Name: TIRF 현미경에 의한 시험관 내에서 가교 및 단일 미세 소 관 의 역학의 동시 시각화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: 배우세요 TIRF 현미경을 이용한 시험관 내 미세소관 재구성 분석법으로 단일 미세소관과 가교 결합체의 역학을 동시에 시각화하고, 미세소관 관련 단백질의 집단 활성을 정량적으로 비교하는 방법을 익히세요.

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이 사업은 NIH (No. 1DP2GM126894-01)의 보조금과 퓨 자선 신탁 및 스미스 가족 재단의 기금으로 R.S.에 지원되었습니다. 저자들은 프로토콜의 개발 및 최적화에 기여한 Shuo Jiang 박사에게 감사드립니다.

<ol><li>Subramanian, R., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+complexity%3A+insights+into+self-organized+assembly+of+microtubule-based+architectures%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Building complexity: insights into self-organized assembly of microtubule-based architectures.</a> Developmental Cell. 23 (5), 874-885 (2012).</li>
<li>Baas, P. W., Rao, A. N., Matamoros, A. J., Leo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+properties+of+neuronal+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Stability properties of neuronal microtubules.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 73 (9), 442-460 (2016).</li>
<li>Bitan, A., Rosenbaum, I., Abdu, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+and+dynamic+microtubules+coordinately+determine+and+maintain+Drosophila+bristle+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stable and dynamic microtubules coordinately determine and maintain Drosophila bristle shape.</a> Development. 139 (11), 1987-1996 (2012).</li>
<li>Foe, V. E., von Dassow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+and+dynamic+microtubules+coordinately+shape+the+myosin+activation+zone+during+cytokinetic+furrow+formation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Stable and dynamic microtubules coordinately shape the myosin activation zone during cytokinetic furrow formation.</a> The Journal of Cell Biology. 183 (3), 457-470 (2008).</li>
<li>Pous, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+specialization+of+stable+and+dynamic+microtubules+in+protein+traffic+in+WIF-B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional specialization of stable and dynamic microtubules in protein traffic in WIF-B cells.</a> The Journal of Cell Biology. 142 (1), 153-165 (1998).</li>
<li>Uehara, R., Goshima, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+central+spindle+assembly+requires+de+novo+microtubule+generation+in+the+interchromosomal+region+during+anaphase%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional central spindle assembly requires de novo microtubule generation in the interchromosomal region during anaphase.</a> The Journal of Cell Biology. 191 (2), 259-267 (2010).</li>
<li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+instability+of+microtubule+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).</li>
<li>Bieling, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+a+microtubule+plus-end+tracking+system+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of a microtubule plus-end tracking system in vitro.</a> Nature. 450 (7172), 1100-1105 (2007).</li>
<li>Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+minimal+midzone+protein+module+controls+formation+and+length+of+antiparallel+microtubule+overlaps%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps.</a> Cell. 142 (3), 420-432 (2010).</li>
<li>Shimamoto, Y., Forth, S., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+pushing+and+braking+forces+generated+by+ensembles+of+Kinesin-5+crosslinking+two+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Measuring pushing and braking forces generated by ensembles of Kinesin-5 crosslinking two microtubules.</a> Developmental Cell. 34 (6), 669-681 (2015).</li>
<li>Mani, N., Jiang, S., Neary, A. E., Wijeratne, S. S., Subramanian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+single+microtubules+and+bundles+by+a+three-protein+module%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of single microtubules and bundles by a three-protein module.</a> Nature Chemical Biology. 17 (9), 964-974 (2021).</li>
<li>Hyman, A. A., Salser, S., Drechsel, D., Unwin, N., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+GTP+hydrolysis+in+microtubule+dynamics%3A+information+from+a+slowly+hydrolyzable+analogue%2C+GMPCPP%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Role of GTP hydrolysis in microtubule dynamics: information from a slowly hydrolyzable analogue, GMPCPP.</a> Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1155-1167 (1992).</li>
<li>Subramanian, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+antiparallel+microtubule+crosslinking+by+PRC1%2C+a+conserved+nonmotor+microtubule+binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Insights into antiparallel microtubule crosslinking by PRC1, a conserved nonmotor microtubule binding protein.</a> Cell. 142 (3), 433-443 (2010).</li>
<li>Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonblinking+and+long-lasting+single-molecule+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).</li>
<li>Wijeratne, S., Subramanian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometry+of+antiparallel+microtubule+bundles+regulates+relative+sliding+and+stalling+by+PRC1+and+Kif4A%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Geometry of antiparallel microtubule bundles regulates relative sliding and stalling by PRC1 and Kif4A.</a> eLife. 7, 32595(2018).</li>
<li>Mani, N., Wijeratne, S. S., Subramanian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micron-scale+geometrical+features+of+microtubules+as+regulators+of+microtubule+organization%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Micron-scale geometrical features of microtubules as regulators of microtubule organization.</a> eLife. 10, 63880(2021).</li>
<li>Freal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback-driven+assembly+of+the+axon+initial+segment%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Feedback-driven assembly of the axon initial segment.</a> Neuron. 104 (2), 305-321 (2019).</li>
<li>Ledbetter, M., Porter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%26%2334%3Bmicrotubule%26%2334%3B+in+plant+cell+fine+structure%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A &#34;microtubule&#34; in plant cell fine structure.</a> The Journal of Cell Biology. 19 (1), 239-250 (1963).</li>
<li>Wijeratne, S. S., Marchan, M. F., Tresback, J. S., Subramanian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy+reveals+distinct+protofilament-scale+structural+dynamics+in+depolymerizing+microtubule+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy reveals distinct protofilament-scale structural dynamics in depolymerizing microtubule arrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 119(2022).</li>
</ol>

저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.

여기에 설명 된 실험은 전통적으로 단일 미세 소관 또는 한 유형의 어레이에서 수행되는 기존의 미세 소관 재구성 분석의 범위와 복잡성을 크게 확장합니다. 현재의 분석은 두 집단, 즉 단일 미세소관 및 가교결합된 다발에 대한 조절 MAP 활성을 동시에 정량화하고 비교하는 방법을 제공한다. 또한,이 분석은 두 가지 유형의 번들을 검사 할 수 있습니다 : 역학이 시작되기 전에 안정적인 씨앗으로 미리 형성된 번들과 두 개의 성장 끝이 서로 만나서 가교 될 때 새로 형성되는 번들. 더욱이, 단백질 농도 및 완충액 조건과 같은 종래의 실험 변수 이외에도, 이들 분석은 다발에서 인접한 필라멘트 사이의 길이 및 각도와 같은 미세소관 어레이의 기하학적 특징의 영향을 평가할 수 있게 하며, 이는 미세소관 역학 및 MAP 활성16의 중요한 결정인자로 부상하고 있다.
다중 미세소관 기반 구조물의 시험...

미세소관은 세포 내 수송 및 소기관 위치에서부터 세포 분열 및 신장에 이르기까지 여러 세포 과정에 필수적인 구조적 스캐폴드를 형성하는 바이오 폴리머입니다. 이러한 다양한 기능을 실행하기 위해 개별 미세 소관은 유사분열 스핀들, 섬모 축삭, 뉴런 번들, 상 간 배열 및 식물 피질 배열과 같은 미크론 크기의 배열로 구성됩니다. 이 구조에서 발견되는 유비쿼터스 건축 모티프는 길이를 따라 가교 된 미세 소관 묶음입니다1. 몇몇 미세소관-기반 구조의 흥미로운 특징은 번들링된 미세소관과 비가교된 단일 미세소관이 가까운 공간적 근접성에서 공존한다는 것이다. 이러한 미세소관 하위집단은 적절한 기능을 위해 필요에 따라 서로 뚜렷하게 다른 중합 역학을 나타낼 수 있습니다2,3,4,5. 예를 들어, 유사분열 스핀들 내에서, 안정한 가교결합된 다발과 동적 단일 미세소관은 세포 중심6에서 미크론 스케일 영역 내에 존재한다. 따라서 공존하는 미세 소관 집단의 동적 특성이 어떻게 지정되는지를 연구하는 것은 미세 소관 기반 구조물의 조립과 기능을 이해하는 데 핵심입니다.
미세소관은 중합과 탈중합의 단계 사이를 순환하는 역동적인 중합체로, 재앙과 구조7로 알려진 사건에서 두 단계 사이를 전환합니다. 세포 미세 소관의 역학은 미세 소관 중합 및 탈중합 속도와 재앙 및 구조 사건의 빈도를 조절하는 무수한 미세 소관 관련 단백질 (MAPs)에 의해 조절됩니다. 세포의 공간적으로 근위 배열에 대한 MAP의 활성을 조사하는 것은 어려운 일이며, 특히 미세 소관 밀도가 높은 영역에서 광 현미경 검사에서 공간 분해능의 한계 때문입니다. 또한, 동일한 세포 영역에 여러 MAP가 존재하면 세포 생물학적 연구의 해석을 방해합니다. TIRF(Total Internal Reflection Fluorescence) 현미경과 함께 수행되는 시험관내 재구성 분석은 MAP의 특정 하위 집합이 근위 세포 미세소관 어레이의 역학을 조절하는 검사 메커니즘의 과제를 회피합니다. 여기서, 시험관내에서 조립된 미세소관의 역학은 조절된 조건하에서 하나 이상의 재조합 MAPs의 존재 하에 검사된다8,9,10. 그러나, 종래의 재구성 분석은 전형적으로 단일 미세소관 또는 한 유형의 어레이에서 수행되어, 공존하는 집단의 시각화를 배제한다.
여기에서, 우리는 동일한 용액 조건 하에서 두 개의 미세소관 집단의 동시 시각화를 가능하게 하는 시험관내 재구성 검정을 제시한다11. 우리는 단일 미세 소관과 유사분열 스핀들 관련 단백질 PRC1에 의해 가교 된 미세 소관 다발에서 여러 MAP의 집단 활동을 동시에 보는 방법을 설명합니다. 단백질 PRC1은 항평행 미세소관 사이의 중첩에서 우선적으로 결합하고, 이들을 가교결합시킨다9. 간략하게, 이 프로토콜은 (i) 스톡 용액 및 시약의 제조, (ii) 현미경 실험용 이미징 챔버를 만드는 데 사용되는 커버슬립의 세척 및 표면 처리, (iii) 실험 중에 중합이 개시되는 안정적인 미세소관 "종자"의 제조, (iv) 미세소관 역학을 시각화하기 위한 TIRF 현미경 설정의 사양, (v) 미세소관 종자의 고정화 및 가교된 미세소관 번들의 생성 이미징 챔버에서, 및 (vi) TIRF 현미경을 통해 이미징 챔버 내의 미세소관 역학의 시각화는, 가용성 튜불린, MAPs, 및 뉴클레오티드의 첨가시. 이러한 분석은 MAP 국소화의 정성적 평가 및 정량적 검사와 두 개의 미세 소관 집단의 역학에 미치는 영향을 가능하게합니다. 또한, 그들은 광범위한 실험 조건에 걸쳐 이러한 미세 소관 집단에 대한 여러 MAP의 상승 효과의 평가를 용이하게합니다.

<table><tbody><tr><td>(&플러스mn;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>238813</td><td></td></tr><tr><td>1,4-piperazinediethanesulfonic acid (PIPES)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>18x18 mm #1.5 coverslips&nbsp;</td><td>전자 현미경 과학</td><td>63787</td><td></td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올 (BME)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M-6250</td><td></td></tr><tr><td>24x60 mm #1.5 커버슬립</td><td>전자 현미경 과학</td><td>63793</td><td></td></tr><tr><td>405/488/560/647 nm 레이저 쿼드 밴드&nbsp;</td><td>Chroma</td><td>TRF89901-NK</td><td></td></tr><tr><td>아세톤</td><td>시그마 Aldrich</td><td>320110</td><td></td></tr><tr><td>아데노신 5'-트리포스페이트 디소듐 염 수화물 (ATP)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7699-5G</td><td></td></tr><tr><td>Avidin, NeutrAvidin&reg; 비오틴 결합 단백질(Molecular Probes;)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>A2666</td><td></td></tr><tr><td>목욕 초음파 처리기: Branson 2800 클리너</td><td>Branson</td><td>CPX2800H</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter 폴리카보네이트 두꺼운 벽 튜브, 11 x 34 mm</td><td>Beckman-Coulter&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>343778 Beckman Coulter 폴리카보네이트 두꺼운 벽 튜브, 8 x 34 mm</td><td>Beckman-Coulter&nbsp;</td><td></td><td></td>343776</tr><tr><td>비오틴-PEG-SVA, MW 5,000</td><td>Laysan Bio</td><td>#Biotin-PEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>2905</td><td></td></tr><tr><td>카탈라아제</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>Corning LSE 미니 마이크로 원심분리기, AC100-240V</td><td>Corning</td><td>6670</td><td></td></tr><tr><td>섬세한 작업용 물티슈</td><td>Kimtech</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>디티오트레이톨 (DTT)</td><td>GoldBio</td><td>DTT10</td><td></td></tr><tr><td>방출 필터</td><td>Chroma</td><td>ET610/75m</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 (200-proof)</td><td>Decon Labs</td><td>2705</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌 글리콜 테트라아세트산 (EGTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3777</td><td></td></tr><tr><td>글루코스 산화효소</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G2133</td><td></td></tr><tr><td>GMPCPP</td><td>Jena Bioscience&nbsp;</td><td>NU-405</td><td></td></tr><tr><td>구아노신 5'-트리포스페이트 나트륨 소금 수화물 (GTP)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>Hellmanex III 세제&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z805939</td><td></td></tr><tr><td>이멀젼 오일, Type A</td><td>Fisher Scientific</td><td>77010</td><td></td></tr><tr><td>카파-카제인</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0406</td><td></td></tr><tr><td>Lanolin</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25376</td><td></td></tr><tr><td>렌즈 세척 조직</td><td>ThorLabs</td><td>MC-5</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘(MgCl2)Sigma</td> <td>Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>메틸셀룰로오스</td><td>시그마 알드리치</td><td>M0512</td><td></td></tr><tr><td>마이크로퓨지 16 벤치탑 원심분리기</td><td>Beckman-Coulter&nbsp;</td><td>A46474</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드, 다이아몬드 화이트 유리, 25 x 75mm, 90도; 그라운드 엣지, WHITE Frosted</td><td>Globe Scientific</td><td>1380-50W</td><td></td></tr><tr><td>mPEG-숙시니미딜 발레레이트, MW 5,000&nbsp;</td><td>레이산 바이오</td><td>#NH2-PEG-VA-5K</td><td></td></tr><tr><td>옵티마&트레이드; Max-XP 테이블탑 초원심분리기</td><td>Beckman-Coulter&nbsp;</td><td></td><td></td>393315</tr><tr><td>파라핀</td><td>Fisher Scientific</td><td>P31-500</td><td></td></tr><tr><td>PELCO 리버스(자동 폐쇄), 미세 핀셋</td><td>Ted Pella</td><td>5377-NM</td><td></td></tr><tr><td>Petrolatum, White</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-605-050</td><td></td></tr><tr><td>플라즈마 클리너, 115V</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>수산화칼륨(KOH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>소듐 바이카보네이</td>트 <td>시그마 알드리치</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>설탕</td><td>시그마 알드리치</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Thermal-Lok 1-위치 건식 열 목욕</td><td>USA Scientific</td><td>2510-1101</td><td></td></tr><tr><td>1.5 및 2.0 mL 튜브용 Thermal-Lok 블록</td><td>USA Scientific</td><td>2520-0000</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&trade; 피어싱&트레이드; 채권 파괴&거래; TCEP 용액, 중성 pH; 500mM</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>PI-77720</td><td></td></tr><tr><td>TIRF 100X NA 1.49 오일 오브젝티브</td><td>Nikon</td><td>CFI Apochromat TIRF 100XC 오일</td><td></td></tr><tr><td>TIRF 현미경</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>TLA 120.1 로터</td><td>Beckman-Coulter&nbsp;</td><td></td><td></td>362224</tr><tr><td>TLA 120.2 로터</td><td>Beckman-Coulter&nbsp;</td><td></td><td></td>357656</tr><tr><td>튜불린 단백질(>99% 순수): 돼지 뇌</td><td>세포골격</td><td>T240</td><td></td></tr><tr><td>튜불린 단백질(비오틴): 돼지 뇌</td><td>세포골격</td><td>T333P</td><td></td></tr><tr><td>튜불린 단백질(형광 HiLyte 647): 돼지 뇌</td><td>세포골격</td><td>TL670M</td><td></td></tr><tr><td>튜불린 단백질(X-로다민): 소 뇌</td><td>세포골격</td><td>TL620M</td><td></td></tr><tr><td>벡타본드&reg; 시약, 조직 절편 접착</td><td>벡터 Biolabs</td><td>SP-1800-7</td><td></td></tr><tr><td>VWR&reg; 개인용 인큐베이터, 120V, 50/60Hz, 0.6A</td><td>VWR</td><td>97025-630</td><td></td></tr></tbody></table>

tirf 현미경에 의한 시험관 내에서 가교 및 단일 미세 소 관 의 역학의 동시 시각화

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

미세소관은 세포에서 별개의 구조로 조직되는 αβ-튜불린 이종이량체의 중합체이다. 미세소관 기반 아키텍처 및 네트워크에는 종종 동적 특성이 다른 미세소관 어레이의 하위 집합이 포함되어 있습니다. 예를 들어, 분열 세포에서, 가교결합된 미세소관의 안정한 다발은 동적 비가교된 미세소관에 근접하여 공존한다. TIRF-현미경-기반 시험관 내 재구성 연구는 이들 상이한 미세소관 어레이의 역학의 동역학의 동시 시각화를 가능하게 한다. 이 분석에서, 이미징 챔버는 단일 필라멘트로 존재하거나 가교된 다발로 조직되는 표면 고정화된 미세소관으로 조립된다. 튜불린, 뉴클레오티드 및 단백질 조절제의 도입은 관련 단백질 및 단일 및 가교된 미세소관의 동적 특성의 직접적인 시각화를 가능하게 한다. 또한, 동적 단일 미세소관이 번들로 구성될 때 발생하는 변화를 실시간으로 모니터링할 수 있습니다. 여기에 설명 된 방법은 개별 단백질의 활성 및 국소화에 대한 체계적인 평가뿐만 아니라 동일한 실험 조건 하에서 두 개의 서로 다른 미세 소관 하위 집합에 대한 단백질 조절제의 상승 효과를 허용하여 다른 방법으로는 접근 할 수없는 기계론적 통찰력을 제공합니다.

상기 기재된 실험은 647 nm 형광단-표지된 비오티닐화 마이크로소관, 560 nm 형광단-표지된 비오티닐화 마이크로소관, 및 560 nm 형광단-표지된 가용성 튜불린 혼합물을 사용하여 수행되었다. 미세소관은 가교결합 단백질 PRC1 (GFP 표지)에 의해 가교결합되었다. 표면-고정화된 다발 및 단일 미세소관이 생성된 후(단계 5.11), 이미징 챔버를 TIRF 100X 1.49 NA 오일 대물 상에 장착하고 560 nm 및 647 nm 형광 채널에서 관찰하였다. 단일 미세소관은 647 nm 채널에서 그들의 형광 신호에 의해 확인되었다. 두 채널 모두에서 형광 신호를 갖는 미세소관은 미리 형성된 다발로 확인되었다(그림 4). 동일한 형광 표지를 가진 비오티닐화 및 비오티닐화 미세소관으로 실험을 수행하는 경우, 다발에 대한 검출된 형광 강도는 단일 미세소관의 형광 강도보다 약 두 배 또는 그 이상이 될 것이다. 각 개체군의 비율과 밀도에 따라, 단계 5.6 및 5.10에서 미세...

여기서, TIRF 현미경 기반 시험관내 재구성 분석법이 제시되어 두 미세소관 집단의 역학을 동시에 정량화하고 비교한다. 가교된 미세소관 다발 및 단일 미세소관 상에서 다수의 미세소관-관련 단백질의 집단 활성을 동시에 보는 방법이 기술된다.

TIRF 현미경에 의한 시험관 내에서 가교 및 단일 미세 소 관 의 역학의 동시 시각화

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and ...

세포 미세소관 어레이는 기능에 필요한 뚜렷한 동적 특성을 갖는 미세소관의 하위집단을 포함한다. 이 프로토콜은 규제 기관의 집단 활동이 뚜렷한 특성을 가진 근위 미세 소관 하위 집단을 부여하는 방법을 다룹니다. 이 상향식 회복 분석을 통해 우리는 단일 미세 소관 및 번들과 같은 근위 미세 소관 집단의 조직과 역학을 동시에 시각화하고 자체 조직의 기초가되는 메커니즘을 해독 할 수 있습니다.다성분 재구성을 위해서는 pH, 이온 강도 및 단백질 농도와 같은 실험 파라미터를 최적화하면서 각각의 활성을 보존해야 합니다. 다중 단백질 분석 전에 개별 성분을 체계적으로 분석하는 것은 매우 유용합니다. 시작하기 위해, 4.5 마이크로리터의 BRB ADDTT를 하나의 마이크로리터의 미세소관 용액에 혼합한 것을 현미경 슬라이드 상에 피펫팅한다.18 x 18mm 커버슬립으로 덮고 투명한 매니큐어 또는 VALAP 실란트로 가장자리를 밀봉합니다. TIRF 목표를 커버슬립 아래에 놓습니다. 밝은 믹스에서 형광 표지된 튜불린에 적합한 파장에서 새로 중합된 미세소관을 시각화하여 다가오는 실험에 사용할 미세소관의 희석액을 결정한다.모든 형광 단백질이 조명되도록 실험에 대한 레이저 강도를 경험적으로 결정하되 실험의 시간 과정에 걸쳐 상당한 광표백을 겪지 않는다. 현미경 온도를 섭씨 28도로 설정하여 동적 미세 소관을 볼 수 있습니다. 렌즈 용지를 사용하여 70 % 에탄올로 100X 대물렌즈를 청소하십시오.이미징할 형광 채널에 따라 필터 큐브와 방출 필터의 최상의 조합을 사용하십시오. 이미징 시퀀스를 설정합니다. 647 나노미터 형광단-표지된 비오티닐화 마이크로세뇨관, 560 나노미터 형광단-표지된 비-가용성 튜불린, 및 GFP 표지된 관심있는 단백질에 대한 실험을 위해, 20분 동안 매 10초마다 488 나노미터, 560 나노미터 및 647 나노미터 채널을 이미지화하였다.가용성 튜불린 및 미세소관 관련 단백질을 첨가하기 전에 번들의 참조 이미지를 캡처하려면 560 나노미터 및 647 나노미터 파장 채널에서 각각 하나의 이미지로 시퀀스를 설정하십시오. 현미경 위의 천장에있는 레이저 빔의 위치를 확인하고 소프트웨어를 사용하여 빔을 변경하십시오. 레이저 조명기가 정렬되어 있는지 확인하십시오.이미징하기 전에 현미경 침지 오일 한 방울을 목표에 추가하십시오. 가용성 튜불린 혼합물을 얼음 위에 보관하면서 준비하고 혼합물을 회전시킵니다. 비오틴-NeutrAvidin-비오틴 결합을 통해 미세소관을 고정화시키기 위해, 먼저 챔버가 채워질 때까지 약 7.5 마이크로리터의 NeutrAvidin 용액으로 유동시키고 5분 동안 인큐베이션한다.10 마이크로 리터의 MB 감기로 씻으십시오. 블로킹 단백질 KC의 7.5 마이크로리터를 유동시키고 2분 동안 인큐베이션한다. 10 마이크로리터의 MB를 따뜻하게 세척하여 미세소관의 도입을 위한 챔버를 준비한다.BRB ADDTT에서 비오티닐화 된 미세 소관의 스톡을 희석하고이 희석액의 한 마이크로 리터를 MB 따뜻한 아홉 마이크로 리터에 첨가하십시오. 혼합물을 챔버 내로 유동시키고 10분 동안 인큐베이션한다. 고정되지 않은 미세 소관을 10 마이크로 리터의 따뜻한 상태로 씻어 내십시오.7.5 마이크로리터의 따뜻한 KC를 챔버 내로 유동시키고 두 분 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 동안, KC에서 가교결합 또는 단백질 PRC1의 두 나노몰 용액을 제조하고 용액을 스핀다운한다. 이 용액 10 마이크로리터를 이미징 챔버 내로 유동시키고 5분 동안 인큐베이션한다.번들을 만들기 위해, 10 마이크로리터의 비오티닐화 미세소관을 챔버 내로 흘려보내고 10분 동안 인큐베이션한다. 10 마이크로 리터의 MB로 챔버를 두 번 씻으십시오. 10분 인큐베이션 시간 동안, 관심있는 단백질, 가용성 튜불린, 뉴클레오티드, 산소 제거제, 및 항산화제를 함유하는 10 마이크로리터의 분석 혼합물을 준비하고 그것을 스핀다운시킨다.혼합물을 얼음 위에 보관하십시오. 준비된 이미징 챔버를 100X TIRF 목표의 슬라이드 홀더에 로드합니다. 560 나노미터 및 647 나노미터 채널을 사용하여 단일 마이크로소관 및 번들의 최적 수와 밀도를 포함하는 시야를 찾으십시오.시야각이 식별되면 참조 이미지를 가져옵니다. 이미징 챔버를 방해하지 않고 분석 혼합물을 조심스럽게 유동시킨다. 챔버의 열린 끝을 VALAP 실란트로 밀봉하십시오.미세 소관을 관찰하고 이미징 시퀀스를 시작하십시오. 미세소관 종자를 고정화하고 다발을 생성한 후, 형광 이미지를 수득하였다. 단일 미세소관은 647 나노미터 채널에서 형광 신호로 확인된 반면, 미세소관은 두 채널 모두에서 형광 신호를 표시할 때 미리 형성된 다발로 확인되었습니다.단일 미세소관 및 PRC1 가교결합된 다발의 역학은 단백질 KIF4A 및 CLASP1의 존재하에 연구되었으며, 이는 단일 미세소관이 분석 과정에 걸쳐 길어지는 반면, 가교결합된 미세소관의 성장은 지연된다는 것을 밝혀냈다. 중합 된 미세 소관을 실온 이상으로 유지하도록주의하십시오. 가용성 튜불린을 얼음 위에 보관하고 이미징 챔버와 형광 표지 된 미세 소관 및 단백질을 빛으로부터 보호하십시오.이러한 분석은 유사분열 스핀들에서 발견되는 단백질 모듈이 스핀들에 공존하는 두 개의 서로 다른 미세소관 집단의 역학을 어떻게 차별적으로 조절할 수 있는지에 대한 기계론적 통찰력을 제공했다.

simultaneous-visualization-dynamics-crosslinked-single-microtubules

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

따라서, 그것이 관여 단백질의 공간적 및 시간적 행위를 파악하는 것이 중요 신호 전달 이해하기 위해, 플라즈마 막 내에서 또는 세포 내 위치에 두 단백질의 compartmentalization 크게 신호 결과에 영향을 미칠 수있는 규제 메커니즘입니다. 우리는 여기서 T 세포의 신호 전달을 연구하는 TIRF 현미경 기반 시스템을 설명하지만, 광범위하게 적용됩니다.

실시간, TCR의 동시 이미징 및 관련 신호 전달 단백질에 대한 TIRF 현미경 기법

총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경 가까이 높은 콘트라스트와 시간적 해상도의 세포 표면 구조를 관찰하기위한 강력한 방법입니다. 우리는 TIRF은 세포 벽 - 동봉된 세균과 곰팡이 세포의 피질에서 단백질 역학을 공부 고용 수있는 방법을 보여줍니다.

미생물에 접속 조직 및 역학 시각화, 총 내부 반사의 형광 현미경을 사용하여

이 동영상은 액틴 및 미세소관 중합 역학을 시각화하기 위한 전반사 현미경 기반 기술인 TIRF에 대해 설명합니다. 이 방법을 사용하면 액틴과 미세소관 결합 역학의 고해상도 이미징을 실시간으로 수행할 수 있으며, 이는 세포 누화를 이해하는 데 필수적입니다.

액틴과 미세소관 결합 역학을 시각화하기 위한 TIRF 현미경 검사

이 비디오에서는 적절한 완충액이 있는 커버슬립 표면에서 자라는 미세소관을 시각화하기 위한 간섭 반사 현미경(IRM) 기술에 대해 설명합니다. 입사광을 이용한 조명 시, 커버슬립-버퍼 인터페이스와 버퍼-미세소관 인터페이스는 빛을 반사하며, 이 두 인터페이스가 결합되어 간섭 패턴을 생성함으로써 미세소관을 밝은 배경에 대한 고대비 이미지로 시각화할 수 있습니다.

미세소관 역학의 Label-free 시각화를 위한 간섭 반사 현미경 검사

Clathrin-mediated endocytosis는 빠르고 매우 역동적인 과정으로 신호 수용체를 포함한 많은 단백질을 내부화합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 개별 내포세포 이벤트의 동역학을 직접 시각화합니다. 이는 내포세포 기전의 핵심 구성원이 서로 어떻게 협력하는지, 그리고 단백질 화물이 이 과정에 어떤 영향을 미치는지 이해하는 데 필수적입니다.

TIRF 현미경을 통해 단일 ​​이벤트 해상도에서 G 단백질 결합 수용체의 Clathrin 매개 엔도 시토 시스를 시각화

효모 신진 인해 강력한 유전학과 미세 소관 세포 골격의 단순함에 생체 내 미세 소관 역학 연구를위한 유리한 모델입니다. 다음 프로토콜 변환 및 문화 효모 세포, 공 초점 현미경 이미지를 수집하고, 정량적으로 효모 살아있는 세포에서 미세 소관 역학을 분석하는 방법에 대해 설명합니다.

고해상도 이미징 및 개인 별이 미세 소관 역학의 분석 신진 효모에서

신속 하 고 높은 해상도 허용 하는 고급 현미경, 고립 된 플라즈마 멤브레인와 주변 세포내 볼륨의 이미지를 제시 한다. 회전 디스크 및 총 내부 반사 형광 현미경 검사 법 한 설정의 통합 3.5까지 높은 수집 속도에서 라이브 이미징 실험을 허용 이미지 스택 당 s.

회전 디스크-총 내부 반사 형광 현미경 검사 법 고급 시각화에 의해 세포 접착 형성

이 프로토콜은 시험관 내 표면 분석법을 사용하여 미세 소관의 무, 고대비, 고속 이미징을 위한 표준 형광 현미경에 간섭 반사 현미경 을 구현하기 위한 가이드입니다.

마이크로소관의 라벨이 없는 고속 이미징을 위한 간섭 반사 현미경 검사법 구현

우리는 동적 미세 소관 및 형광 표지 된 미세 소관 관련 단백질의 동시 이미징을 위해 간섭 반사 현미경 검사 및 전체-내부-반사-형광 현미경을 구현하기위한 프로토콜을 제시합니다.

동시 간섭 반사 및 전체 내부 반사 형광 현미경 검사 이미징 동적 미세 소관 및 관련 단백질

여기에서는 시험관 내에서 미세소관 다발을 재구성하고 동시 광학 트래핑 및 전반사 형광 현미경을 사용하여 그 안에 가해지는 힘을 직접 정량화하는 프로토콜을 제시합니다. 이 분석은 활성 미세소관 네트워크 내에서 단백질 앙상블에 의해 생성된 힘과 변위의 나노스케일 수준 측정을 허용합니다.

재구성된 활성 미세소관 다발 내의 힘을 직접 측정

이 프로토콜은 시험관내 총 내부 형광 (TIRF) 현미경 분석을 사용하여 동적 액틴 및 미세 소관을 시각화하기위한 가이드입니다.

액틴과 미세소관 커플링 다이내믹스 를 총 내부 반사 형광(TIRF) 현미경으로 시각화

배우세요 TIRF 현미경을 이용한 시험관 내 미세소관 재구성 분석법으로 단일 미세소관과 가교 결합체의 역학을 동시에 시각화하고, 미세소관 관련 단백질의 집단 활성을 정량적으로 비교하는 방법을 익히세요.

TIRF 현미경에 의한 시험관 내에서 가교 및 단일 미세 소 관 의 역학의 동시 시각화

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