오픈 소스 피펫팅 로봇을 활용한 효율적인 SARS-CoV-2 정량적 역전사효소 PCR 타액 진단 전략

우리는 대규모 커뮤니티 스크리닝 응용 프로그램을 위해 구현하고 확장하기 쉬운 저렴한 타액 기반 COVID 19 진단 테스트 및 워크 플로우를 개발했습니다. 여기서 우리는 오픈 소스 액체 처리 로봇, 표준 온도 조절기 및 소프트웨어를 사용하여 추출 또는 안정화 버퍼없이 타액의 직접 테스트를 수행하면서 정확한 진단 결과를 제공합니다. 자동화된 병렬 워크플로우가 단순하기 때문에 최소한의 장비, 공간 및 인력 요구 사항으로 매일 수천 건의 테스트를 수행하도록 시스템을 확장할 수 있습니다.

카일리 킹 외에도 임상 실험실 감독자이자 오스틴 스마더스 교육 코디네이터인 레이첼 햄(Rachel Ham)은 70% 에탄올로 타액 수집 튜브 외부를 오염제거하고 테스트를 위해 실험실로 옮겨 시작하는 절차를 시연하는 데 도움을 줄 것입니다. 각 샘플 바코드를 일일 섭취량 스프레드시트로 스캔하여 샘플 도착을 기록합니다. 스캔된 샘플을 섭씨 95도 오븐에서 30분 동안 열처리한 다음, 내열 장갑을 사용하여 샘플을 제거하였다.

샘플 할당 스테이션에서 각 샘플 로딩 로봇에 대한 일일 샘플 로딩 스프레드시트를 엽니다. 그런 다음 각 384 웰 플레이트에 188 개의 샘플을 할당하십시오. 트레이에 플레이트 이름, 날짜 및 분기 번호로 레이블을 지정합니다.

샘플을 순서대로 스캔하여 샘플 로딩 스프레드시트로 들어갑니다. 샘플 로딩 스테이션에서 로봇의 데크 배치에 해당하는 여덟 개의 3D 프린트 랙으로 구성된 두 개의 전체 세트를 정렬합니다. 쿼터 1개의 튜브의 캡을 풀고 랙 1의 A1 위치부터 시작하여 3D 프린트된 랙에 놓습니다.

각 랙을 왼쪽에서 오른쪽으로, 위에서 아래로 채웁니다. 이 로딩 패턴을 랙 두 개에서 계속한 다음, 랙 네 개와 다섯 개로 진행하십시오. 적재된 쿼터 하나의 샘플 랙을 데크에 1개, 두 개, 네 개, 다섯 개, 일곱 개, 여덟 개, 10개, 11개 배치합니다.

P20 팁을 세 개와 아홉 개의 갑판에 놓습니다. 설정 프로세스를 단순화하려면 로봇에 재료를 앞뒤로 로드합니다. 마스터 믹스 플레이트는 전용 로봇에서 생산되며 섭씨 네 도에 보관됩니다.

한 번에 하나의 플레이트가 사용되며 플레이트 이름이 표시되어 있으며 날카로운 블레이드를 사용하여 제어 웰 주변의 호일에 선을 자릅니다. 마스터 믹스 플레이트를 데크 여섯 개에 놓고 호일 커버를 벗겨 내고 컨트롤 웰을 덮고있는 작은 사각형을 남겨 둡니다. 팁 박스를 발견하고 로봇을 닫습니다.

로봇 데스크톱 응용 프로그램을 통해 실행 시작을 클릭하여 사용자 지정 Python 운영 프로토콜을 초기화합니다. 매 분기마다 플레이트에로드하는 데 24.5 분이 걸립니다. 타이머를 미리 알림으로 설정합니다.

로봇이 작동하는 동안 두 개의 샘플 튜브를 캡을 풀고 두 번째 3D 인쇄 랙 세트에 로드합니다. 로봇이 일시 중지되면 분기 하나의 랙을 제거하고 분기 두 개의 랙으로 교체한 다음 데스크톱 응용 프로그램에서 다시 실행을 클릭합니다. 분기 하나의 샘플 튜브를 요약하여 결과를 기다리는 동안 섭씨 네 도의 냉장고에 보관하십시오.

이 로딩 과정을 분기 셋과 넷에 대해 반복하십시오. 적재 된 플레이트를 바이오 안전 캐비닛으로 옮깁니다. 오염을 최소화하려면 이송 중에 플레이트를 덮어 두십시오.

반복 샘플을 수집하여 네 번째 분기의 마지막 샘플로 할당합니다. 샘플 번호를 매기고 바코드를 스캔한 다음 원래 샘플 위치와 결과를 샘플 로딩 스프레드시트에 입력합니다. 반복 샘플을 바이오 안전 캐비닛으로 옮깁니다.

반복 샘플 튜브를 로봇 로딩 랙에 로드하지 마십시오. 각 반복 샘플의 두 마이크로 리터를 올바른 웰에 피펫하십시오. 지정된 피펫을 사용하여 환자 샘플을 추가합니다.

오염을 최소화하기 위해 샘플을 추가하는 동안 호일로 덮인 제어 웰을 유지하십시오. 포셉을 사용하여 제어 웰 위에 호일 커버를 벗겨냅니다. 확인된 양성 환자 샘플 2마이크로리터를 웰 M23 및 M24에 피펫팅한다.

N23 내지 N24를 웰에 2 마이크로리터의 뉴클레아제 프리 워터와 웰스 O23 내지 O24에 양성 대조군을 혼합한 마이크로리터 당 200 마이크로리터의 피펫. 웰 P23 ~ P24를 비워 두어 마스터 믹스 배치 품질을 모니터링합니다. 플레이트를 광학적으로 투명한 씰로 덮고 어플리케이터 롤러를 사용하여 모든 웰에 씰을 부착하십시오.

플레이트를 2, 500 RPM에서 30초 동안 볼텍스하여 완전히 혼합한 다음, 플레이트를 500배 G에서 1분 동안 원심분리한다. thermocycler 소프트웨어에서 프로토콜 프로그램을 선택하고 향후 플레이트를 위해 프로토콜을 저장하십시오. 밀봉 된 플레이트를 열 순환기에 놓고 프로토콜을 실행하십시오.

CT 값을 내보내고 값을 샘플 로딩 스프레드시트에 복사합니다. 양성 대조군의 경우, 적어도 하나의 양성 대조군 웰이 P1 및 N1 프로브 모두에 대해 22에서 28 사이의 CT 값을 생성하는지 확인하십시오. 대안적으로, 공지된 양성 샘플 웰은 P1 및 N1 프로브 상에서 33 미만의 P1 및 N1 CT 값을 생성한다.

음성 대조군의 경우 두 개의 음성 대조군 웰 중 하나에 N1 또는 P1 CT 값이 없는지 확인하십시오. 플레이트를 무효화하기 전에 CT 값에 유효한 증폭 곡선이 있는지 확인합니다. P1이 CT의 결과를 33보다 적게 생성하는 경우, 유효함을 고려하고 N1의 결과로 진행하십시오. P1이 CT가 33보다 크거나 같거나 CT 값이 없는 결과를 생성하는 경우 해당 결과가 유효하지 않은 것으로 간주합니다.

N1이 CT의 결과를 33 미만으로 생성하는 경우, 예 뿐만 아니라 도 평가한다. N1이 CT 값을 생성하지 않는 경우, 아니오 뿐만 아니라 도 평가한다. N1이 33보다 크거나 같은 CT 값을 생성하면 별이 없는 상태도 평가합니다.

모든 N1 CT 값이 실제 증폭 곡선과 연관되어 있는지 확인합니다. N1에 대한 CT 값이 증폭 곡선이 없는 경우, 웰은 아니오이다. 반복 샘플을 식별하고 내부 샘플 번호 및 샘플 유형으로 레이블을 지정한 다음 로딩 워크플로로 반환합니다.

대표적인 이미지는 N1 또는 SARS CoV-2 합성 RNA 및 P1 또는 HSRPP30 합성 DNA의 RTQ PCR 검출을 보여준다. 표준 곡선은 이러한 프로브 프라이머 조합을 사용하여 정확한 검출의 범위를 결정하기 위해 표준 편차로 플롯팅되었다. 각각의 희석액에서 수득된 평균 CT 값을 합성 RNA 및 합성 DNA의 추정된 양에 대해 플롯팅하였다.

두 경우 모두에서, 선형 곡선은 광범위한 유전자 카피 농도에 걸쳐 양호한 상관 계수를 보였다. 로봇 및 수동 샘플 로딩 둘 다를 사용하여 독특한 샘플로부터 수득된 N1 CT 값을 수동 로딩과 로봇 로딩 사이의 인터 어세이 가변성을 결정하기 위해 트랜스포즈하였다. 수동 방법과 자동화 된 방법 간의 선형 관계는 두 방법이 기능적으로 동등하다는 것을 나타내는 높은 상관 계수를 생성했습니다.

인트라 어세이 가변성은 또한 로봇 및 수동 샘플 로딩 둘 다로부터 수득된 전이된 복제 N1 CT 값을 사용하여 결정되었다. 타액의 점도 감소를 위한 열처리 방법의 평가가 여기에 제시되어 있다. SARS CoV-2 음성 타액은 단일 공급원으로부터 수집되었고, 분취량은 섭씨 95도에서 0분, 30분 또는 60분 동안 열처리되었다.

각 조건의 기술적 반복실험으로부터의 P1 CT 값을 치료 방법 사이의 가변성을 결정하기 위해 플롯팅하였다. 30분 및 60분 열처리 방법 모두 처리 대조군이 없는 것에 비해 시료 가변성이 현저히 감소하였다. 30분 치료와 60분 치료 사이에는 유의한 차이가 없었다.

따라서 처리 시간을 줄이기 위해 30분 열처리 방법을 구현하였다. 적절한 무균 기술을 사용하여 특히 수동 샘플 및 컨트롤을 적재 할 때 테스트 플레이트의 오염을 최소화하십시오. 손이나 소매로 접시를 건너지 마십시오.

임상 결과가 생성된 후, 샘플은 생물학적 유해성 폐기물에 폐기되거나 특정 균주를 결정하기 위해 전체 게놈 시퀀싱과 같은 추가 분석을 위해 저장될 수 있다. 이 기술을 통해 광범위한 지역 사회 테스트를 통해 검사 적용 범위와 Covid 19의 무증상 확산의 영향을 조사 할 수 있습니다.