시험관 내에서 약물 유발 간 독성 평가를위한 인간 간 미세 생리 학적 시스템

이 프로토콜은 최대 4 주 동안 고기능 및 대사 활성 간 미세 조직을 유지할 수있는 미세 생리 학적 시스템을 사용하여 시험관 내에서 약물 유발 간 손상을 평가하는 방법을 설명합니다. 이 접근법은 새로운 화합물에 대한 약물 유발 간 손상 책임을 정확하게 검출하기 위한 인간 특이적 세포 배양 모델로, 단순한 2D 배양 또는 훨씬 더 복잡한 3D 배양보다 더 예측 가능합니다. 이 기술은 화합물이 임상 개발을 시작하기에 안전한지 여부를 결정하기 위한 전임상 안전성 테스트 배터리의 일부로 사용할 수 있습니다.

다양한 양식을 테스트할 수 있습니다. 컨트롤러를 세포 배양 인큐베이터의 도킹 스테이션 하우스에 연결하여 간 미세 생리 학적 시스템 설정을 시작합니다. 컨트롤러 뒷면에 있는 건조제 용기에 새 건조제가 추가되었는지 확인합니다.

보트 로커 스위치를 눌러 컨트롤러를 켠 후 시스템이 안정화되고 압력에 도달할 때까지 5분 동안 기다립니다. 포장에서 각 플레이트를 꺼냅니다. 다음으로, 500 마이크로 리터의 사전 예열 된 파종 고급 DMEM 배지를 저수지 측에 추가하여 각 웰을 프라이밍합니다.

드라이버를 인큐베이터의 도킹 스테이션에 놓습니다. 완료되면 유체가 필터 지지대를 통과할 때까지 컨트롤러 화면에서 프라임 프로그램을 선택합니다. 표면 채널을 덮으려면 모든 웰을 1.1 밀리리터의 시드 고급 DMEM 배지로 채 웁니다.

플레이트가 있는 드라이버를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%의 인큐베이터에 넣은 후 도킹 스테이션을 연결하고 인큐베이트 프로그램을 실행합니다. 작은 얼음 조각만 남을 때까지 섭씨 37도의 수조에 바이알을 담아 PHH와 HJC의 바이알을 해동합니다. 해동되면 최대 2개의 PHH 바이알을 예열된 동결 보존 간세포 회수 배지인 CHRM 배지의 튜브에 직접 부드럽게 피펫팅합니다.

그런 다음 1 밀리리터의 CHRM을 사용하여 저온 튜브에서 나머지 세포를 세척하십시오. HKC를 극저온관에서 50밀리리터 원심분리 튜브에 있는 10밀리리터의 얼음처럼 차가운 파종 고급 DMEM 배지에 부드럽게 피펫팅합니다. 이후, 두 세포 유형을 별도로 실온에서 100회 G에서 10분 동안 원심분리한다.

원심분리 후, 상청액을 제거하고, 튜브에 첨가된 세포의 바이알 당 1 밀리리터를 사용하여 따뜻한 시딩 고급 DMEM 배지 및 HKCs를 따뜻한 시딩 고급 DMEM 배지에 HKCs에 재현탁시킨다. 부드러운 흔들림 동작으로 세포를 다시 현탁시킨 다음 얼음 위에 놓습니다. 일시 중지되면 세포를 세고 생존력을 기록하십시오.

세포 생존율은 85% 이상이어야 합니다. 다음으로 도킹 스테이션에서 드라이버를 분리하고 드라이버를 미생물 안전 캐비닛 또는 MBSC에 넣습니다. 그런 다음 스캐폴드 위에서 정지 지점, 채널 및 저장소로 배지를 흡입하여 배양 우물에 0.2밀리리터의 죽은 부피를 남겨두고 스캐폴드 바로 위에 도달합니다. 드라이버를 인큐베이터의 도킹 스테이션으로 되돌리기 전에 400마이크로리터의 시딩 고급 DMEM 배지를 웰 챔버에 추가하고 배지 교환 프로그램을 3분 동안 실행합니다.

3분 후 도킹 스테이션에서 드라이버의 연결을 끊고 드라이버를 MBSC에 다시 넣습니다. 위의 스캐폴드에서 각 웰의 정지 지점과 저장소 끝까지 배지를 흡인한 다음 튜브를 부드럽게 흔들어 PHH를 다시 현탁하고 필요한 부피의 세포 현탁액을 각 배양 웰에 추가합니다. 세포 현탁액을 조심스럽게 피펫팅하여 플레이트 스캐폴드에 걸쳐 세포가 고르게 분산되도록 합니다.

HKC를 조심스럽게 다시 현탁시키고 세포 현탁액을 각 배양 웰에 추가합니다. 모든 웰에 두 가지 세포 유형이 모두 포함되어 있으면 물리적으로 연결하지 않고 미생리학적 시스템 또는 MPS 드라이버를 인큐베이터의 도킹 스테이션에 놓고 1시간 동안 그대로 두십시오. 1시간이 지나면 드라이버를 도킹 스테이션에 연결하고 시드 프로그램을 실행합니다.

프로그램이 2 분 후에 자동으로 일시 중지되면 인큐베이터에서 드라이버를 제거하고 1, 000 마이크로 리터의 시드 고급 DMEM 배지를 채널에 천천히 추가하여 총 부피 1.4 밀리리터를 달성합니다. 나중에 플레이트를 인큐베이터로 옮기고 나머지 시드 프로그램을 8 시간 동안 실행하십시오. 넷째 날에는 컨트롤러에서 프로그램을 일시 중지하고 도킹 스테이션에서 드라이버와 플레이트를 분리합니다.

MBSC로 전송합니다. 피펫을 사용하여 스캐폴드를 만져 세포 배양을 방해하지 않고 가용성 바이오마커 분석을 위해 각 웰에서 약 1밀리리터의 배지를 수동으로 수집합니다. 수집된 배지에 4일차 샘플로 라벨을 붙이고 품질 관리 검사로 젖산 탈수소효소 및 요소 분석을 실행하여 파종이 성공적인지 확인합니다.

다음으로, 배지 변경을 수행하여 플레이트 계획에 따라 각 웰을 투여한다. 완료되면 드라이버를 인큐베이터의 도킹 스테이션으로 되돌리고 인큐베이트 프로그램을 실행합니다. 6일째에 도킹 스테이션에서 드라이버와 플레이트를 분리하고 MBSC로 전송합니다.

피펫을 사용하여 각 웰에서 약 1밀리리터의 배지를 수집하고 투여 후 48시간 샘플로 라벨을 붙이고 이후 분석을 위해 샘플을 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 여덟 번째 날에, 한 쌍의 핀셋을 사용하여 플레이트에서 스캐폴드를 제거하고, 마이크로 조직을 방해하지 않고 각 웰에 칼슘과 마그네슘이 없는 500마이크로리터의 DPBS를 함유하는 24웰 플레이트에 스캐폴드를 배치한다. 각 스캐폴드의 스냅샷을 도립 광학 현미경으로 10배 배율로 촬영합니다.

4일째, 약물 투여 전에 LDH 방출 및 요소 합성과 함께 형성된 간 미세 조직의 품질 관리 검사를 수행했습니다. 8일째에, 다수의 건강 및 간 측정변수, 예컨대 알부민, 요소, CYP 3A4, ATP를 평가하여 미세조직에서 높은 수준의 간 기능 및 재현성을 확인하였다. 간 미세조직에서의 조영제 현미경 검사 및 IF 염색은 PHH 미세조직에서 HKCs의 균일한 분포를 밝혀냈다.

트로 글 리타 존에 대한 간 미세 조직의 급성 노출은 알라닌 아미노 전이 효소 또는 ALT에 의해 검출 된 독성을 유발하고 LDH 방출 및 알부민 및 요소 생산의 급격한 감소를 유발했습니다. ATP 함량과 CYP 3A4 활성은 트로글리타존에 의한 독성을 확인하였으며, EC50 값은 다른 종점과 매우 유사하였다. MPS에서 8일 배양 후 촬영한 명시야 현미경 이미지는 비히클 대조군의 스캐폴드 전체에 균일하게 시딩된 건강한 간 미세 조직을 보여줍니다.

조직 사멸 또는 분해는 양성 대조군 및 트로글리타존으로 처리된 복제물에서 관찰되었다. 또한 피오글리타존 노출 후 간 독성도 조사되었습니다. LDH 또는 ALT 방출은 검출되지 않았지만 48 시간 후에 알부민 및 요소 생성의 경미한 감소가 관찰되었습니다.

ATP 함량의 경미한 감소는 높은 피오글리타존 농도에서 관찰되었다. EC50 값은 용량 반응 곡선으로부터 생성되었다. 현미경 검사는 두 가지 가장 높은 테스트 농도에서 피오글리타존에 96시간 노출된 후 약간의 미세 조직 변화를 나타냈습니다.

이 연구에서 85 % 이상의 우수한 품질과 생존력을 갖는 세포의 사용은 미세 생리 학적 시스템에서 고기능의 건강한 3D 미세 조직을 생성하는 데 필수적입니다. 이 절차에 따라 간 실질 및 비 실질 세포의 삼중 배양을 사용하는 비 알코올성 델타 간염 또는 비 알코올성 지방간 질환 모델과 같은 질병 모델에서 아데닌 및 약물-약물 상호 작용 및 약물 유발 간 손상을 평가할 수 있습니다.