 is required for rhodopsin anterograde trafficking in Drosophila.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1640-1651 (2018).</li>
<li>Xiong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+complex+proteins+are+required+for+rhodopsin+biosynthesis+and+photoreceptor+survival+in+Drosophila+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">ER complex proteins are required for rhodopsin biosynthesis and photoreceptor survival in Drosophila and mice.</a> Cell Death and Differentiation. 27 (2), 646-661 (2020).</li>
<li>Zhao, H., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PE+homeostasis+rebalanced+through+mitochondria-ER+lipid+exchange+prevents+retinal+degeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">PE homeostasis rebalanced through mitochondria-ER lipid exchange prevents retinal degeneration in Drosophila.</a> PLoS Genetics. 16 (10), 1009070(2020).</li>
<li>Cerny, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GTP-+and+phospholipid-binding+protein+TTD14+regulates+trafficking+of+the+TRPL+ion+channel+in+Drosophila+photoreceptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">The GTP- and phospholipid-binding protein TTD14 regulates trafficking of the TRPL ion channel in Drosophila photoreceptor cells.</a> PLoS Genetics. 11 (10), 1005578(2015).</li>
<li>Richter, D. Structural and functional analyses of TRP ion channels in the photoreceptor cells of Drosophila melanogaster: Dissertation for obtaining the academic degree Dr. rer, nat. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22University+of+Karlsruhe+%28TH%29%22">University of Karlsruhe (TH)</a>. , Karlsruhe. (2007).</li>
<li>Gambis, A., Dourlen, P., Steller, H., Mollereau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+in+vivo+imaging+of+photoreceptor+apoptosis+and+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Two-color in vivo imaging of photoreceptor apoptosis and development in Drosophila.</a> Developmental Biology. 351 (1), 128-134 (2011).</li>
<li>Hardie, R. C., Liu, C. -H., Randall, A. S., Sengupta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+tracking+of+phosphoinositides+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">In vivo tracking of phosphoinositides in Drosophila photoreceptors.</a> Journal of Cell Science. 128 (23), 4328-4340 (2015).</li>
<li>Chakrabarti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dPIP5K+dependent+pool+of+phosphatidylinositol+4%2C5+bisphosphate+%28PIP2%29+is+required+for+G-protein+coupled+signal+transduction+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A dPIP5K dependent pool of phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate (PIP2) is required for G-protein coupled signal transduction in Drosophila photoreceptors.</a> PLoS Genetics. 11 (1), 1004948(2015).</li>
</ol>

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형광 단백질의 적용 가능성과 DPP 이미징 및 망막 침지 현미경에 의한 스크리닝의 단순성은 많은 그룹12에 의해 성공적인 것으로 입증되었습니다. 여기에 제시된 것과 유사한 전략은 Rh1::eGFP17,18,19,20,21의 도움으로 로돕신 발현 수준, 항상성, 망막 조직 또는 세포 완전성의 결함을 검출하기 위해 여러 유전자 스크린에서 사용되었습니다. 위에서 설명한 바와 같이, TRPL::eGFP와 같은 융합 단백질을 트랜스로케이팅하는 것은 횡문관으로부터 그리고 횡문근으로의 단백질 트래피킹 과정이 예를 들어, 돌연변이유발 스크린에서 손상되는지를 검출하는데 사용될 수 있다. 한편, TRP::eGFP와...

원형질막으로 단백질을 전달하고 제거함으로써, 뉴런의 막 단백질 밀매는 이온 채널뿐만 아니라 수용체로 원형질막 장비를 제어하고, 결과적으로 신경 기능을 조절합니다. 단백질 밀매의 잘못된 조절 또는 결함은 일반적으로 세포에 해로운 영향을 미치고 신경 세포 변성을 초래합니다. 인간에서, 이것은 알츠하이머 및 파킨슨 병 또는 망막염 색소 침착증 1과 같은 신경 퇴행성 질환을 일으킬 수 있습니다. Drosophila melanogaster의 복합 눈에있는 광수용체는 막 단백질 밀매2를 연구하기위한 생체 내 모델 시스템이되었습니다. 이것은 효과적인 유전자 스크리닝을 허용하는 초파리의 유전 적 다양성 때문 일뿐만 아니라 광흡수 광수용체 막의 모든 필수 구성 요소가 매우 상세하고 효율적인 현미경 기술을 사용하여 플라이 아이에 적용 할 수 있기 때문입니다. 이러한 기술은 이 문서의 초점입니다.
초파리 광수용체 세포에서, 정점 원형질막은 횡문근이라고 불리는 세포의 한쪽을 따라 미세 융모의 조밀하게 포장 된 스택을 형성합니다. 광수용체 세포 R1-6의 횡문근은 특징적인 사다리꼴 패턴으로 배열되어 있으며, 광수용체 세포 R7 및 R8은 이 사다리꼴3의 중앙에 단일 횡문근을 형성한다. 막 단백질 트래피킹은 횡문관에서 이러한 광전달 단백질의 적절한 양을 보장하기 위해 로돕신 및 광활성화된 TRP(transient receptor potential) 및 TRPL(TRP-like) 이온 채널과 같은 횡문막 막 단백질의 조절된 턴오버를 위해 필요하다. 광수용체 막 단백질은 소포체에서 합성되고 골지 장치를 통해 횡문근으로 운반된다. 빛에 의한 로돕신의 활성화 후, 로돕신 분자는 두 번째 광자의 흡수에 의해 불활성화되거나 클라트린 매개 엔도사이토시스에 의해 횡문근으로부터 제거될 수 있다. 엔도사이토시스화된 로돕신은 리소좀에서 분해되거나 횡문근 4,5로 다시 재순환된다. 이온 채널 TRPL은 또한 광전달 캐스케이드의 활성화에 따라 내재화되고 횡문관 (파리가 어둠 속에 보관 될 때 위치하는 곳)과 세포 몸체의 ER 농축 저장 구획 (조명시 몇 시간 이내에 운반되는 곳) 사이의 광 의존적 전좌를 겪습니다.6,7,8,9,10 . 엔도사이토시드된 로돕신과는 달리, 단지 소량의 TRPL만이 엔도리소좀 경로를 통해 분해되고, 대부분은 대신 세포내 저장되고 어두운 적응 시 횡문근으로 다시 재순환된다6. 따라서 TRPL은 원형질막 단백질의 광촉발 밀매를 분석하는데 사용될 수 있다. 초파리 광수용체 세포는 또한 신경 변성을 연구하기 위해 사용된다. 광수용체 세포 변성은 퇴행성 과정5의 결과로 분해되는 횡문근의 구조를 평가함으로써 자주 결정된다.
광수용체 세포에서 TRPL 및 로돕신의 세포내 국재화 또는 광수용체 세포 변성을 연구하기 위해, 분석 속도 및 분해능에 관하여 상이한 두 개의 형광 현미경 방법이 여기에 적용되었다. 유전자 스크리닝에 사용할 수 있지만 제한된 공간 분해능을 가진 매우 빠르고 비 침습적 인 방법은 심부 의사 동공 (DPP)에서 형광을 검출하는 것입니다. DPP는 절지 동물 복합 눈의 광학 현상으로, 1971 년 Franceschini와 Kirschfeld에 의해 기하학적 기원이 자세히 설명되었습니다11. 요컨대, 망막 오버레이 아래의 여러 광학 평면에서 인접한 옴마티디아로부터의 횡문근의 이미지가 관찰 될 수 있습니다. 눈의 곡률의 중심을 통과하는 초점 평면에서,이 중첩 된 투영은 단일 옴마티듐에서 횡문근의 사다리꼴 레이아웃과 유사한 이미지를 형성합니다. 이러한 현상은 형광 단백질의 외인성 발현(예를 들어 TRPL::eGFP8)과 독립적으로 관찰될 수 있으며, 그럼에도 불구하고 DPP를 검출하기 쉽게 만든다(도 1A-A'')12. 두 번째 비침습적 방법은 눈의 이관형 장치를 물로 광학적으로 중화시킨 후 형광으로 태그된 단백질을 영상화하는 데 의존하는 침지 현미경 검사입니다(도 1B-C'')12. 수침 방법을 사용하여, 횡문근 또는 세포체에서 TRPL::eGFP의 상대적인 양은 개별 광수용체 세포에 대해 정량적으로 평가될 수 있다. 더욱이, 비-전좌 형광-태깅된 단백질은 횡문근 완전성을 평가하고 여기에 기술된 바와 같이 정량적 방식으로 잠재적인 변성의 시간 경과를 결정하기 위해 이용될 수 있다.
DPP의 기록은 이러한 방법 중 가장 쉽고 빠르게 수행 할 수 있지만 생성 된 데이터의 공간 해상도는 제한적입니다. 또한 DPP가 부재 할 수있는 데는 여러 가지 이유가 있으며, 이는 DPP 이미징 자체만으로 식별 할 수있는 것은 아닙니다. DPP는 여러 옴마티디아의 합산을 나타내기 때문에 개별 세포에 대한 정보가 손실됩니다. 따라서 저해상도 DPP 이미징은 많은 수의 파리를 선별하는 데 중요한 기능을 수행하지만 일반적으로 침수 현미경을 통해 더 높은 해상도의 기록이 뒤따라야합니다. 물 침지 현미경 사진은 개별 세포, 발달 결함, 눈 형태학, 단백질 잘못 국소화 또는 망막 변성에 대한 해석뿐만 아니라 이러한 효과의 정량화를 허용합니다. 이 프로토콜은 이 두 가지 기술을 자세히 설명합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63375/63375fig01.jpg"> 그림 1: 이 프로토콜에 제시된 초파리 눈의 현미경 검사 변형에 대한 개요. (A-A'') 형광 심부 유사동공 (DPP) 영상화, (B-B'') 형광 횡문근막의 치명적인 물 침지 현미경 검사, 및 (C-C''') 형광 횡문근막의 비치명적인 물방울 현미경의 개략적인 표현 및 예시적인 현미경 사진. 스케일 바 (A''): 100 μm. 스케일 바 (B''-C''): 10 μm. 도면은 참조13에서 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63375/63375fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>15 mL 원심분리기 튜브</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>CO2 마취 플라이 패드</td><td>Flystuff</td><td>59-172</td><td></td></tr><tr><td>냉광 램프(KL 1500 LCD)</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji/ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV 램프, 카메라, 필터 세트 및 소프트웨어가 있는 형광 현미경(AxioImager.Z1m, Axiocam 530 mono, 38 HE, ZEN2 blue edition)</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>형광등 (Lumilux T8, L 30W/840, 4000 K, G13) [1750 Lux, Ee470nm = 298 &micro; W cm-2, Ee590nm = 215 &마이크로; W cm-2] 및 [760 Lux, Ee470nm = 173 &micro; W cm-2, Ee590nm = 147 &마이크로; W cm-2]</td><td>Osram</td><td>4050300518039</td><td></td></tr><tr><td>실험실용 피펫(20-200 &마이크로; L)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Object slide</td><td>Roth</td><td>0656.1</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (94 mm)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>633102</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁 (200 &micro; L</td><td>)Labsolute</td><td>7695844</td><td></td></tr><tr><td>Plasticine (Blu-Tack)</td><td>Bostik</td><td>30811745</td><td></td></tr><tr><td>Stereo microscope (SMZ445)</td><td></td>UV 램프, 카메라, 파일러 세트 및 소프트웨어가 있는 Nikon <td></td><td></td></tr><tr><td>Stereo microscope (MZ16F, MC170 HD, GFP3, LAS 4.12)</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

egfp 태그 단백질을 사용하여 초파리 광수용체 세포에서 막 단백질 밀매를 연구하기

Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins

막 단백질 밀매는 원형질막으로의 수용체 및 이온 채널의 혼입 및 제거를 조절한다. 이 과정은 뉴런의 세포 기능과 세포 완전성에 근본적으로 중요합니다. 초파리 광수용체 세포는 막 단백질 밀매를 연구하기 위한 모델이 되었다. 조명시 광수용체 막으로부터 내재화되고 분해되는 로돕신 외에, 초파리 의 일시적인 수용체 전위 유사 (TRPL) 이온 채널은 횡문근 광수용체 막 (어둠 속에 위치하는 곳)과 광수용체 세포체 (조명시 운반되는) 사이의 광 의존적 전좌를 나타낸다. TRPL의 이러한 세포내 수송은 광수용체 세포에서 eGFP 태깅된 TRPL을 발현시킴으로써 간단하고 비침습적인 방식으로 연구될 수 있다. eGFP 형광은 깊은 의사 동공에서 또는 물 침지 현미경에 의해 관찰 될 수 있습니다. 이러한 방법은 온전한 눈에서 형광의 검출을 허용하므로 TRPL 전좌에 결함 이있는 초파리 돌연변이체에 대한 고처리량 분석 및 유전자 스크리닝에 유용합니다. 여기에서, 파리의 제조, 현미경적 기술, 뿐만 아니라 TRPL의 광-촉발 전좌를 연구하기 위해 사용되는 정량화 방법이 상세히 설명된다. 이들 방법은 다른 초파리 광수용체 단백질, 예를 들어 로돕신에 대한 밀매 연구에도 적용될 수 있다. 또한, eGFP 태깅된 횡문근 단백질을 사용하여, 이들 방법은 광수용체 세포의 변성을 평가하는데 사용될 수 있다.

TRPL::eGFP 융합 단백질을 발현하는 형질전환 초파리 파리는 로돕신 1 프로모터의 제어 하에 생성되었다. 이 파리에서, TRPL::eGFP는 화합물 눈의 광수용체 세포 R1-6에서 발현되고 조명 의존적 국소화를 표시한다. 파리가 어둠 속에 보관되면 TRPL::eGFP가 외부 횡문근에 통합됩니다. 몇 시간 동안 조명을 한 후, TRPL은 세포체로 전좌되어 ER이 풍부한 구획에 저장됩니다. 8,10 TRPL::eGFP가 횡문근에 위치할 때, DPP에서 그 형광을 관찰할 수 있다. 그러나, 횡문근 형광은 TRPL::eGFP의 전좌의 결과로 빛에서 사라진다(도 11A,B). 이것은 TRPL::eGFP의 내재화에 결함이 있는 돌연변이체에 대한 유전자 스크리닝을 수행하는데 사용되어 왔다(도 11...

여기에서, 광수용체 막 단백질의 국소화 및 eGFP 형광을 이용한 초파리 화합물 안구에서의 망막 변성의 평가를 위한 비침습적 방법이 기재되어 있다.

eGFP 태그 단백질을 사용하여 초파리 광수용체 세포에서 막 단백질 밀매를 연구하기

Membrane protein trafficking regulates the incorporation and removal of receptors and ion channels into the plasma membrane. This process is fundamentally ...

이온 채널 TRPL GFP와 같은 GFP 태그 광수용체 단백질은 비침습적 기술을 사용하여 뉴런에서 단백질 수송을 연구 할 수있게합니다. 이 방법은 또한 광수용체 변성을 모니터링하는데 사용될 수 있다. 따라서, 인간의 실명을 초래하는 유전성 질환의 분자 기초는 초파리 눈에서 연구 될 수 있습니다.GFP-태깅된 단백질의 세포 국소화는 깊은 유사동공에서 형광을 관찰하거나 수침 현미경에 의해 평가될 수 있다. 두 방법 모두 시각 단백질의 국소화를 신속하게 결정하고 광수용체 세포의 변성으로 인한 횡문근의 구조적 결함을 관찰 할 수 있습니다. 고품질 이미지를 얻으려면 가장 중요한 측면은 플라이 아이의 방향입니다.이 기술을 수행하는 동안 눈의 주변을 약간 향해 위치한 ommatidia에 초점을 맞추어야합니다. 나는 DPP 이미징의 절차를 시연 할 것이며, 침수 현미경을 사용하는 두 가지 기술은 동료 인 Krystina Wagner 박사와 우리 그룹의 박사 과정 학생 인 Matthias Zeger가 시연 할 것입니다. 깊은 의사 동공 또는 DPP를 시작하려면 일대일에서 삼 일 된 파리를 마취하고, 그 중 하나를 현미경 목표물의 중앙에 배치하여 왼쪽 또는 오른쪽 눈이 목표를 정확하게 방사상으로 향하게합니다.전체 눈에 맞게 배율을 높이고 눈의 중앙 옴마티디아를 가운데에 맞춥니다. 가능한 경우 이중 아이리스 다이어프램을 얕은 설정으로 조정하여 현미경의 피사계 심도를 줄입니다. 그런 다음 최대 강도로 현미경 UV 램프를 켭니다.그 후, 눈에서 발현되는 형광 단백질에 따라 현미경의 형광 필터 세트를 선택하고, 현미경 장착형 카메라를 향한 광 경로를 설정한다. 소프트웨어 내의 라이브 이미징 기능을 사용하여 노출 시간과 이득 값을 높여 눈에서 특정 신호만 감지하는 설정으로 이미지 밝기를 조정합니다. 현미경 초점을 눈에 다시 조정하여 DPP의 중첩 된 이미지를 생성합니다.그런 다음, 형광 DPP의 스냅샷을 찍는다. 치명적인 변형으로 파리를 준비하려면 Plasticine 조각을 물체 슬라이드에 붙이고 다른 조각을 페트리 접시의 중앙에 부착하십시오. 페트리 접시에 얼음처럼 차가운 증류수와 얼음 조각으로 채우십시오.그런 다음, 얼음 마취 플라이 하나를 스테레오 현미경 아래에 올려 놓고 Plasticine-coated object 슬라이드 위에 올려 놓습니다. 파리를 등에 돌리고 흉부의 중심을 통해 곤충 핀을 관통하십시오. Plasticine 코팅 오브젝트 슬라이드에서 핀을 수평으로 고정하고 플라이의 왼쪽 또는 오른쪽 눈의 방향을 위쪽으로 향하게 합니다.그런 다음 페트리 접시에서 Plasticine-free 면이 아래로 향하도록 물체 슬라이드를 조심스럽게 고정하여 플라이 헤드의 회전을 방지합니다. 플라이 눈이 물로 덮여 있는지 확인하십시오. 대안적으로, 치명적이지 않은 변형으로 파리를 제조하기 위해, 얼음 마취된 플라이 헤드를 먼저 200 마이크로리터 피펫 팁으로 옮기고, 조심스럽게 파리를 압축 공기로 팁 쪽으로 밀어 넣는다.그런 다음 메스를 사용하여 머리 바로 앞에있는 피펫 팁을 자르고 핀셋을 사용하여 조심스럽게 파리를 피펫 팁으로 몇 밀리미터 밀어 넣으십시오. 피펫 팁을 다시 차단하고 플라이를 압축 공기로 팁 쪽으로 다시 밀어 피펫 팁에서 플라이의 헤드만 돌출되도록 합니다. Plasticine 조각을 개체 슬라이드에 붙인 후 피펫 팁을 눌러 왼쪽 또는 오른쪽 눈이 위쪽을 향하도록 합니다.눈이 현미경 아래에서 올바르게 향하고 있는지 확인하십시오. 이미지 수집의 경우 침수 목표를 선택합니다. 치명적이지 않은 변형의 경우, 실험실 피펫을 사용하여 물 침수 목표의 아래쪽에 차가운 물의 큰 방울을 부착하십시오.준비된 파리와 함께 물체 슬라이드를 현미경 스테이지에 조심스럽게 놓습니다. 그런 다음 물 표면에 닿거나 파리의 눈이 방울에 닿을 때까지 수동으로 침수 목표를 낮 춥니 다. 그런 다음 조명 경로를 현미경 카메라쪽으로 전환하고 라이브 이미지를 생성합니다.카메라의 초점을 다시 조정하고 눈이 현미경 목표를 방사상으로 향해야한다는 점을 고려하여 눈의 방향을 평가하십시오. 조회 테이블 소프트웨어를 사용하여 과채도를 감지합니다. 색소가 묻지 않은 파리의 경우 가장 밝은 픽셀이 모든 이미지의 채도 한계보다 약간 낮도록 노출 시간을 조정합니다.이미지를 기록하고 원시 파일로 저장하여 녹화의 모든 해당 메타데이터를 보관합니다. 그런 다음 이미지를 tif 형식으로 내보냅니다. 침지 현미경 사진의 횡문근에서 상대적 eGFP 형광을 정량화하려면 분석(Analyze)을 클릭한 다음 측정 설정(Set Measurements)을 클릭하여 ImageJ 설정을 조정하고 평균 회색 값 상자만 선택합니다.파일을 클릭하여 tif 이미지를 가져온 다음 열기를 클릭합니다. 초점이 맞춰진 이미지의 대표 영역을 선택하고 Control을 반복해서 누르고 함께 눌러 200 ~ 300 %로 확대하십시오. 다음으로, 타원형 도구를 선택하고 Shift 키를 누른 상태에서 하나의 형광 횡문턱보다 훨씬 작은 원형 선택을 이미지에서 생성합니다.그런 다음 ImageJ 주 창에서 도구 모음 아래에 표시된 정확한 크기를 찾습니다. 원형 선택 영역 내의 형광 강도를 측정하려면 키보드의 화살표 키를 사용하여 원을 첫 번째 횡문근으로 이동하고 분석(Analyze)을 클릭한 다음 측정(Measure)을 클릭합니다. 측정된 회색 값을 나열하는 결과 창이 나타납니다.횡문근 두 개에서 여섯 개까지 계속 측정하고 배경 신호를 측정하십시오. 색소가 묻지 않은 파리의 경우 해당 세포체 영역을 추가로 측정하십시오. 두 번 더 옴마티디아의 형광을 측정하여 세 번의 기술적 반복실험이 발생합니다.연필 도구를 사용하여 분석된 옴마티디아를 표시하고 문서화를 위해 이 이미지를 저장합니다. 결과 창에서 측정된 회색 값을 선택하여 복사한 다음 추가 계산을 위해 스프레드시트 소프트웨어에 붙여넣습니다. 형광 강도 값을 그 기원에 따라 횡문근, 세포체 및 배경의 범주로 분류하고 각 범주에서 평균 강도를 계산합니다.그런 다음, 색소가 나지 않은 눈의 경우 첫 번째 공식을 사용하고 색소 침착 된 눈의 경우 두 번째 공식을 사용하여 횡문관에 존재하는 eGFP의 상대적 양을 계산하십시오. 대안적으로, 수침 현미경 사진에서 eGFP 형광에 의한 눈 형태를 정량화하기 위해, 초점이 맞춰진 이미지의 대표적인 영역에서 인접한 세 개의 옴마티디아를 선택하십시오. 주변 배경 신호에 대한 eGFP 강도, 가장자리 선명도 및 대비에 따라 선택 항목의 18 개의 횡문근을 개별적으로 평가하십시오.마지막으로, 명확하게 보이는 횡문근을 두 개의 값으로 채점하고, 매주 볼 수있는 횡문근을 하나의 값으로 채점하고, 0의 값을 가진 횡문근이없는 횡문근을 점수화하여 퇴행 지수를 생성합니다. eGFP TRPL 융합 단백질을 발현하는 트랜스제닉 초파리 파리에서, 횡문근 형광은 eGFP TRPL의 전좌로 인해 빛에서 사라진다. 이는 eGFP TRPL의 내재화에 결함이 있는 돌연변이체를 확인하기 위해 유전자 스크린을 수행하는 것을 허용한다.대조군 파리에서, eGFP TRPL은 16시간의 조명 후에 횡문근에서 세포체로 전좌하여, 어두운 적응 상태에 비해 횡문근 형광의 현저한 감소를 초래한다. 두 번째 어두운 인큐베이션은 횡문근 형광을 다시 초기 값으로 올립니다. 그러나, TRPL 전좌 결함 돌연변이체 vps35MH20에서, 형광 패턴은 16시간의 조명 및 24시간 동안 후속적인 어두운 적응 후에 크게 변화하지 않는다.이러한 정량화 방법은 통계적으로 매우 유의한 재활용 결함을 검출할 수 있다. 흰 눈의 파리는 횡문근과 세포 몸체 모두에서 형광 신호를 검출 할 수 있습니다. 대조적으로, 적목 파리에서 형광 신호는 횡문관에서만 검출 할 수 있지만 세포체에서는 검출 할 수 없습니다.망막 변성의 정량화와 관련하여, eGFP TRP 형광은 수주에 걸쳐 평가될 수 있다. 2 주 동안 12 시간 빛, 12 시간의 암흑주기에 보관하면 돌연변이 파리에서는 퇴행 지수가 감소했지만 통제 파리에서는 감소하지 않았습니다. 이 프로토콜에서는 색소 침착 된 눈과 비 색소 눈을 구별해야합니다.색소 침착은 형광 신호에 영향을 미치기 때문에 정량적 침지 현미경은 두 경우 모두에 개별적으로 최적화되었습니다. DPP 이미징 및 침수 현미경은 해상도가 제한된 고처리량 방법입니다. 세포 내 국소화를 조사하려면 조직 절편에 대한 면역 형광 현미경 검사를 권장합니다.퇴행성 표현형의 상세한 분석을 위해, 전자 현미경이 수행될 수 있다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

여기 GFP 태그 glial 세포와 결합하여 라이브 미세 분석을 사용하여 개발 Drosophila의 눈을 glial 세포의 마이 그 레이션을 검사하기 위해 프로토콜을 설명합니다.

Drosophila 아이 Imaginal 디스크에 Glial 세포 이미징 마이 그 레이션 라이브

이 보고서 표면 표현, 운송 경로 및 exogenously 표현, 산도에 민감한 GFP-태그를 뉴런의 플라즈마 막에 단백질의 인신 매매 속도론을 결정하는 라이브 세포 이미징 및 photobleach 기법의 사용을 설명합니다.

교양 뉴런의 막 단백질의 측면 보급과 Exocytosis은 형광 복구 및 형광 손실 Photobleaching를 사용하여 평가

출처: Wagner, K. et al., eGFP 태그가 지정된 단백질을 사용하여 초파리 광수용체 세포의 막 단백질 이동을 연구합니다.J. vis. 특급 (2022). 이 동영상은 eGFP 표지된 TRPL 단백질을 사용하여 초파리 광수용체 세포에서 막 단백질 이동을 시각화하는 방법을 보여줍니다. 이미징을 위한 형질전환 파리의 준비, 광수용체 세포의 형광 이미지 캡처, 횡문막에서 상대적 eGFP 형광을 측정하여 TRPL 트래픽의 정량화에 대해 자세히 설명합니다.

Drosophila Photoreceptor Cells의 막 단백질 이동에 대한 연구

개인의 GFP 태그 단백질 또는 autofluorescent 구조의 라이브 영상을위한...

에 GFP-라벨 단백질의 영상을 라​​이브<em&gt; Drosophila</em&gt; Oocytes

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의 라이브 영상 초파리 번데기 눈

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