Name: 마우스 중추 신경계의 조직학적 분석을 위한 중력 공급 심질 관류 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-21T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: 학습하세요 중력 공급 심질 관류법을 이용한 마우스 중추 신경계 조직학 분석 방법을. 파킨슨병 모델에서 인산화 알파-시누클레인 면역형광 검출이 가능하며 비용 효율적인 조직 고정 프로토콜을 제공합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

저자들은 Xiaowen Wang, Liam Coyne 및 Jason Grullon이이 프로토콜을 개발하는 데 도움을 준 것에 감사드립니다. 이 작업은 NIH 보조금 AG061204 및 AG063499에 의해 지원되었습니다.

<ol><li>Tao-Cheng, J. H., Gallant, P. E., Brightman, M. W., Dosemeci, A., Reese, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+changes+at+synapses+after+delayed+perfusion+fixation+in+different+regions+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Structural changes at synapses after delayed perfusion fixation in different regions of the mouse brain.</a> Journal of Comparative Neurology. 501 (5), 731-740 (2007).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564(2012).</li>
<li>McFadden, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion+fixation+in+brain+banking%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Perfusion fixation in brain banking: a systematic review.</a> Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 146(2019).</li>
<li>Lamberts, R., Goldsmith, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation%2C+fine+structure%2C+and+immunostaining+for+neuropeptides%3A+perfusion+versus+immersion+of+the+neuroendocrine+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Fixation, fine structure, and immunostaining for neuropeptides: perfusion versus immersion of the neuroendocrine hypothalamus.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 34 (3), 389-398 (1986).</li>
<li>Adickes, E. D., Folkerth, R. D., Sims, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+perfusion+fixation+for+improved+neuropathologic+examination%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+and+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Use of perfusion fixation for improved neuropathologic examination.</a> Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 121 (11), 1199-1206 (1997).</li>
<li>Giasson, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+alpha-synucleinopathy+with+severe+movement+disorder+in+mice+expressing+A53T+human+alpha-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neuronal alpha-synucleinopathy with severe movement disorder in mice expressing A53T human alpha-synuclein.</a> Neuron. 34 (4), 521-533 (2002).</li>
<li>Martin, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease+alpha-synuclein+transgenic+mice+develop+neuronal+mitochondrial+degeneration+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease alpha-synuclein transgenic mice develop neuronal mitochondrial degeneration and cell death.</a> Journal of Neuroscience. 26 (1), 41-50 (2006).</li>
<li>Fujiwara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Synuclein+is+phosphorylated+in+synucleinopathy+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">alpha-Synuclein is phosphorylated in synucleinopathy lesions.</a> Nature Cell Biology. 4 (2), 160-164 (2002).</li>
<li>Kalia, L. V., Lang, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease.</a> Lancet. 386 (9996), 896-912 (2015).</li>
<li>Anderson, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+Ser-129+is+the+dominant+pathological+modification+of+alpha-synuclein+in+familial+and+sporadic+Lewy+body+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of Ser-129 is the dominant pathological modification of alpha-synuclein in familial and sporadic Lewy body disease.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (40), 29739-29752 (2006).</li>
<li>Kahle, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperphosphorylation+and+insolubility+of+alpha-synuclein+in+transgenic+mouse+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Hyperphosphorylation and insolubility of alpha-synuclein in transgenic mouse oligodendrocytes.</a> EMBO Reports. 3 (6), 583-588 (2002).</li>
<li>Mattson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+arterial+blood+pressure+in+different+strains+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hypertension%22%5BJournal%5D)">Comparison of arterial blood pressure in different strains of mice.</a> American Journal of Hypertension. 14, 405-408 (2001).</li>
</ol>

저자들은 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

이 연구는 심질 관류를 수행하는 중요한 단계를 설명합니다. 관류 장치(프로토콜 섹션 1)를 구성할 때, 지혈제에 의해 완전히 폐색될 수 있을 만큼 충분히 유연한 튜빙을 사용하는 것이 중요하다. 일부 뻣뻣한 튜빙은 지혈제에 의해 충분히 폐색되지 않을 수 있고, 초기 PBS 관류 동안 PFA가 메인 라인으로 누출되는 것을 여전히 허용할 수 있다. 4% PFA 용액을 제조할 때, pH가 생리학적인지 확인하는 것이 중요하다(7.4). PFA 용액의 제조는 그것을 65°C로 가열하는 것을 포함하기 때문에, 이것은 pH가 미터상에서 교정되는 온도이기 때문에 pH를 측정하기 전에 용액을 25°C까지 다시 냉각시켜야 한다.
복부에 초기 절개를 할 때 복부 장기의 열상을 피하기 위해주의를 기울여야합니다 (프로토콜 섹션 2). 횡격막 쪽으로 우월하게 해부 할 때, 간이 전방 복벽과 부착되는 것이 일반적이므로 간이 열상을 피하는 것이 중요합니다. 이를 극복하기 위해 간은 횡격막 쪽으로 절개를 계속하기 전에 전벽에서 조심스럽게 그리고 뻔뻔스럽게 해부됩니다. 횡격막을 통해 흉강에 들어갈 때는 심장, 큰 혈관 및 폐의 열상을 피하는 것이 중요합니다. 이를 피하기 위해 가위 팁은 흉곽과 피상적으로 그리고 급성 각도로 유지됩니다.
심장을 노출시키는 초기 해부에는 초기 절개에서 약 2 분이 걸립니다. 이 기간 동안 일부 공기가 나비 바늘의 끝으로 들어갈 것으로 예상됩니다. 이 공기를 마우스의 순환에 도입하면 품질이 떨어지는 관류가 발생합니다. 따라서 메인 라인이 열리고 PBS가 심장의 캐뉼레이션 직전에 바늘을 통해 플러시되어 기포를 제거하는 것이 중요합니다. 이상적으로는, 작은 PBS 트리클이 바늘 팁을 통해 흐르는 동안 심장은 캐뉼레이션되어 LV를 뚫을 때 공기가 완전히 없음을 보장합니다.
바늘이 LV에 들어갈 때, 바늘 끝을 우심실 (RV)에 도입 할 정도로 깊어서는 안됩니다. RV 또는 승모판 너머에 바늘을 배치하면 관류가 시작될 때 폐의 즉각적인 "인플레이션"이 발생합니다. 이것은 바람직하지 않으며, LV 배치를 보장하기 위해 바늘을 약간 뽑아야합니다. 바늘을 제대로 놓으면 폐는 관류 내내 평평하게 유지됩니다. 관류가 시작될 때, 동물의 열린 입에서 맑은 액체가 나오는 것이 때때로 관찰됩니다. 이것은 일반적으로 너무 높은 관류 압력 또는 심장 내 바늘의 잘못 배치 때문입니다. 저자들은 상승 된 관류 압력이 동맥 모세관 층에서 퍼퓨세이트의 혈관을 외부화하고 기관지 트리를 통해 식도와 구강으로 PBS의 역행 흐름을 초래한다고 추측합니다.
관류 압력은 PBS 병 내의 PBS 수준을 감소시키거나 PBS 병의 높이를 낮춤으로써 낮아져야 한다. 대안으로, 바늘이 좌심실에 너무 깊이 놓이면 승모판 밸브를 통과하여 향수를 좌심방으로 전달할 수 있습니다. 이것은 위에서 설명한 바와 같이 폐정맥을 통한 역행 유동 및 세동맥으로의 향수의 혈관외 유출을 초래할 수 있다. PBS를 사용한 순환계로부터의 혈액의 철저한 클리어런스는 후속 고정 관류시 혈관 폐색을 초래하는 혈액 성분의 고정-유도된 가교결합을 피하기 위해 특히 중요하다. 클리어런스는 복부 꼬리 기저부의 절개로부터 간 및 PBS 유동의 색 변화에 의해 효과적으로 평가된다. 혈액 클리어런스는 일반적으로 PBS와의 관류 3 분에 의해 완료된다; 그러나 짧은 시간에 클리어런스의 시각적 징후가 발생하면 3 분보다 빨리 고정이 발생합니다. 지연된 고정 관류가 CNS 미세 구조1에서 아티팩트로 이어지기 때문에 더 긴 클리어런스 시간은 권장되지 않습니다.
PFA가 투여 될 때, PFA 병에서 PFA 용액의 수준을 모니터링하는 것이 중요합니다. PFA 병의 입 위로 4cm 미만으로 떨어지면 PFA 병을 채우십시오. 관류가 완료된 후, 관류 장치는 증류수로 철저히 헹구어 야합니다. 이는 메인 라인의 잔류 PFA가 PFA로 초기 PBS 관류를 오염시키고 품질이 떨어지는 관류를 초래하기 때문에 중요합니다. 마지막으로, 25G 나비 바늘은 일반적으로 20-30g 범위의 평균 크기의 성인 마우스에 권장됩니다. 그러나, 더 크거나 작은 마우스는 최적의 유속을 제공하기 위해 고정 병의 조정 이외에 약간 더 크거나 더 작은 게이지 바늘을 필요로 할 수 있다.
CNS 해부 및 OCT 임베딩 (프로토콜 섹션 3)의 경우, 척수 조직이 30 % 수크로오스에 완전히 가라 앉지 않는 것이 일반적입니다. 따라서 이들 조직은 2일 동안 수크로오스에 방치된 후 가라앉는지 여부에 관계없이 OCT에 포매된다. OCT에서 조직을 동결시킬 때, 냉각된 2-메틸부탄에 넣으면 특정 조직이 갈라질 수 있습니다. 이것은 뇌에서 더 흔하며 일반적으로 너무 많은 OCT가 조직에 배치 될 때 발생합니다. 이를 피하려면 즉시 동결하기 전에 조직 표면을 덮기에 충분한 OCT 만 두십시오. 일부 프로토콜에서는 OCT에 완전히 몰두했음에도 불구하고 크래킹이 덜 일반적입니다. 이것은 일반적으로 드라이 아이스 냉각 2-메틸 부탄을 사용하거나 드라이 아이스 블록에 cryomold를 직접 배치 할 때와 같이 느린 동결 방법 때문입니다. 액체-질소-냉각된 2-메틸부탄은 동결 속도가 실질적으로 더 빠르고, 느린 동결 방법보다 조직 형태를 더 잘 보존할 수 있기 때문에 이 작업에서 바람직하다.
조직을 동결 절제할 때(프로토콜 섹션 4), 다수의 동결-해동 사이클을 피하는 것이 중요하다. 따라서 단일 OCT 블록에서 모든 섹션을 절단하여 선택한 영역을 해동하고 다시 얼리는 대신 분석을 위해 특정 뇌 영역을 얻는 것이 가장 좋습니다. 이것이 실행 가능하지 않은 경우, 몇 개의 섹션을 얻은 후, 사용자는 OCT 블록을 나중에 사용하기 위해 -80°C 깊은 냉동고에 1-2회 더 재동결 및 저장할 수 있다.
보다 전통적인 펌프 또는 퍼퓨세이트의 공기 압력 전달에 대한 이 방법의 주요 이점은 다음과 같다: (1) 관류 장치의 저렴한 비용 및 접근성. (2) 사용자는 관류 전반에 걸쳐 관류 장치에서 수동으로 압력을 유지할 필요가 없다. (3) 주사기 전달과 같은 관류를위한 다른 저비용 대안보다 낮고 일관된 관류 압력. Bernoulli의 방정식을 사용하여, 여기에 건설 된 중력 공급 관류 장치는 향수 병이 바늘에 대해 1m의 고도에 배치 될 때 약 73mm Hg의 관류 압력을 유지할 것이라고 계산됩니다. 이것이 이들 동물의 수축기 혈압보다 현저히 낮다는 것을 감안할 때, 이러한 관류 압력은 혈관 파열(12)을 피하기 위해 충분히 낮을 가능성이 높다.
저자들은 지금까지 파킨슨 병의 마우스 모델에서 인산화 된 α 시누클레인의 존재를 검출하기 위해이 관류 시스템을 성공적으로 사용했습니다. 이 시간 동안, 이러한 관류 방법에 대한 상당한 한계는 펌프 관류 전달 방법과 함께 존재하지 않는 것이 발생하지 않았다. 이 기술의 주요 한계는 관류 대 낙하 고정의 시간이 많이 걸리는 특성입니다. 이 기술은 관류가 CNS 구조에 대한 고정성의 더 깊은 침투를 초래하기 때문에 고정을 떨어뜨리는 것이 바람직하다. 이 기술의 두 번째 한계는 흉강으로 들어간 후 심장을 신속하게 캐뉼레이션해야하기 때문에 수행하는 데 약간의 수술 기술이 필요하다는 것입니다. 그러나 경험을 통해 숙련 된 사용자는 복부를 처음 절개 한 후 1 분 이내에 일상적으로 심장을 수축시킬 수 있습니다.

마우스 중추 신경계 (CNS)에서 병리학의 조직 학적 특성화는 신경 퇴행 연구에 사용되는 일상적인 기술입니다. 신경 조직이 사망 후 급속히 분해됨에 따라, 파라포름알데히드와 같은 화학적 고정제를 CNS 조직에 전달하여 형태 1,2를 보존하는 것이 일반적입니다. 화학적 고정은 고정 용액과의 전신 관류를 통해 또는 조직의 분리 및 고정 용액 ( "드롭 고정"이라고 함)에 침지함으로써 수행 될 수 있습니다. 관류는 낙하 고정이 깊은 CNS 구조물 3,4,5 내로의 고정 용액의 신속한 침투를 허용하지 않을 수 있기 때문에 고정 전달의 바람직한 방법이다. 또한, 척추 기둥으로부터 고정되지 않은 척수를 제거하는 것이 어렵기 때문에, 관류를 통한 고정 용액의 전달은 척수 현미경 및 총체적 해부학의 현장 보존을 허용하고 조직을 경직시켜 제거 시 손상을 최소화한다.
고정에 필요한 버퍼 및 고정 용액의 전달은 일반적으로 상업적으로 이용 가능한 펌프 또는 공기 압력을 사용하여 수행됩니다. 퍼퓨세이트의 중력 전달은 다음과 같은 이유로 펌프 전달에 대한 대안으로서 작용할 수 있다: (1) 펌프 또는 공기 압력 전달은 경우에 따라 사용자가 관류 전반에 걸쳐 시스템 내의 압력을 수동으로 유지하도록 요구할 수 있다. 방향제의 중력 전달은 사용자의 개입 없이 유지될 수 있다. (2) 중력 전달 향수 장치는 표준 과학 공급 업체로부터 사용 가능한 재료를 얻음으로써 사용자에게 저렴한 비용으로 구축 할 수 있습니다. 이 작업은 세척 병과 비닐 튜브를 사용하여 간단한 중력 관류 장치를 구성하는 방법을 설명합니다. 파킨슨 병의 마우스 모델을 사용하여,이 연구는 냉동 절편을 위해 분리하기 전에 뇌와 척수 조직을 관류하는이 시스템의 효능을 보여줍니다. 이 연구는 동물에서 고정 된 조직을 해부하고, 조직을 신속하게 동결 / 내장 및 냉동 절제하고, 간접 면역 형광 현미경을 통해 뇌와 척수 모두에서 인산화 된 α 시누클레인의 존재를 감지하는 데 필요한 모든 단계, 기술 및 물질을 종합적으로 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>2-메틸부탄 (인증 ACS), 피셔 케미컬</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>03551-4</td><td></td></tr><tr><td>앤드윈 사이언티픽 티슈-텍 O.C.T 컴파운드</td><td>피셔 사이언티픽 NC1029572</td><td></td><td></td></tr><tr><td>아트맨 인스트루먼트 4.5" 스트레이트 카스트로베이호 스프링 액션 가위</td><td>아마존</td><td>B0752XHK2X</td><td>"파인 가위"</td></tr><tr><td>BD 일반 사용 및 PrecisionGlide 피하 주사 바늘, 18 G</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-5D</td><td></td></tr><tr><td>BD 범용 및 PrecisionGlide 피하 주사 바늘, 22g</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826B</td><td></td></tr><tr><td>Corning PES 주사기 필터</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-754-29</td><td></td></tr><tr><td>Cytiva HyClone 인산염 완충 식염수(PBS), 10x</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30258</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50mL 원추형 원심분리기 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents 소 혈청 알부민 (BSA) 프로테아제 무료 파우더</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9703100</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 곡선형 중간 포인트 범용 펜치</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-110</td><td>"곡선형 창공 펜치"</td></tr><tr><td>Fisherbrand 곡선형 매우 미세한 정밀 팁 펜치</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-123</td><td>"곡선형 세밀한 펜치"</td></tr><tr><td>Fisherbrand 일회용 졸업 전사 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-9AM</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 고정밀 직선 테이퍼드 초미세 포인트 핀셋/집게</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-000-122</td><td>"직선 세밀한 집게"</td></tr><tr><td>Fisherbrand 마이크로 주걱 둥근 끝</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-401-5</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 도자기 Buchner 퍼널, 고정 펀칭 플레이트,</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB966J</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 프리미엄 커버 유리, 24 x 50</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5M</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 프리미엄 티슈 펜치 1X2 이빨 5 인치. 독일 스틸</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>13-820-074</td><td>"스킨 펜치"</td></tr><tr><td>Fisherbrand 재사용 가능한 헤비 월 필터 플라스크</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>FB3002000</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 표준 해부 가위</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-951-20</td><td>"해부 가위"</td></tr><tr><td>Fisherbrand 일회용 멸균 주사기</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-464</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 직선 잠금 지혈제</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-115</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus 현미경 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 비닐 튜빙 및 커넥터 키트, 1/4 인치.</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-174-1C</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 습식 강화 품질 필터 종이 서클</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-790-12F</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Y 커넥터, 1/4 인치 ID - 폴리프로필렌 - QC</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-000-686</td><td></td></tr><tr><td>Garvey Economy Single Edge Cutter Blade</td><td>Amazon</td><td>B001GXFAEQ</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>35552</td><td></td></tr><tr><td>Ideal Clamp Stant 고압 클램프</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-198-5A</td> <td>"호스 클램프"</td></tr><tr><td>IMEB, Inc Sakura Accu-Edge 로우 프로파일 마이크로톰 블레이드, 디스포이저블</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9822467</td><td></td></tr><tr><td>Kawasumi 25 게이지 표준 날개 혈액 채취 세트</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-010-137</td><td>"나비 바늘"</td></tr><tr><td>Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes 섬세한 작업 와이퍼, 1-플라이</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>분자 프로브 DAPI</td><td>Fisher Scientific</td><td>P36962</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Narrow-mouth Right-to-Know LDPE Wash Bottles</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>2425-0506</td> <td>"buffer bottles"</td></tr> <tr><td>PAP pen</td><td>abcam</td><td>ab2601</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde Granular</td><td>Electron Microscopy Systems</td><td>19210</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex Glass Drying 접시, 34.9 x 24.9 x 6cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-242D</td><td></td></tr><tr><td>재조합 안티 알파-시누클레인(phospho S129) 항체 [EP1536Y]</td><td>abcam</td><td>ab51253</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>221465-2.5kg</td><td></td></tr><tr><td>스테인레스 스틸 마시는 컵 분자 생물학용 18온스</td><td>아마존</td><td>B0039PPO9U</td><td></td></tr><tr><td>자당 CAS: 57-50-1</td><td>Us Biological</td><td>S8010</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>미국 생물학</td><td>T8655</td><td></td></tr><tr><td>Vetone Fluriso 이소플루란 USP</td><td>MWI 동물 건강</td><td>502017</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 중추 신경계의 조직학적 분석을 위한 중력 공급 심질 관류 방법

A Gravity-Fed Transcardial Perfusion Method for Histologic Analysis of the Mouse Central Nervous System

마우스에서 분리 된 뇌 및 척수 표본의 조직 학적 분석은이 모델 시스템에서 병리학 평가를위한 일반적인 관행입니다. 이러한 섬세한 조직의 형태를 유지하기 위해, 마취된 동물에서 심장의 캐뉼레이션(transcardial perfusion)을 통해 파라포름알데히드와 같은 화학적 고정제를 투여하는 것이 일상적이다. 마우스 심장의 심막 관류는 전통적으로 연동 펌프 또는 공기 압력의 사용에이 과정에 필요한 식염수 및 고정 솔루션을 모두 제공하는 데 의존해 왔습니다. 이러한 방법에 쉽게 접근 할 수있는 대안으로,이 작업은 대부분의 하드웨어 상점에서 사용할 수있는 재료를 사용하는 향수 전달의 중력 공급 방법의 사용을 보여줍니다. 
이 새로운 관류 방법을 검증하기 위해이 연구는 뇌와 척수 모두에서 인산화 된 α 시누클레인의 민감한 검출에 필요한 모든 후속 단계를 보여줍니다. 이 단계에는 고정 된 뇌 및 척수 조직의 해부, 조직의 신속한 동결 / 임베딩 및 냉동 절제, 면역 형광 염색이 포함됩니다. 이 방법은 고정제의 전신 전달을 초래하기 때문에, 조직학적 분석을 위해 다른 비신경 조직을 제조하는데 사용될 수도 있다.

고품질 관류는 간, 척수 및 깊은 CNS 구조에 혈액이 없음으로 나타납니다 (그림 4C 및 그림 5G, H). 경막 아래 (예를 들어, 정맥 부비동 내) 또는 경막 교통과 두개골 사이의 보유 된 혈액은이 혈액이 뇌 실질 내에 있지 않기 때문에 문제가되지 않았습니다. 도 4A 에서 보이는 혈액은 두개골과 경막 물질 사이에 위치하며, 따라서 품질이 좋지 않은 관류에 문제가 있거나 암시적이지 않다. 신선한 뇌와 척수는 매우 부드럽고 취급 중에 쉽게 손상됩니다. 이에 비해 적절하게 고정 된 조직은 단단합니다. 이 관류 방법에 의해 조직의 질과 조직의 형태학의 보존을 평가하기 위해,이 연구는 15 개월 된 마우스와 인간 A53T α 시누클레인을 발현하는 7 개월 된 마우스의 중뇌 및 요추 척수에서 인산화 된 α-시누클레인의 검출을 입증합니다 (그림 6).
A53T 돌연변이는 상염색체 우성 파킨슨병(PD) 환자에서 과대대표된다. 더욱이, A53T 돌연변이를 갖는 인간 α-시누클레인은 마우스 6,7에서 발현될 때 인간 PD의 많은 특징을 재분석할 수 있다. 세린 129 잔기에서의 α-시누클레인의 인산화는 생체내 및 시험관내에서 α-시누클레인 응집을 유도하는 것으로 나타났다8. Lewey body는 PD 또는 Lewey body dementia9 환자에서 존재하는 고전적인 조직학적 발견이다. Lewey 바디에 존재하는 α-시누클레인의 대부분은 세린 12910,11에서 인산화된다. 결과적으로, 인산화된 α시누클레인의 축적은 PD 병리학의 조직학적 중증도의 마커로서 사용된다. 본 연구는 인산화된 α-시누클레인이 인간 A53T α-시누클레인을 발현하는 7개월 된 무증상 마우스에 비해 15.5개월 된 증상 마우스에서 상당히 높은 수준으로 축적된다는 것을 발견하였다. 이것은 척수의 전방 뿔과 이들 마우스의 중뇌에서 세포 병리학의 풍부함을 설명하는 보고서와 일치합니다. 6 이로부터, 여기에 설명된 단순화된 관류 방법은 하류 조직학적 특성화를 위한 CNS 조직의 고품질 고정을 제공한다는 결론이 내려진다.
<img alt="형광 현미경; α-시누클레인 A53T, 중뇌, 요추; DAPI, PS129 염색." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63386/63386fig06.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> 도 6: 파킨슨병의 마우스 모델에서 중뇌 및 요추 척수 조직에서 인산화된 α-시누클레인에 대한 표지. 노화된(15.5개월령) 말기 마비된 마우스는 7개월 된 건강한 마우스와 비교된다. 두 마우스 모두 파킨슨병과 같은 병리를 유도하는 인간 α-시누클레인의 미스폴딩되기 쉬운 돌연변이 변이체(A53T)를 발현한다. 스케일 바 = 100μm(상부 패널) 및 50μm(하부 패널). 약어: α syn-A53T = α-시누클레인의 A53T 변이체; DAPI = 4',6-디아미디노-2-페닐인돌; PS129 = α-시누클레인의 인산화된 세린 129. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63386/63386fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

마우스 중추 신경계의 조직학적 분석을 위한 편리한 중력 공급 관류 방법이 제시된다. 인산화된 α시누클레인의 면역형광 검출은 파킨슨병의 마우스 모델에서 입증된다. 이 연구는 또한 심질 관류, 해부, 조직 동결 / 임베딩 및 냉동 절개 단계를 포괄적으로 설명합니다.

The histologic analysis of brain and spinal cord specimens isolated from mice is common practice for the assessment of pathology in this model system. To ...

이 프로토콜은 상당한 투자 없이 CNS 조직의 조직학적 연구를 가능하게 하는 마우스에서의 고정적 관류의 간단한 방법을 제공한다. 여기에 제시된 중력 관류 방법의 주요 장점은 확산 장치가 쉽게 이용 가능한 구성 요소로 구성 될 수 있다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 Xin Jie Chen 박사의 실험실에서 MD-PhD 학생 인 Arnav Rana가 될 것입니다.시작하려면 날카로운 면도날을 사용하여 두 개의 500 밀리리터 세척 병에서 내부 빨대를 뚜껑의 나사 안쪽으로 플러시로 절단하여 다듬습니다. 각 버퍼 병의 바닥에 네 x 네 센티미터 정사각형 구멍을 자른 다음 구부러진 스테인레스 스틸 마이크로 주걱을 통과 할 수 있도록 각 병 바닥에 또 다른 작은 구멍을 자릅니다. 다음으로, 마이크로 주걱에 S 자형 굴곡을 만들어 버퍼 병을 매달기위한 후크로 사용할 수 있도록하십시오.구부러진 마이크로 주걱을 버퍼 병의 적절한 구멍에 넣으십시오. 그런 다음 25cm 길이의 튜브 두 개를 외부 병 짚 배출구와 단단히 연결하고 Y 커넥터와 함께이 튜브의 끝을 결합 한 다음 2 미터 길이의 튜브를 Y 커넥터의 자유 끝에 결합하십시오. 1 밀리리터 주사기에서 플런저를 제거한 후 먼저 면도날로 플라스틱을 채점한 다음 주사기 플라스틱을 날카롭게 스냅하여 팁에서 약 6cm 떨어진 곳에 주사기를 자릅니다.주사기의 절단면을 플라스틱 튜브의 자유 끝에 충분한 깊이로 삽입하고 밀봉을 단단히 고정하십시오. 다음으로, 하나의 완충 병을 PFA로 라벨링하고 다른 하나는 PBS로 라벨링하십시오. 병 개구부에서 약 1/3 떨어진 길이를 측정하고이 시점에서 병 둘레 주위에 선을 그려 향수 용액의 적절한 충전 수준을 나타냅니다.큰 종이 클립을 곧게 펴고 튜브의 둘레 주위에 들어갈 수있는 루프를 만들고 주사기에 바로 근접한이 루프를 튜브 주위에 놓은 다음 적절한 크기의 스티로폼 블록을 유리 트레이에 놓고 종이 클립의 끝을 스티로폼 블록에 넣어 튜브를 부착하고 종이 타월을 사용하여 유리 트레이의 앞쪽 끝을 약 2 센티미터 정도 올립니다. 1 리터 비커를 증류수로 헹구고 나서 약 800 밀리리터의 18 밀리옴 분자 생물학 등급 물로 채 웁니다. 비커를 전자 레인지에서 3 분 동안 가열하거나 수온이 섭씨 65도에 도달 할 때까지 가열 한 다음 흄 후드에 보관 된 가열 또는 교반 플레이트 위에 놓습니다.다음으로, 교반 막대를 증류수로 헹구고 비이커에 넣으십시오. 교반기를 시작하고 핫 플레이트를 중간 열로 돌려 수온이 섭씨 70도를 넘지 않도록하십시오. 외과 용 마스크, 장갑 및 실험실 코트를 착용 한 후 PFA 분말 40g을 측정하여 가열 된 물에 넣은 다음 이송 피펫을 사용하여 용액에 5 몰 수산화 나트륨 몇 방울을 첨가하십시오.분말이 완전히 용해되도록 하십시오. 분말이 완전히 용해되지 않은 경우 필요에 따라 수산화 나트륨을 더 첨가하십시오. 모든 PFA가 거의 용해되면 교반 및 가열을 중단하고 즉시 10x PBS 100 밀리리터를 첨가 한 다음 18 밀리옴 분자 생물학 등급 물을 사용하여 비커를 1 리터 마크로 충전하십시오.비커를 플라스틱 랩으로 덮고 용액이 실온에 도달 할 때까지 영하 20도 냉동실에 보관하십시오. 적절한 표준을 사용하여 pH 미터를 교정 한 후, 비커가 교반 플레이트 상에있는 동안 용액의 pH를 측정하십시오. pH가 7.4에 도달 할 때까지 염산을 첨가하십시오.pH가 너무 낮으면 5몰 수산화나트륨을 첨가하여 pH를 증가시킨다. 다음으로, 진공 플라스크를 진공에 연결하고 플라스크에 여과지가있는 깨끗한 세라믹 Buchner 깔때기를 놓습니다. 진공을 켠 후 4 % PFA 용액으로 채워진 전사 피펫을 사용하여 여과지를 적신 다음 모든 용액이 여과 될 때까지 용액을 여과지에 천천히 붓습니다.여과 후, 용액을 사용할 때까지 섭씨 4도의 빛 보호 용기에 보관하십시오. 흄 후드에 스티로폼 해부 블록을 유리 트레이에 놓습니다. 해부 블록에 수술 중 마우스를 제지하기 위해 다섯 개에서 여섯 개의 짧은 바늘이 있고 관류 튜브를지지하는 두 개의 긴 바늘이 있는지 확인하십시오.다음으로, 관류 장치를 증류수로 헹구십시오. 모든 물이 배수된 후, 관류될 동물 위에 1미터 높이의 증식병을 걸어놓고, 분자생물학등급의 물로 희석된 10x PBS를 사용하여 멸균되지 않은 1x PBS를 제조하였다. 지혈제를 사용하여 관류 장치의 메인 라인을 클램프 한 다음 PFA 라인을 다른 지혈제로 클램프하십시오.완충 용기를 PBS로 충전한 후, 관류 장치의 주사기 말단을 비이커에 넣어 폐기물 버퍼를 수집하고 본선을 폐색시키는 지혈제를 제거한다. PBS가 라인을 통해 흐르는 동안 튜브의 벽을 힘차게 탭하여 갇힌 공기를 제거하십시오. 버퍼와 메인 라인에서 모든 공기가 제거되면 메인 라인에 지혈제를 배치하여 흐름을 막으십시오.다음으로, PFA 라인으로부터 지혈제를 제거하여, PBS가 PFA 라인 내의 임의의 기포를 두드리면서 PFA 병까지 역행 방식으로 유동하도록 허용한다. 병의 개구부 바로 위에서 볼 수 있을 때까지 PBS를 PFA 라인 내로 계속 허용하고, 이어서 PFA 병 내로의 PBS의 유동을 중단시키기 위해 지혈제로 PFA 라인을 폐색시킨다. 다음으로, 나비 주입 바늘을 관류 주사기에 연결하고 메인 라인 지혈제를 열어 PBS를 라인을 통해 플러시하고 관류 주사기에서 기포를 제거한다.거품이 제거 된 후 메인 라인 지혈제를 닫으십시오. PBS 병이 이제 PBS로 약 1/3 가득 차 있는지 확인하십시오. 필요한 경우 메인 라인을 통해 PBS를 플러시하거나 전체 용량의 1/3이 될 때까지 버퍼 병에 더 많은 PBS를 채 웁니다.PBS, PFA 및 메인 라인에서 모든 기포가 제거되면 병의 검은 색 표시까지 실온에서 4 % PFA 용액으로 PFA 병을 채 웁니다. 다음으로, 필요한 도구를 먼저 물로 닦은 다음 70 % 에탄올로 비 생존 수술을 준비하십시오. 마취된 C57 블랙 6J 마우스를 스티로폼 블록에 고정시킨 후, 피부 포셉으로 복부 피부를 들어 올리고 큰 가위로 복벽을 절단하여 수술을 시작하십시오.복부를 간쪽으로 우월하게 자른 다음 전방 복벽에서 간을 분리하고 횡격막 쪽으로 우월하게 초기 절개를 계속하십시오. 절개가 횡격막에 도달하면 미세 해부 가위를 사용하여 횡격막에 구멍을 뚫고 마우스 오른쪽의 갈비뼈를 오른쪽 겨드랑이의 절반 정도를 자른 다음 횡격막의 왼쪽을 통해 거의 모든 방법을 왼쪽 겨드랑이까지 비슷하지만 더 긴 절개를하십시오. 가슴 벽을 반사하고 스티로폼 블록에 고정하십시오.좌심실을 확인한 후 미세한 곡선 포셉을 사용하여 가벼운 압력으로 심장을 일정하게 잡은 다음 PBS가 바늘을 통해 흐를 수 있도록 메인 라인 지혈제를 열고 즉시 바늘로 좌심실을 관통합니다. 바늘이 심실에 0.5 센티미터 이상 삽입되지 않도록하십시오. 다음으로, 두 개의 큰 18 게이지 바늘이있는 스티로폼으로 만든 X에 나비 튜브를 놓습니다.열등한 정맥 카바가 간을 빠져 나와 미세 해부하는 가위를 사용하여 횡단하는 것을 확인하십시오. 열등한 베나카바로부터 유출된 액체가 혈액이 없을 때까지 PBS 관류를 계속하고, 이어서 신속하게 작동시키고, 지혈제로 PBS 라인을 폐색시키고 PFA 라인을 개방한다. 꼬리가 말리기 시작할 때까지 PFA가 몇 분 동안 관류되도록 허용하십시오.꼬리가 말리기 시작하면 50 분 타이머를 시작하십시오. 50 분 후, 지혈제로 메인 라인을 폐색하고 좌심실에서 바늘을 뽑습니다. 다음에, 마우스를 밤새 섭씨 4도에서 PFA 용액의 표지된 용기에 넣는다.고품질 관류는 간, 척수 및 깊은 중추 신경계 구조에 혈액이 없음으로 나타납니다. 뇌에서 관찰 된 혈액은 두개골과 경막 사이에 위치하므로 품질이 좋지 않은 관류에 문제가 없거나 암시하지 않습니다. 이 관류 방법에 따른 알파 시누클레인의 검출은 인산화된 알파-시누클레인이 인간 A53T 알파-시누클레인을 발현하는 7개월 된 무증상 마우스에 비해 15.5개월 된 증상 마우스에서 유의하게 더 높게 축적된다는 것을 보여준다.이 결과는 척수의 전방 뿔과 이들 마우스의 중뇌에서 세포 병리학의 풍부함을 설명하는 보고서와 일치합니다. 흉강에 접근 할 때 복부 장기를 절단하지 않는 것이 중요합니다. 또한, 관류 바늘은 좌심실 내에 너무 깊이 배치되어서는 안됩니다.

a-gravity-fed-transcardial-perfusion-method-for-histologic-analysis

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리는 두뇌 섹션 sectioning 마우스, 제거 및 sectioning 뇌뿐만 아니라, immunoperoxidase의 얼룩, 수지 포함하고, ultrathin의 transcardiac 재관류에 대한 프로토콜을 설명합니다. 이러한 절차가 완료되면 immunostained 자료 전송 전자 현미경과 함께 시험에 대한 준비가되었습니다.

Immunoelectron 현미경을위한 마우스 뇌 조직의 준비

출처: Schönherr, S., et. al. 마우스 편도체에서 글루타메이트 수용체의 입력 특이적 배열을 조사하기 위해 광유전학 및 동결 파괴 복제 면역 라벨링을 결합했습니다. J. Vis. 특급. (2016)이 비디오는 전자 현미경을 위한 마우스 뇌 조직의 동결 파괴 복제본의 면역 라벨링을 보여줍니다. 파쇄되고 코팅된 복제품은 수용체를 노출시키기 위해 소화됩니다. 1차 및 골드 태그가 지정된 2차 항체를 추가하여 특정 신경세포막 수용체를 표지합니다. 복제본은 그리드에 장착되고 전자 현미경으로 시각화됩니다.

Immunolabeling of Neuronal Membrane Proteins in a Freeze-fractured Specimen of Mouse Brain Tissue

성인 세 마우스의 단일 뉴런의 활동은 특정 뇌 영역에서 신경 세포를 해리와 형광 막 잠재적 인 염료 이미징을 사용하여 공부하실 수 있습니다. 포도당의 변화에​​ 시험 응답으로,이 기술은 성인 ventromedial 시상 하부 뉴런의 포도당 민감성을 연구하는데 사용될 수있다.

막 성인 쥐에서 Ventromedial 시상 하부 뉴런의 잠재적 인 염료 이미징은 포도당 감지를 연​​구하는

초기 뇌 종양 미세 환경에 진입 면역 세포의 수와 활성 상태에서 시간에 따른 양적 데이터를 산출 교종 함침 말초 혈액 단핵 세포의 분리 및 유세포 분석을위한 간단한 방법이 여기에서 제시 하였다.

분리 및 신경 교종-침투 말초 혈액 단핵 세포의 유세포 분석

이 프로토콜은 유행 세포 계측법에 의한 성체 마우스 중추 신경계에서 대 식세포 모집단의 분석을 제공하며, 이들 세포에 의해 표현되는 다중 마커의 연구에 도움이됩니다.

유동 세포 계측법에 의한 중추 신경계에서 유래 된 대장 세포 및 단구 세포 유래 대 식세포의 분석

전송 전자 현미경 검사 법 및 utero에서 변환의 조합을 개발 하는 동안 신경 시스템의 정밀한 열 대권 외의 형태학 적 변화를 공부에 대 한 강력한 접근 이다. 이 결합 된 메서드는 그들의 지형 표현에 관하여 neuroplasticity 기본 구조 세부 사항에 변화에 대 한 깊은 통찰력을 수 있습니다.

평가의 개발 쥐의 뇌와 척수의 Utero 변환 후 Ultrastructural Neuroplasticity 매개 변수

우리는 마우스 두뇌 또는 척수에서 검색된 동시에 다른 세포 모형을 확인하기 위하여 교류 세포측정 방법을 제시합니다. 이 방법은 신경 퇴행성 질환에서 순수 한 세포 집단을 분리하거나 특성화하거나 바이러스 벡터 또는 나노 입자의 생체 내 투여 시 세포 표적화의 정도를 정량화하기 위해 악용 될 수 있습니다.

다른 균질화 방법을 통해 마우스 뇌 / 척수에서 검색 된 여러 세포 유형의 동시 유량 세포 측정 특성 분석

프로토콜은 방광, 전립선, 성기관, 뼈, 근육 및 발 피부를 포함한 마우스 하반신의 시상 수혈에 대해 설명된다.

마우스에서 하복부 장기 및 뒷다리의 시투 폐쇄 회로 관류 에 설립

우리는 선행 관류 기술에 의해 고품질의 개별 마우스 심장 세포를 격리하기위한 simple 방법을 개발했습니다. 이 방법은 Langendorff가 없으며 심실 및 심방 심근 세포 또는 심장 섬유아세포 또는 선조와 같은 간질 세포를 분리하는 데 유용합니다.

마우스에서 심근세포 절연을 위한 영양 관류 방법

이 프로토콜은 관류, 뇌 단면, 자유 부동 면역 염색, 조직 마운팅 및 이미징을 포함한 마우스 뇌 조직학 연구를위한 효율적이고 재현 가능한 접근 방식을 설명합니다.

마우스 뇌의 자유 부동 면역 염색

이 연구는 고립된 뇌 미세아교세포에서 핵내 유세포 분석을 사용하여 전역 히스톤 변형의 정량화를 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 작업에는 데이터 수집에 사용된 미세아교세포 격리 프로토콜도 포함되어 있습니다.

분리된 마우스 뇌 미세아교세포에서 핵내 유세포 분석을 사용한 글로벌 히스톤 번역 후 변형의 정량화

학습하세요 중력 공급 심질 관류법을 이용한 마우스 중추 신경계 조직학 분석 방법을. 파킨슨병 모델에서 인산화 알파-시누클레인 면역형광 검출이 가능하며 비용 효율적인 조직 고정 프로토콜을 제공합니다.

마우스 중추 신경계의 조직학적 분석을 위한 중력 공급 심질 관류 방법

더 많은 동영상 탐색