Name: 다세포 구상체의 저렴한 산소 현미경 보조 생물 제조 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-06T13:20:00.000+00:00
Duration: 13 min 21 s
Description: 배우세요 다세포 구상체의 산소 현미경 분석 방법을 형광 현미경을 활용하여. 이 프로토콜은 생체 인쇄 및 조직 공학 연구에 활용 가능한 고효율 구상체 생성 기술을 제공합니다.

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이 작업은 겐트 대학 (BOF/STA / 202009/003)의 특별 연구 기금 보조금과 EU FP7 ITN 프로그램 "Chebana", 보조금 계약 번호 264772 (AVK의 경우)에 의해 지원되었습니다. 요청시 데이터를 사용할 수 있습니다. 바이오 프린팅을위한 G 코드는 공유에 사용할 수 있습니다.

저자는 공개 할 것이 없습니다.

중요성. 조직 산소화 측정은 세포 및 조직 특이적 신진 대사, 조직 성장 및 발달, 생존력, 종양 발생 및 세포 이동, 미생물 및 기타 병원체와의 상호 작용에 대한 통찰력을 제공합니다. 제시된 방법은 다세포 스페로이드 배양의 생리학을 더 잘 이해하기위한 새로운 도구를 제공합니다 : 비율계량 나노 입자O2 프로브를 사용한 산소화 분석 및 저산소증을 평가하고, 특정 에너지 생산 경로에 대한 의존도를 시각화하고, 모델링 연구 및 대체 대사 이미징 접근법을 보완하는 수단을 제공합니다43,44 널리 이용 가능한 저비용 형광 현미경에. 비율계량 측정은 형광 광장(펄스 LED 여기 선호), 레이저 스캐닝 공초점, 라이트 시트 및 2광자 현미경에서 수행할 수 있으며, 이상적으로는 T 및O2 인큐베이터 챔버가 장착되어 있습니다. 중요하게도, 제시된O2 현미경 측정은 다양한 생리적 파라미터 및 세포 추적기 (이종 세포 스페로이드 배양의 경우), 생존력 (라이브 / 데드 염색), 지질 대사 (지질 감지 형광 프로브), pH의 역학 (염료, 나노 입자 및 형광 단백질) 또는 [Ca2+]의 라이브 다중 파라미터 분석과 쉽게 결합 될 수 있습니다. ], 사용 가능한 형광 스펙트럼 채널에서 또는 병렬로 수행되어, 구상체, 생체인쇄 구축물 및 잠재적 조직 이식에서의 실시간 세포 기능에 대한 확장된 보기를 제공한다.
스페로이드 배양은 암 세포, 종양 및 줄기 세포 틈새 미세 환경, 종양, 약물 효율 및 독성 스크리닝에 대한 연구에서 사용되며, 실제로 조직 생물 제조 및 자기 조립을위한 조직 빌딩 블록으로사용됩니다 45. 이들은 다양한 상이한 접근법(46)에 의해 다수의 세포 유형으로부터 생성될 수 있다. 스페로이드 모델의 인기는 연구 무결성과 데이터 분석의 개선의 관점에서 표준화를 필요로하며, 이는 최근 첫 번째 스페로이드 데이터베이스8의 개발에 의해 시도되었습니다.
우리의 프로토콜은 살아있는 스페로이드 대사를 더 잘 이해하고,이 실험 모델을 표준화하며, 생체 인쇄 및 이식 가능한 재료 내에서 장기적인 안정성, 재현성 및 생존력을 향상시키는 데 도움이 될 것으로 기대됩니다.
수정. 이 프로토콜은 산소화 분석을 위한O2 프로브 로딩된 구상체의 고수율 생성을 위한 마이크로패턴화된 아가로스 저부착성 표면(마이크로몰드 기반 형성29)의 사용을 기술한다. 매달린 방울, 초저 부착 플레이트의 적용, 지질 코팅 또는 자유 부유 형성과 같은 스페로이드 생산의 대안적인 방법은 또한 제안된O2 프로브 로딩 프로토콜과 양립가능하다. 제시된 프로토콜은 hDPSC 구상체 및 hDPSC와 HUVEC (1:1)의 공동 배양 구상체에 대해 최적화되었다. 다른 세포주는 확실히 적용 가능하다 15,17,47,48; 그러나, 일부 프로토콜 최적화는 상이한 세포 부착 특성, 배양 조건, 대사 기질 요건 및 나노입자 염색과의 세포 상용성으로 인해 요구될 수 있다. 적합한 비율계량 나노입자 기반 O2 민감성 프로브의 선택은 특정 세포 모델에 따라, 그리고 사용된 현미경 설정에서의 프로브 광표백 특성(광원의 강도 및 유형, 카메라의 스펙트럼 감도) 및 프로브의 상응하는 기준 및O2 민감성 스펙트럼 채널에 대한 적절한 여기/방출 필터의 가용성에 따라 수행되어야 한다.
일부 비측정법O2 프로브는 상업적으로 입수가능한2. 대안적으로, 이들은 다른 곳에 기재된 바와 같은 중합체를 갖는 기준 및O2 민감성 염료의 공침에 의해 사내에서 제조될 수 있다24,25,49. 각 개별 모델에 대해 적절한 프로브 및 최적의 현미경 조건을 결정하고 비율계량 측정 중에 프로브 광표백 또는 광유도O2 소비의 영향을 최소화하기 위해 예비 테스트를 수행해야합니다. O2 감지 나노 입자에 대한 이전의 연구는 낮은 세포 독성을 입증하여 광범위한 염색 농도 (1-20 μg / mL)에 적용 할 수있었습니다. 일부 양이온성 나노 입자는 저장 중에 자체 응집 될 수 있으므로 스페로이드 형성에 대한 잠재적 영향을 최소화하기 위해 로딩 농도를 가능한 한 낮게 유지하는 것이 좋습니다. 임의로, 나노입자 현탁액은 현탁액으로부터 모든 응집체를 제거하기 위해 사용 전에 여과 (0.2 μm) 또는 원심분리 (10,000 x g, 5 분)에 의해 클리어링될 수 있다.
BioCAD 및 HMI 소프트웨어는 제시된 바이오 프린터에 대해 특이적이지만,이 프로토콜은 바이오 잉크의 제조, 조립, 표준 카트리지의 충전 및 다공성 하이드로 겔 스캐폴드의 설계가 제공되므로 다른 바이오 프린터에 적용 할 수 있습니다. 또한, 인쇄 속도 및 온도와 같은 바이오 프린팅 파라미터는 다른 압출 기반 바이오 프린터에 대해 필적해야합니다. 인쇄 압력과 스트럿 직경은 바늘 유형 및 직경, 바이오잉크 조성, 온도 및 결과 점도에 따라 다르지만 일부 바이오 프린터는 바이오 잉크50을 압출하기 위해 공기 압력 대신 스핀들을 사용하지만 다른 바이오 프린터를 사용하는 Bioprint GelMA 기반 바이오 잉크에 대한 인쇄 매개 변수를 최적화하는 출발점이 될 수 있습니다.
중요한 단계 및 문제 해결. 중요한 단계 중 하나는O2 프로브의 선택이며, 이는 다음과 같은 고려 사항에 기초합니다 : 첫째, 사용 가능한 형광 현미경 설정 (즉, 호환 가능한 여기 광원, 여기 및 방출을위한 필터, 카메라 감도 및 스펙트럼 투과율 및 목표의 수치 개구), 이는 광안정성과 관련하여 사용 가능한 프로브의 수를 제한 할 수 있습니다. 밝기 및 잠재적 인 광독성. 또한 일부 유형의 침지 오일 (오일 침지 목표의 경우)이 적색 및 적외선 형광 신호를 방해 할 수 있다는 점에 유의해야합니다. 우리는 광안정성 테스트가 매우 중요하며 초기 설정 및 예비 테스트 중에 수행되어야한다고 생각합니다. 형광 채널과 다른 염료 사이의 잠재적 인 스펙트럼 누화를 고려해야합니다. 실제로,O2 프로브 및 다른 선택된 염료의 잠재적인 암흑 및 광유도 독성은, 특정 세포 모델과 관련하여, 프로토콜 최적화(51) 동안 평가되어야 한다. 나노입자에 대한 구체적인 문제점은 그들의 자기 응집일 수 있으며, 이는 그들의 작동 농도, 염색 배지의 조성 (예를 들어, 혈청 함량), 배지와 혼합하기 전에 나노입자의 초음파 처리 또는O2-프로브를 사용하여 스페로이드 형성 및 압축화 절차 동안 프로브 로딩 대신에 스페로이드 형성을 위해 세포를 미리 염색하고 세척함으로써 완화될 수 있다.
우리는 설명 된 스페로이드 모델과 함께 광 침투 깊이와 관련된 문제를 관찰하지 못했지만 비율 측정 강도 신호, 스페로이드 및 생체 제작 된 구조물 (조직 이식편)의 크기를 선택하고 각 염료로 세포 염색을 최적화 할 때 고려해야합니다. 적색 및 근적외선 방출 파장이 밀접하게 일치하는 MMIR1 프로브는 다른 적색 / 청색 또는 녹색 방출 형광 바이오 센서 프로브에 비해 가장 낮은 배경과 최상의 조직 광 침투를 제공 할 것으로 예상됩니다.
비율 이미지(및 잠재적으로 스펙트럼 언믹싱 또는 디컨볼루션)의 생산 및 처리는 소프트웨어를 제공하는 공급업체 또는 ImageJ, Fiji52,53, napari(https://napari.org), MATLAB 등과 같은 오픈 소스 옵션에서 수행할 수 있습니다. 중요한 단계는 배경을 빼고 선형 범위에서 신호 강도 변화를 측정하는 것입니다.
O2 프로브의 교정: 로테논 및 안티마이신 A는 각각 미토콘드리아 전자 수송 사슬의 복합체 I 및 III의 억제제이며, 세포 호흡 54,55,15를 차단하고 구상체에서 O2 구배의 소산을 유도하고 환경 O2와의 평형을 유도한다. 따라서, 환경 O2 농도(즉, 20%, 15%, 10%, 5%, 2.5%, 1%, 0%O2)의 변화는 세포에서O2 민감성 프로브의 비율계량 강도 또는 인광 수명 교정을 허용할 것이다. 전형적으로, O2-제어 인큐베이터는 절대 0%O2를 달성할 수 없고, 특정 상황에서, 탈산소화에 대한 프로브의 반응의 신속한 테스트가 요구된다. 이러한 경우, 25-100 μg/mL의 글루코스 옥시다제 또는Na2SO3/K2HPO4 혼합물(증류수 중의 10x 용액에 대해 각 화합물에 대해 50 mg/mL)을 샘플에 첨가해야 합니다. 중요하게도, 세포주가 상당한 정도의 비미토콘드리아O2 소비량을 갖는다면, 호흡 억제 및 교정 실험을 수행할 때 이를 고려한다.
한계와 미래 연구. 제안된 방법 및 비율계량 검출의 주요 한계는 일반적으로 관찰된 비율 레벨을 실제O2 레벨로 캘리브레이션 및 변환하는 것이며, 이는 하드웨어 및 사용자 이미지 획득 설정의 본질적인 차이로 인해 비율 캘리브레이션 계측기- 및 셀 특이적을 만들 것이다. 중요하게도, 광시야 형광 현미경 및 설명된 셋업의 경우, 비율 이미지들은 이상적인 광학 섹션들보다는 결합된 돌출부를 반사하고O2 캘리브레이션은 이치에 맞지 않을 것이다. 반면에, 우리는 반 정량적 비율 측정이 통계적으로 유의미하고 측정하기 쉬운 다양한 소스에서 생산되고 산소화에 차이가 있는 구상체의 비교 표현형을 제공한다는 것을 보여준다.
SPIM, 라이트 시트, 세타, 2광자 및 발광 수명 이미징과 같은 라이브 3D 물체를 위해 설계된 보다 접근하기 쉽고 저렴한 현미경 접근 방식을 기계 학습 56,57,58,59,19와 결합한 미래의 연구는 다중 모수O2 이미징을 훨씬 더 정량적 응용 분야에 적용하는 데 도움이 될 것입니다.

분자 산소(O2)는 세포 및 조직의 생존력, 기능 및 사멸을 조절하는 주요 대사산물 중 하나이다. 생리학적 조건 하에서, 국소 조직 산소화는 조직 혈관화, 혈류 및 세포 대사에 의해 동적으로 조절되며, 일부 경우에는O2 구배, 저산소 미세환경, 및/또는 산화 스트레스(1,2)의 형성을 유도한다. 세포는 신호전달 기능에서 분자 O2의 직접적인 관여를 통해O2 구배를 감지하고(저산소증-유도성 인자(HIF)-매개 신호전달, 히스톤 리신 데메틸라제 KDM 및 다른 수단을 통해), 세포 산화환원 전위의 변화(Nrf2/Keap1 신호전달 또는 철-조절 단백질을 통한 반응성O2 종 감지), 후속적으로 이들의 대사, 증식을 조절할 수 있고, 효능 및 분화3. 따라서, 세포 및 조직 산소화의 이질성, 그의 구배, 및 관련 현상은 조직 발달 및 항상성에 중요한 선수이다. 상이한 조직 및 세포 유형은 종종 상이한 '정상적인' 생리학적 O2 수준을 필요로 하며, 이는 조직O2 미세구배4에 따라 위치된 세포를 갖는 특별한 조직 구조를 정의한다. 일부 세포 유형은 O2 감소(예를 들어, 뉴런, 간세포, 췌장섬 세포, 또는 근육 세포)5,6에 민감하고, 다른 것들은 극심한 저산소증을 견디고 가파른O2 구배를 형성할 수 있다(예를 들어, 장 및 결장 상피에서)7. 조직 생명 공학 및 생물 제조의 진행과 함께, 미세 응집체 및 스페로이드 3D 조직 구축물에서O2 정량화의 필요성이 중요해진다. 우려 중 하나는 스페로이드 생성 및 배양 조건의 방법에 의존하는 다세포 스페로이드 모델 생리학적 파라미터의 표준화이다8. 또한, 기능적 혈관화가 결여된 미세조직에서의 O2 방출 생체물질 또는O2 관류의 제어되지 않은 적용은 세포에 독성이 될 수 있고, 그들의 대사의 리프로그래밍을 유도하고, 이식 후 기간 9,10에서 생존을 감소시킬 수 있다. 생리학적으로 관련된 미세응집체의 효율적인 배양에 도달하기 위한O2 측정 접근법 및 산소화 환경의 최적화의 신뢰성은 최근 실시예11로서 사용된 만능 줄기 세포 유래 간 구상체의 수학적 모델링에 의해 입증되었다. 조직 O2 수준에 대한 지식이 인식되는 또 다른 분야는 암 치료12,13이다. 이질적인 종양 저산소증은 성공적인 항암 요법을 손상시킬 수 있습니다. 환자 치료 또는 종양 저산소증 모델링 동안 정확한 산소화 수준을 측정하고 제어하는 것은 개인적이고 개인화된 치료 전략(14)의 개선을 허용할 것이다. 따라서, 생체 조작된 구축물 및 3D 종양 모델에서의 동적 산소화의 정량적 모니터링은 그들의 호흡 활성, 대사 및 조직 배양, 제조 조건, 또는 저산소증 매개 치료 반응의 기본 연구의 최적화의 생리학적 분석을 위한 중요한 도구이다.
다수의 방법은 스페로이드 및 미세응집체 조직 구축물에서 세포 산소화의 다중화된(또는 다중 파라미터) 분석을 가능하게 한다. 신경구 및 종양 구상체15,16,17로 개척된 인광 수명 이미징 현미경(PLIM) 기반 접근 방식은 살아있는 미세조직에서 세포 산소화를 직접 정량화하고 기능적 세포 유형의 세포 생존력, 증식 또는 분포와의 상관관계를 확립할 수 있게 합니다. 이 접근법의 힘에도 불구하고, PLIM 현미경 업그레이드는 여전히 널리 사용되는 현미경 공급 업체(18,19) 사이에서도 널리 제공되지 않습니다. 다행스럽게도, 다수의 세포-침투O2-감응성 나노입자 프로브가 형광 강도-기반 비율계량 측정 모드 15,17,20,21,22,23,24에 대해서도 사용될 수 있다. 전형적으로, 프로브는 2개의 방출 파장, 즉,O2-감응성 및 비감응성(reference)을 디스플레이할 것이고, 이는 형광 현미경, 고함량 스크리닝 이미저, 또는 마이크로플레이트 판독기 상에서 측정될 수 있다. 이러한 O2 감지 나노입자는 가시광선 및 근적외선 스펙트럼에 걸친 생체적합성 고분자,O2 감지, 및 기준 염료를 이용한 침전 기술에 의해 제조될 수 있거나, 또는 이들은 상업적으로 구입될 수 있다 2,25. 두꺼운 3D 미세조직의 분석이 적색 편이 형광 염료의 사용으로부터 이익을 얻을 것이기 때문에, 비측정계O2-감지 나노입자 프로브는O2-센싱 PtTPTBPF 26 및 기준 아자-BODIPY27 염료로 구성된 멀티모달 적외선 넘버 1(MMIR1), 양전하를 띤 폴리메타크릴레이트계 공중합체(28)에 함침되어 구성되었다. 이 설계에 의해,O2 민감성 신호(근적외선, 여기(exc.) = 635nm, 방출(em.) = 760nm; Isens)는 인광 담금질 과정을 통한 [O2] 농도에 의해 영향을 받는 반면, 적색 기준 염료 강도(exc. = 580 nm, em. = 650 nm; Iref)는 영향을 받지 않은 상태로 남아 있습니다(그림 1A). 따라서, 염색된 세포에서 Iref/I센스 비(R)는 O2 교정(22)을 가능하게 할 수 있다.
여기에서는 구상체 및 생체 인쇄 된 구조에서 살아있는 세포 산소화를 모니터링하기위한 반 정량적 접근법을 설명하여 종점 및 운동 측정에서O2 구배를 추정하는 데 도움을줍니다. 이러한 O2 이미징은 다른 유형의 비율계량O2 프로브(그림 1B)와 함께 수행할 수 있으며, 사용 가능한 광원 및 형광 필터의 수에 따라 다른 염료와 함께 사용하여 생/사형 세포, 미토콘드리아 기능 및 다른 세포 유형 추적에 대한 정보를 얻을 수 있습니다. 형광 수명 이미징 현미경(FLIM)과 같은 고급 측정 모드도 사용할 수 있습니다(19). 세포 염색 염료 및O2 민감성 나노입자의 사용으로 인한 가장 큰 과제는 염색 프로토콜의 최적화이다. MMIR1 프로브 및 관련 나노입자의 경우, 세포는 스페로이드 형성 과정 동안 사전 염색되거나 공동-인큐베이션된다. 기술된 프로토콜에서, O2 프로브-염색된 구상체는 저부착성 아가로스 표면 29,30,31,32 (도 1C) 상에서 생성되었고, 이는 후속 구상-기반 바이오프린팅 및O2 및 세포 사멸의 다중 파라미터 분석을 가능하게 한다. 접근법의 적용성을 예시하기 위해, 호모- 또는 헤테로세포(인간 탯줄 정맥 내피 세포, HUVEC의 첨가와 함께 형성됨) 인간 치과용 펄프 줄기 세포(hDPSC) 스페로이드에서의 산소화 수준을 종래의 형광 현미경을 사용하여 바이오프린팅 전과 후에 비교하였다.

<table><tbody><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>Sigma</td></tr><tr><td>12 well cell-culture plates, sterile</td><td>Greiner bio-one</td><td>665-180</td>에서도 사용 가능 <td>Sarstedt, Corning 및 기타 회사에서도 유사한 제품을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>12 웰 챔버 슬라이드, 탈착식</td><td>Ibidi</td><td>81201</td><td>Grace Bio-Labs, ThermoFisher Scientific 등에서도 사용 가능</td></tr><tr><td>15 mL 원심분리기 튜브</td><td>Nerbe plus</td><td>02-502-3001</td><td>Sarstedt, Corning, VWR 및 기타 회사에서도 유사한 제품을 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>. 3cc 카트리지, UV 보안, 루어 잠금</td><td>RegenHU</td><td>C-033CC-UV</td><td>CelIink 및 기타에서도 사용 가능</td></tr><tr><td>3D Discovery Bioprinter</td><td>RegenHU</td><td>N/A</td><td>압출 기반 프린트헤드, 가열 맨틀, UV-LED 경화 램프, 3D Discovery HMI 소프트웨어(직접 기계 제어가 가능한 CAD/CAM 소프트웨어) 및 BioCAD 소프트웨어(버전 1.1-12)가 장착된 Bioprinter</td></tr> <tr><td>6웰 세포 배양 플레이트, 멸균</td><td>Greiner bio-one</td><td>657160</td><td>Sarstedt, Corning, VWR 및 기타 회사에서 제공하는 유사한 제품도 있습니다</td></tr><tr><td>.</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674-25MG</td><td>미토콘드리아 전자 전달 사슬의 복합체 III의 억제제로 사용, 세포 호흡 차단</td></tr><tr><td>B-Braun Tip Cap, 루어 잠금</td><td>RegenHU</td><td>TC-BB-B</td><td>Regemat, Cellink 등에서도 사용 가능</td></tr><tr><td>Cell view cell culture dish, PS, 35/10mm, 유리 바닥, 1 격실, 멸균</td><td>Greiner bio-one</td><td>627861</td><td>바이오프린팅 스페로이드</td></tr> <tr><td>현미경 검사용인간 태반의 콜라겐, 유형 IV</td><td>시그마</td><td>C5533</td><td>0.07mg/mL 콜라겐 및 0.03mg/mL 폴리-D-라이신 코팅 현미경 접시</td></tr><tr><td>D(+)-Glucose</td><td>Merck</td><td>8342</td><td>준비 1M 원액, 이미징 배지 준비를 위한 1/100(최종 농도 10mM)</td></tr> <tr><td>Dulbecco의 변형된 독수리 배지(DMEM), 페놀 레드, 포도당, 피루베이트 및 글루타민이 없는</td><td>시그마-알드리치</td><td>D5030-10X1L</td><td>이미징 배지 준비를 위해</td></tr><tr><td>내피 세포 성장 매체 2</td><td>PromoCell</td><td>C-22011</td><td>Lonza 및 기타 업체에서도 구할 수</td></tr> 있습니다 <tr><td>Endothelial Growth SupplementMix</td><td>PromoCell</td><td>C-39216</td><td>Lonza 및 기타에서도 구할 수</td></tr> 있습니다 <tr><td>FCCP, 카르보닐 시안화물 4- (트리 플루오로 메 톡시) 페닐 히드라존</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920-10MG</td><td>미토콘드리아 언 커플러로 사용</td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Gibco</td><td>10270-098</td><td>Sigma</td></tr><tr><td>GelMA</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td>GelMA에서도 구할 수 있습니다 GelMA는 PBM 그룹(Prof Dr Peter Dubruel and Sandra Van Vlierberghe, University of Gent)에 의해 합성되었습니다 [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0142961213011782] 그러나</td></tr><tr><td>Aspergillus nige (10000 u)의 Xpect Inx Glucose-oxidase</td>에서도 구할 수 있습니다.<td>Sigma-Aldrich</td><td>G7141</td><td>탈산소화에 대한 프로브의 반응을 테스트하는 데 사용</td></tr><tr><td>GlutaMAX 100x Supplement</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td>이미징 배지 준비를 위한 희석 1/100(최종 농도 2mM)</td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td>이미징 배지 준비를 위한 <td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>희석 1/100(최종 농도 10mM)</td></tr><tr><td>Hoechst 34580</td><td>Invitrogen (Life Technologies)</td><td>H21486</td><td>Sigma, BDBiosciences에서도 사용 가능 및 기타</td></tr><tr><td>인간 치아 치수 줄기 세포(hDPSC)</td><td>Lonza</td><td>PT-5025</td><td>ATCC 또는 기타 공급업체에서도 사용 가능</td></tr><tr><td>인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)</td><td>Lonza</td><td>CC-2517</td><td>ATCC 또는 기타 공급업체에서도 사용 가능</td></tr><tr><td>KH2PO4(인산이수소칼륨)</td><td>Merck</td><td>4873</td><td>아황산나트륨 용액 (5 mg / mL Na2SO3 및 5 mg / mL KH2PO4)의 제조. 매일 10배 농축된 원액에서 신선하게 준비하십시오.</td></tr><tr><td>Li-TPO</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td>Li-TPO-L은 PBM 그룹(겐트 대학교 Peter Dubruel 교수 및 Sandra Van Vlierberghe 교수)에 의해 합성되었습니다. [https://link.springer.com/referenceworkentry/10.1007%2F97 8-3-319-45444-3_15) , https://asmedigitalcollection.asme.org/nanoengineeringmedical/article/6/2/021001/376814/Hybrid-Tissue-Engineering-Scaffolds-by-Combination] 그러나 유사한 광개시제는 Sigma</td></tr><tr><td>MEM Alpha Medium + Glutamax Minimum essential medium</td><td>Gibco</td><td>32561-029</td>에서 구<td>할</td></tr> <tr><td>수 있습니다.마이크로 패턴 3D 프린팅 PDMS 스탬프, 직경 400 &마이크로의 우물; m, 두께, 총 우물 수 1585</td><td>자체 제작</td><td></td><td>이 우표는 Centre for Microsystems Technology(University of Gent의 Jan Vanfleteren 교수)에서 자체 제작했지만 Merck(Z764094, Microtissues 3D Petri Dish micro-mold 혼합 스페로이드 키트)</td></tr><tr><td>Na2SO3(아황산나트륨)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239321-500G</td><td>에서도 상업적으로 얻을 수 있습니다.아황산나트륨 용액 (5 mg / mL Na2SO3 및 5 mg / mL KH2PO4)의 제조. 매일 10배 농축된 원액에서 신선하게 준비하십시오.</td></tr><tr><td>O2 프로브: MMIR1, SI-0.2+, SII-0.2+</td><td>N/A</td><td>N/A</td> 준비 <td>가능 ' 사내' 상업적으로 이용 가능한 염료, 폴리머 및 침전 방법을 사용합니다[https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/nn200807g https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/adfm.201201387]. 일부 나노 입자는 [https://link.springer.com/article/10.1007/s00018-018-2840-x ]</td></tr><tr><td>Pen Strep :P enicillin (10,000 U/mL) / streptomycin (10,000 &mu; g/mL) 100x 용액</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Sigma에서도 구할 수 있습니다. 희석 1:100</td></tr><tr><td>페트리 접시, 멸균</td><td>Greiner 바이오 원</td><td>633181</td><td>유사한 제품도 Sarstedt, Corning, VWR 및 기타 회사에서 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>3cc 카트리지</td><td>용 피스톤 RegenHU</td><td>P-03CC-UV</td><td>Cellink, Regemat 및 기타 제품에서도 사용 가능</td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Sigma</td><td>P6407-5mg</td><td>0.07mg/mL 콜라겐 및 0.03mg/mL Poly-D-lysine 코팅 현미경 준비용 접시</td></tr><tr><td>PVDF 주사기 필터 0.22 &마이크로; m</td><td>Novolab</td><td>A35149</td><td>Sarstedt, Corning, VWR 및 기타 회사에서도 유사한 제품을 구입할 수</td></tr> 있습니다 <tr><td>Rotenone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875-1G</td><td>미토콘드리아 전자 전달 사슬의 복합체 I의 억제제로 사용, 세포 호흡 차단</td></tr><tr><td>피루브산 나트륨 (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td>이미징 배지 (최종 농도 1mM) 제조를 위한 희석 1/100</td></tr> <tr><td>SYTOX Green</td><td>Invitrogen (Life Technologies)</td><td>S7559</td><td>Sigma, Promega 등에서도 사용 가능</td></tr><tr><td>테이퍼 팁 22 게이지 (원추형 PE 바늘</td><td>Amada Myachi Europe</td><td>22K62222</td><td>RegenHU, Cellink, Regemat 및 기타 제품에서도 유사한 제품을 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>조직 배양 플라스크 (75 cm2)</td><td>VWR</td><td>734-2313</td><td>Sarstedt, Corning, VWR 및 기타 회사 Ultrapure에서도 유사한 제품을 사용할 수 있습니다</td></tr>.<tr><td> 아가로스</td><td>Invitrogen (Life Technologies)</td><td>16500-500</td><td>아가로스 저융점(A-9414, Sigma), 일상적 사용용 아가로스(A-9539, Sigma)</td></tr><tr><td>광시야 형광 도립 현미경</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td>도립 형광 현미경 IX81, 전동 Z축 제어 포함, CoolLED pE4000(16채널, 365-770nm), ORCA-Flash4.0LT(Hamamatsu) cMOS 카메라, 유리 온난화 플레이트 Okolab, CellSens Dimension v.3 소프트웨어 및 공중 대물렌즈 4x/0.13 UPlanFLN 및 40x/0.6 LUCPlanFLN. (옵션, 고해상도 이미징용) 60x/1.0 LUMPLFLN 물</td></tr></tbody></table>

다세포 구상체의 저렴한 산소 현미경 보조 생물 제조

Affordable Oxygen Microscopy-Assisted Biofabrication of Multicellular Spheroids

다세포 구상체는 3D로 조직 및 암 생리학을 연구하는 데 중요한 도구이며 조직 공학에서 생물 제조를위한 조직 조립 단위로 자주 사용됩니다. 스페로이드 모델의 주요 힘은 조직 마이크로 스케일에서 물리화학적 구배를 모방하는 것이지만, 구상체 내부의 실제 생리 환경 (대사 활성, 산소화, 세포 사멸 및 증식의 역학 포함)은 일반적으로 무시됩니다. 동시에, 생성된 스페로이드 표현형에 대한 성장 배지 조성물 및 형성 방법의 효과는 잘 문서화되어 있다. 따라서, 스페로이드 표현형의 특성화 및 표준화는 연구 결과의 재현성 및 투명성을 보장하기 위해 요구된다. 3차원(3D)에서의 평균 스페로이드 산소화 및O2 구배의 값의 분석은 스페로이드 표현형 특성화를 위한 간단하고 보편적인 방법이 될 수 있으며, 이들의 대사 활성, 전반적인 생존력 및 생체내 조직 미세환경을 재편성할 수 있는 잠재력을 지적한다. 3D 산소화의 시각화는 추가적인 생리학적 파라미터(예: 세포 사멸, 증식 및 세포 조성)에 대한 다모수 분석과 쉽게 결합될 수 있으며 연속 산소화 모니터링 및/또는 종점 측정에 적용될 수 있습니다. O2 프로브의 로딩은 스페로이드 형성 단계 동안 수행되며 스페로이드 생성의 다양한 프로토콜과 호환됩니다. 이 프로토콜은 도입된 적색 및 근적외선 방출 비율계량 형광O2 나노센서를 사용한 스페로이드 생성의 고처리량 방법 및 바이오프린팅 전후의 스페로이드 산소화 및 세포 사멸의 다중 파라미터 평가에 대한 설명을 포함한다. 실험예는 호모- 및 헤테로세포 구상체 뿐만 아니라 구상-기반 생체인쇄 작제물에서의 비교O2 구배 분석을 보여준다. 이 프로토콜은 광원으로서 다중 형광 필터 및 발광 다이오드를 갖는 종래의 형광 현미경과 호환된다.

마이크로패턴화된 아가로스 방법을 사용하여 미리 염색된O2 프로브의 높은 처리량 생산은 사전 염색된 구상체가 없는 아가로스 마이크로웰의 예를 나타내는 도 1C 에 개략적으로 도시되어 있다. 아가로스 코팅에 대한 스페로이드 형성의 효율과 그 모양 / 구형도는 세포 특이적 일 수 있습니다. 예를 들어, 인간 결장 HCT116 세포는 지질 코팅 표면17과 달리 아가로스 마이크로웰 방법을 사용하여 이상적인 구형 구조를 형성하지 않은 반면, hDPSC는 단독으로 HUVEC와 공동 배양하여 항상 세포 조성, 초기 세포 수 및 스페로이드 형성 / 성장 기간에 비례하여 재현 가능한 모양과 크기의 구상체를 생산했습니다. 시험된 모든 세포 유형은 스페로이드 형성 동안O2 프로브 나노입자를 효율적으로 축적하고(도 1B), 적어도 5일에 걸쳐 이러한 염색을 보존하여, 바이오프린팅 및 바이오프린팅된 조직 산소화의 후속 모니터링에 이들을 사용할 수 있게 하였다(도 1D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63403/63403fig01.jpg"> 그림 1 :O2 프로브 기능의 원리와 스페로이드 염색 및 바이오 프린팅을위한 응용 프로그램. (A) 인광 나노입자(NP) 프로브에 의한O2 감지의 원리를 설명하는 단순화된 야블론스키 다이어그램. 금지된 삼중항 여기된 상태(T) 동안 분자 O2로의 에너지의 전달은 인광 수명 타우에 반비례하는 인광 강도의 감소를 유도하며, τ(0% O2에서 τ1에서21% O2에서의 τ2로의변화), 이는 일중항 상태로의 여기(S1)와 그의 기저 상태(G0)42로의 복귀 사이의 시간이다. 정량적O2 측정은 비율계량 측정 또는 τ 측정(인광 수명 측정)을 측정하여 수행할 수 있습니다. (b) 상이한 유형의 O2 프로브로 염색된 인간 치과용 펄프 줄기세포(hDPSC) 구상체의 염색의 예를, 투과광, 참조 및O2 민감성 염료 형광 채널에 나타내었다. 스케일 바는 100 μm이다. (C) 마이크로패턴화된 아가로스 방법을 이용한 고처리량O2 프로브 사전 염색된 스페로이드 생성의 회로도. 왼쪽에서 오른쪽으로: PDMS 실리콘 스탬프를 배양 플레이트의 웰에 위치시키고, 마이크로웰 패턴의 일례로 아가로오스(4x 배율), 및 일례로 HCT116 인간 결장암 세포로부터 생성된 MMIR1 사전 염색된 구상체를 2일째에 마이크로패턴화된 아가로오스(4x 배율)에 시딩한 후, 시딩하였다. 스케일 바는 100 μm이다. (D) 왼쪽에서 오른쪽으로: 바이오프린팅 후 1일 및 5일째에 MMIR1 사전 염색된 스페로이드 생물인쇄 작제물의 생체인쇄 와플 컨스트럭트 및 현미경 분석. 형광 신호는 MMIR1 나노입자에서O2 민감성 인광 염료에 상응한다(제외 = 635 nm/em. = 760 nm). 스케일 바는 400 μm입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63403/63403fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
설명 된 현미경 검사 설정 (광원으로 발광 다이오드 (LED)을 장착 한 기존의 광역 형광 현미경)에서 적색 / 근적외선 MMIR1 프로브는 초기 강도 비율 (R = Iref / Isens)의 밝기가 5 % 미만으로 감소한 기준 및 민감한 염료의 광안정성 측면에서 가장 우수한 것으로 나타났습니다. ) 연속 조명의 12 사이클 후. 이를 통해 MMIR1 프로브를 사용하여 미토콘드리아 언커플러(FCCP) 및 전자 수송 사슬(로테논)의 콤플렉스 I의 억제제로 치료할 때 hDPSC 구상체에서 신속한 호흡 반응에 대한 동적 실시간 연구를 수행할 수 있었습니다(도 2A, B). 우리는 줄기 세포 유래 구상체에서 FCCP가 DPSC40의 이전에 보고된 대사 특징과 일치하여이 약물을 첨가 한 후 ~ 80 초 이내에 세포 호흡이 약간 감소하여 가벼운 결합 결합 효과 만 나타냈다는 것을 발견했습니다. 한편, 로테논은 구상체 재산소화 (Rp-스페로이드 주변비 및Rc-스페로이드 코어 비율의 증가로서 반영됨) 및 자극 후 ∼80 s 이내의 주변부 대 코어O2 구배의 소산으로 이어지는 호흡을 강하게 억제하였다 (도 2A). 높은 (대기권) 및 낮음 (이미징 배지에서 아황산나트륨 및 글루코스 옥시다제의 존재시)에서 MMIR1 프로브 비율 (R)의 2 점 반 보정은 안티 마이신 A / 로테논 칵테일 처리에 의한 예비 호흡 억제와 함께 구상체의 산소 생성 감소와 관련된 R의 감소를 확인했습니다 (그림 2C ), MMIR1 프로브 R의 측정이 3D에서 장기 정상 상태 및 빠른 산소화 반응의 반정량적 모니터링에 어떻게 적용될 수 있는지를 보여줍니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63403/63403fig02.jpg"> 도 2: 상이한 자극에 대한O2 프로브 반응의 동역학적 분석. (A) 휴지 및 FCCP 및 로테논 치료에 반응하여 hDPSC 스페로이드 산소화 영상화의 대표적인 결과. 스케일 바는 100 μm이다. (B) 초기 광표백 강도비와 비교하여 FCCP 및 로테논 처리에 대한 MMIR1 강도비의 동역학적 반응 동역학(%). (c) 산소화 (안티마이신 A + 로테논 첨가) 및 탈산소화 (글루코스 옥시다제 첨가) 상태에서 hDPSC 스페로이드에서의 MMIR1 프로브의 강도비 이미지의 변화. 컬러 막대는O2 프로브 강도비(R=Iref /Isens) 이미지를 가로지르는 분포를 나타낸다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63403/63403fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
살아있는 대사 영상화를 위한 MMIR1 프로브 적용을 설명하기 위해, 동세포 hDPSC 대 이종세포 hDPSC/HUVEC(1:1) 구상체에서의O2 구배의 비교 분석이 수행되었다. 자유 청색 및 녹색 형광 스펙트럼 채널의 이용가능성을 이용하여 Hoechst 34580 (HXT) 및 SYTOX Green (SYTOX)과의 공동 염색을 수행하여 다모수 연구를 위한O2 프로브의 적용을 입증하였다 (도 3). 이미징 소프트웨어에 의해 제공된 픽셀별 강도비 계산의 자동화된 프로토콜을 사용하여 구상체에서의 R 분포의 오색비 이미지가 생성되었고, 모든 유형의 구상체에서 실시간으로 검출된 주변부-코어O2 구배를 시각화하였다: 중앙에 산소화된 주변부 및 저산소 틈새를 가지고 있다(도 2 및 도 3A). 그러나,Rp 및Rc 값뿐만 아니라 중간 단면에서의O2 구배의 가파름은 상이한 스페로이드 유형에 따라 다양하였다: hDPSC 대 hDPSC/HUVEC 구상체 및 hDPSC 대 생체인쇄된 hDPSC 구상체에서 중간 단면의 선 프로파일을 참조한다(도 3B,C). O2 구배를 기술하는 널리 받아들여진 방법이 없었기 때문에, 우리는 일반적인 스페로이드 산소화에 대한 쉬운 비교 및 상세한 설명을 가능하게 하는 몇 가지 파라미터들을 도입하였다:Rp와 Rc, 그리고 산소화 및 저산소 구역 사이의 차이로서O2 구배의 이러한 특성들(Rp-Rc), 및 μm당 산소화의 평균 변화(Rp-Rc)/r, 여기서 r은 주변부와 저산소 코어 사이의 거리로, 중간 단면과 스페로이드 반지름의 상관 관계가 있습니다(그림 3D). 구상체에서 SYTOX에 의해 시각화 된 괴사 성 죽은 세포로부터의 데이터와 함께 이러한 매개 변수의 통계적 비교는 스페로이드 세포 유형 특이적O2 분포 구배의 기원에 대한 예비 결론을 도출하는 데 도움이되었습니다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63403/63403fig03.jpg"> 그림 3: 구상체의 산소화 구배의 비교 분석. (A) 인쇄 전후의 동종세포 hDPSC 구상체에서의 산소화(MMIR1의 비율계량 형광 현미경) 및 생/사형 세포 염색(Hoechst 34580, HXT, 청색 및 SYTOX Green, SYTOX)의 살아있는 현미경 검사의 대표적인 예, 및 이종세포 hDPSC/HUVEC(1:1) 구상체. 모든 유형의 구상체에서 hDPSCs는 동일한 세포 배양물로부터 나왔다. 스페로이드는 형성 기간 동안 5 μg/mL의 MMIR1 프로브로 2일 동안 사전 염색한 다음, 이미징 또는 바이오프린팅(hDPSC 스페로이드만)에 사용하였고, 바이오프린팅 후 1일째에 후속 이미징 분석을 하였다. MMIR1-염색된 구상체의 강도비(Iref/Isens) 이미지의 거짓 컬러 이미지는 그들의 주변-코어 대 코어O2 구배에 대응한다. 스케일 바는 100 μm이다. 컬러 막대는 이미지에 걸친O2 프로브 강도비(R = Iref/Isens) 분포를 나타냅니다. 직경 단면의 숫자 1 및 2는 B와 C에 표시된 강도 프로파일에 해당합니다. (B,C) 바이오 프린팅 전후의 동종 hDPSC 대 이종 hDPSC / HUVEC 구상체 (B) 및 균질 hDPSC 구상체 (C) 간의 강도 비율 프로파일 비교. 프로파일은 (A)에 나타낸 구상체의 단면에 대해 측정되었다. (d) 스페로이드에서의 주변-코어O2 구배의 설명에 사용되는 파라미터의 개략적인 표현이며, 여기서 r은 스페로이드의 반경이고Rp 및Rc는 그에 상응하는 스페로이드의 주변부 및 코어 영역의 강도비이다. 컬러 바는 이상적으로 구형 구상체에서 높은(적색)에서 낮은(파란색) 수준까지의O2 구배의 분포를 개략적으로 나타낸다. (E, F) hDPSC/HUVEC 및 hDPSC 구상체(E) 및 바이오프린팅 전과 1일째에 hDPSC 구상체에서의 주변-코어O2-구배(Rp-Rc)/r 값의 비교 분석. 통계적 분석은 하나의 실험 반복에 대해 수행되었다(n=18-23). 상자는 표준 편차에 해당합니다. 별표는 그룹 간의 통계적 차이를 나타냅니다 (p = 0.05에서); ** = p &lt; 0.0005. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63403/63403fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
동종세포 hDPSC 구상체와 비교하여, hDPSC/HUVEC 구상체는 상당히 가파른 구배를 가졌다: (Rp-Rc)/r 파라미터 및 범위(Rp-Rc; 도 3F). 동시에, 그들은 주변부 (Rp) 및 코어 (Rc)의 더 높은 산소화를 나타내었다 (도 4A, 표 1). 흥미롭게도, 그들은 또한 통계적으로 더 컸으며(도 4A, 표 1), 이는 산소화의 이러한 차이가 그들의 상이한 세포 생물에너지 프로파일에 의해 야기되었다는 것을 시사한다. 이들 데이터는 ATP 및 NAD(P)H41의 주요 생물에너지 공급원으로서 당분해 및 펜토스-포스페이트 경로에 대한 강한 의존도를 갖는 세포의 일반적으로 낮은 호흡 활성을 갖는 HUVEC 세포의 잘 알려진 대사 특징과 일치한다. 동시에, 이종 구상체에서 형성된 뚜렷한 주변부-코어O2 구배는 그들의 조성에서 hDPSC에 의해 생성될 가능성이 높으며, 이는 과분극된 미토콘드리아 및 활성 전자-수송 사슬(40)을 특징으로 하고, hDPSC 스페로이드에 대한 결과에 따르면, 강한 호흡 활성을 갖는 산소화(도 3, 도 4A, 및 표 1) ). 따라서, 일반적으로 SYTOX로 염색된 죽은 세포의 낮은 강도에 의해 확인된 hDPSC/HUVEC 구상체의 더 높은 생존력(도 3A)은 잠재적으로 그들의 더 높은 산소화 수준과 연관된다.
생체 제조에서 스페로이드 산소화의 살아있는 현미경 이미징의 적용 가능성을 설명하기 위해, MMIR1O2-프로브 사전 염색된 구상체는 GelMA 바이오잉크에서 바이오프린팅에 사용되었고, 바이오프린팅 전과 1일째에 hDPSC 구상체에서의O2 구배를 다음과 같이 비교하였다(도 3A, C, F, 도 4B 및 표 2). 생체 인쇄 된 hDPSC 구상체는 바이오 프린팅 전에 측정 된 구상체와 비교하여 상당히 산소화 된 주변 (더 높은Rp)을 가졌지 만 코어 산소화는 비슷한 값을 가졌습니다 (그림 4B). 그들의 주변 산소화의 변화는 그들의 주변부-코어 O2 구배의 범위((Rp-Rc)의 증가) 및 가파름(증가(Rp-Rc)/r)에 영향을 미치며, 이는 바이오프린팅 전에 측정된 hDPSC 구상체와 통계적으로 상이하였다(도 3F 및 도 4B). 염색된 죽은 세포는 일반적으로 생체인쇄된 구상체에서 더 밝았고, 이는 감소된 스페로이드 생존력이 스페로이드 산소화의 변경에 관여한다는 것을 시사한다(도 3A).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63403/63403fig04.jpg"> 도 4: MMIR1 염색된 구상체 직경 및 강도비의 비교 분석. (A) 헤테로-hDPSC/HUVEC와 동종세포 hDPSC 구상체 간의 비교. (b) 바이오프린팅 전후의 동종세포 hDPSC 구상체의 비교. Rp 및Rc-에 상응하여 구상체의 주변부 및 코어에서의 강도비; (Rp-Rc)-강도비의 차이는, 구상체에서 O2 구배의 범위에 상응한다. 통계적 분석은 하나의 실험적 반복실험에 대해 수행되었다(n=18-23). 상자는 표준 편차에 해당합니다. 별표는 그룹 간의 통계적 차이(p = 0.05)를 나타내며, 여기서 * = p는 0.005이고 ** = p는 0.0005&lt; &lt;다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63403/63403fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>스페로이드의 종류(N)</td>
			<td>직경 [μm]</td>
			<td>Rp [a.u.]</td>
			<td>Rc[a.u.]</td>
			<td>Rp-Rc[a.u.]</td>
			<td>(Rp-Rc)/r [a.u./μm]</td>
		</tr>
<tr>
<td>hDPSC / HUVEC (18)</td>
			<td>113.2 ± 10.6</td>
			<td>0.779 ± 0.034</td>
			<td>0.398 ± 0.055</td>
			<td>0.982 ± 0.051</td>
			<td>0.00677 ± 0.00091</td>
		</tr>
<tr>
<td>hDPSC (18)</td>
			<td>88.1 ± 9.9</td>
			<td>0.558 ± 0.025</td>
			<td>0.331 ± 0.034</td>
			<td>0.227 ± 0.032</td>
			<td>0.00520 ± 0.00090</td>
		</tr>
<tr>
<td>p-값</td>
			<td>1.5 x 10-8 *</td>
			<td>1.5 x 10-21 *</td>
			<td>1.3 x 10-4 *</td>
			<td>1.4 x 10-12 *</td>
			<td>9.2 x 10-6 *</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1. 스페로이드 직경, 구상체의 코어(Rc) 및 주변부(Rp)에서의 강도비, 이종 hDPSC/HUVEC 및 균질 hDPSC 스페로이드에서의 강도비(Rp-Rc) 및 (Rp-Rc)/r 값의 차이. N 구상체에 대한 t-검정의 p-값은 통계적 차이를 나타내며 별표로도 표시됩니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>스페로이드의 종류(N)</td>
			<td>직경 [μm]</td>
			<td>Rp [a.u.]</td>
			<td>Rc[a.u.]</td>
			<td>Rp-Rc[a.u.]</td>
			<td>(Rp-Rc)/r [a.u./μm]</td>
		</tr>
<tr>
<td>hDPSC (18)</td>
			<td>88.1 ± 9.9</td>
			<td>0.558 ± 0.025</td>
			<td>0.331 ± 0.034</td>
			<td>0.227 ± 0.032</td>
			<td>0.00520 ± 0.00090</td>
		</tr>
<tr>
<td>생체 인쇄 hDPSC (23)</td>
			<td>80.9 ± 12.5</td>
			<td>0.584 ± 0.023</td>
			<td>0.323 ± 0.038</td>
			<td>0.261 ± 0.039</td>
			<td>0.00658 ± 0.00144</td>
		</tr>
<tr>
<td>p-값</td>
			<td>0.054</td>
			<td>0.0024 *</td>
			<td>0.46</td>
			<td>9.9 x 10-4 *</td>
			<td>6.3 x 10-6 *</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2. 스페로이드 직경, 구상체의 코어(Rc) 및 주변부(Rp)에서의 강도비, 바이오프린팅 전후의 균질한 hDPSC 구상체에서의 강도비(Rp-Rc) 및(Rp-Rc)/r 값의 차이. 통계 분석의 p-값 (N 구상체). 통계적 차이는 별표로 표시됩니다.

이 프로토콜은 표준 형광 현미경 상에서 그들의 산소화 및 세포 사멸에 대한 다중 파라메트릭 분석을 사용하여 바이오프린팅을 위한 고처리량 스페로이드 생성을 기술한다. 이러한 접근법은 구상체 생존력을 제어하고 표준화를 수행하기 위해 적용될 수 있으며, 이는 3D 조직, 종양 미세환경 및 성공적인 (마이크로)조직 생물제작을 모델링하는데 중요하다.

Multicellular spheroids are important tools for studying tissue and cancer physiology in 3D and are frequently used in tissue engineering as tissue ...

우리의 프로토콜은 기존의 형광 현미경을 사용하여 다세포 구상체의 산소화를 이미징하는 데 도움이됩니다. 이 방법을 사용하면 수천 개의 산소 프로브로 염색 된 스페로이드 미세 조직을 생산하고 3D 인쇄 응용 분야에 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 혈관화된 골 조직 이식편.근적외선 산소 프로브는 궁극적으로 녹색 형광 염색과 같은 다른 염료의 사용과 호환되며, 이는 라이브 및 다중 파라미터 장기 분석을 허용합니다. 마이크로 패턴화된 PDMS 스탬프를 저장 바이알에서 멸균 페트리 접시로 옮기고 10분 동안 멸균된 층류 공기 흐름 조건 하에서 매끄러운 표면을 위로 공기 건조시킨다. 각 스탬프를 12-웰 멸균 조직 배양 플레이트의 웰 중앙에 놓는다.뚜껑을 열어 한 두 분 동안 공기를 건조시킵니다. 50 밀리리터의 3 % 균질 아가로스 용액을 준비하고 삽입 된 PDMS 스탬프를 덮기 위해 12 웰 플레이트의 각 웰에 약 2 밀리리터의 뜨거운 아가 로스 용액을 즉시 첨가하십시오. 아가로스를 멸균 기류 하에서 인큐베이션하여 20분 동안 고형화시킨다.멸균 주걱을 사용하여, 임베디드 PDMS 스탬프가 있는 아가로스를 각 웰에서 거꾸로 뒤집습니다. 스탬프의 부드러운 윗면에 약 200 마이크로 리터의 멸균수를 넣으십시오. 주걱으로 아가로스에서 분리하고 우물에서 제거하십시오.직접 사용하기 위해 해당 멸균 세포 배양 배지 한 밀리리터를 아가로스 스탬프에 추가하십시오. 뚜껑으로 접시를 덮고 섭씨 네 도에서 밤새 배양하십시오. 사용하기 전에, 아가로스 마이크로 패턴화된 플레이트를 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 한 시간 동안 데모션한다.사전 가온 PBS로 70% 내지 90% 합류 세포 배양물을 헹구십시오. 해리 효소 용액을 첨가하고 섭씨 37도에서 3 ~ 5 분 동안 배양하십시오. 나중에, 트립신을 10%FBS를 함유하는 완전한 세포 배양 배지로 중화시킨다.단일 세포 현탁액을 수득하기 위해, 혈청학적 피펫의 상부에 1,000 마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 세포 응집체를 해리시킨다. 카운팅 챔버를 사용하여, 세포 현탁액의 밀리리터당 세포의 수를 계수한다. 세포 현탁액을 밀리리터 당 500, 000 세포로 희석하고 농축 산소 프로브 용액을 첨가하십시오.12-웰 아가로스 코팅된 세포 배양 플레이트의 마이크로-패터닝된 웰로부터 오래된 배지를 제거하고, 준비된 세포 현탁액 1밀리리터를 웰에 첨가한다. 구상체를 이산화탄소 인큐베이터에서 이틀 내지 오일 동안 산소 프로브의 연속 존재하에 배양하여 스페로이드 형성 및 압축 중에 로딩되도록 합니다. 팁 캡으로 멸균 된 세 입방 센티미터 카트리지의 끝을 닫고 피펫팅으로 바이오 잉크로 채 웁니다.카트리지에 플런저를 넣고 거꾸로 잡으십시오. 팁 캡을 분리하고 카트리지의 모든 공기가 제거될 때까지 플런저를 바이오 잉크 쪽으로 밀어 넣습니다. 바이오 프린터의 가열 맨틀에서 바이오 잉크를 섭씨 23도에서 냉각하십시오.바이오 프린터에 70 % 에탄올을 뿌리고 흡수 종이로 말리십시오. 카트리지 상단의 압력 어댑터에 끼워 넣습니다. 카트리지에 22게이지 원뿔형 폴리에틸렌 바늘을 장착합니다.카트리지를 압출 기반 프린트 헤드의 가열 맨틀에 설치합니다. 압력 입구를 연결하고 입구의 클립을 엽니다. 설계의 G 코드 파일을 인쇄 소프트웨어에 로드합니다.바늘 길이 측정을 시작합니다. 멸균 된 Petri 접시에 약간의 바이오 잉크를 분배하여 인쇄 압력을 조절하십시오. 여섯 웰 플레이트를 설치하고, 웰 플레이트를 열고, 후드를 닫고 인쇄하십시오.인쇄 후, 스캐폴드를 섭씨 다섯 도에서 10 분 동안 물리적으로 가교 시키십시오. 인쇄된 스캐폴드를 자외선 LED 램프로 60초 동안 조사합니다. 즉시 이중 항생제 용액을 함유 한 해당 성장 배지를 생체 인쇄 된 그리드가있는 모든 웰에 추가하십시오.스캐폴드를 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 배양한다. 현미경 관찰을 위해 인쇄된 와플 그리드를 이미징 미디어가 있는 현미경 접시 덮개에 옮깁니다. 1 밀리리터 피펫을 사용하여 산소 프로브를 아가로스 마이크로 웰에서 미리 염색 된 구상체를 부드럽게 씻어 내고 15 밀리리터 원뿔형 바닥 튜브로 옮깁니다.마이크로 패턴화된 웰로부터 모든 구상체를 수집하려면 추가 한 밀리리터의 배양 배지로 웰을 한 세 번 헹구고 모든 스페로이드 현탁액을 하나의 바이알에 결합하십시오. 구상체가 바닥에 정착하도록 바이알을 최대 10 분 동안 수직으로 두십시오. 조심스럽게 튜브에서 매체를 제거하여 구상체를 방해받지 않도록하십시오.샘플 접시 당 적어도 20 개의 구상체에 충분할 신선한 배양 배지를 추가하고 피펫팅으로 구상체를 부드럽게 재현탁하십시오. 즉시 동일한 부피의 스페로이드 현탁액을 각 사전 코팅 된 현미경 웰에 추가하십시오. 현미경 표면에 잘 부착하기 위해 구상체를 섭씨 37도에서 한 시간 동안 그대로 두십시오.현미경에서 배지를 잘 제거하고 이미징 매체로 한 번 헹구십시오. 정확한 양의 이미징 미디어를 샘플에 추가하십시오. 현미경 검사 단계에서 염색 된 구상체로 현미경을 잘 설정하십시오.10X 배율 목표를 사용하여 투과광에서 샘플을 미리 봅니다. 구상체에 예비 초점을 맞추고, 이미지의 중앙에 배치하고, 필요한 높은 배율로 목표를 작업 위치로 가져 오십시오. 구상체의 적도 단면에서 전송 광 모드에 중점을 둡니다.산소 프로브의 참조 및 민감한 스펙트럼 채널의 형광 또는 인광 신호를 수집하기 위한 설정을 조정하고 이미징 프로세스를 시작합니다. 병합 모드에서 참조 및 민감한 스펙트럼 채널의 산소 프로브 강도 데이터로 vsi 파일을 엽니다. 측정 메뉴에서 비율 분석 함수 창을 엽니다.참조 채널의 강도를 분자로 선택하고 민감한 채널의 강도를 R 계산의 분모로 선택합니다. 비율 분석 창에서 각 스펙트럼 채널에 해당 강도 임계값 설정을 적용하여 병합된 강도 이미지에서 배경을 뺍니다. 스페로이드 이미지에 적용된 ROI 마스크는 스페로이드 경계를 결정합니다.이미지 배경이 균일하게 검은색이 될 때까지 임계값을 늘립니다. 비율 분석 창에서 미리 보기 이미지가 R 그라디언트의 원하는 해상도를 제공할 때까지 비율 이미지의 배율 인수를 조정합니다. 강도비 분포의 이미지는 원본 다중 채널 이미지에 레이어로 추가됩니다.다중 채널 이미지의 창에서 거짓 색상 막대로 레이어를 활성화합니다. 디스플레이 창 조정에서 고정 배율 조정 옵션을 사용하여 비율 분포 히스토그램의 연결 및 연결 해제 한계를 수동으로 결정합니다. 구상체의 해당 전송 광 이미지를 엽니 다.선형 눈금자 기능을 선택하고 구상체의 직경을 측정하십시오. 데이터를 스프레드시트 테이블 파일로 내보냅니다. 필요한 크기와 모양의 ROI를 선택하고 구상체의 주변 및 저산소 코어에 적용하십시오.ROI를 측정 대상으로 변환하여 선택한 ROI 내부의 평균 R을 분석합니다. 스프레드시트 호환 테이블 형식으로 데이터를 내보냅니다. 스페로이드의 각 현미경 섹션에 측정을 적용하여 스페로이드 직경 RC 및 RP의 데이터 세트를 획득하여 추가 계산 및 통계 비교를 수행합니다.모든 데이터를 하나의 스프레드시트 파일로 결합합니다. MMIR1 프로브는 낮은 광표백을 가지며 다른 미토콘드리아 자극에 대한 hDPSC 구상체에서 빠른 호흡 반응의 실시간 연구에 적합합니다. FCCP는 일부 영역에서 가벼운 결합 해제 효과 만 표시 한 다음 세포 호흡을 약간 감소 시켰습니다.한편, 로테논은 자극 후 약 80초 이내에 스페로이드 재산소화 및 주변-코어 산소 구배의 소산으로 이어지는 호흡을 강하게 억제하였다. 이미징 소프트웨어가 제공하는 픽셀 강도비 계산에 의한 픽셀의 자동화된 프로토콜을 사용하여 모든 스페로이드 유형에서 실시간으로 감지된 주변부-코어 산소 구배는 중앙의 산소화된 주변 및 저산소 틈새 시장으로 시각화됩니다. 본 명세서의 그래프는 상이한 스페로이드 유형에 대한 적도 스페로이드 단면의 비율 프로파일을 묘사한다.동종세포 hDPSC 구상체와 비교하여, HUVEC 구상체에 대한 이종세포 hDPSC는 상당히 가파른 구배를 가졌다. 헤테로세포 구상체에서 주변-코어 산소 구배는 강한 호흡 활성을 갖는 hDPSC 구상체 산소화에 따라 그들의 조성에서 hDPSC에 의해 생성될 가능성이 높다. 그래프는 생체 인쇄 된 hDPSC 구상체가 바이오 프린팅 전에 측정 된 구상체보다 상당히 산소화 된 주변을 가졌지 만 코어 산소화는 비슷한 값을 가졌다는 것을 보여줍니다.가끔씩 프로브 침전이 균일한 스페로이드 형성을 방해하는 경우, 사용하기 전에 프로브 용액을 고속으로 필터링하거나 원심분리하십시오. 보정 바늘 길이 측정 및 압력 조절은 다공성 스캐폴드에서 바이오프린팅 속도 및 스트럿 직경 및 바이오프린트 미세응집체를 일치시키기 위한 필수적인 단계이다. 프로브 광안정성에 미치는 영향을 고려하여 산소에 민감한 프로브 이미징을 위한 현미경 설정을 선택합니다.산소 이미징은 다양한 유형의 라이브 현미경 측정과 호환됩니다. 이미징 후, 면역 형광을 수행하거나, 웨스턴 블롯팅을 위해 단백질을 추출하거나, 유전자 발현 분석을 수행 할 수도 있습니다.

affordable-oxygen-microscopy-assisted-biofabrication-multicellular

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

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여기에서는 세포 응집을 통해 3D 세포 스페로이드를 형성하기 위한 빠르고 유연한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이는 여러 세포 유형에 쉽게 적용할 수 있으며 세포 이동, 침습 또는 아노이키스 분석을 포함한 다양한 응용 분야와 세포-매트릭스 상호 작용의 이미징 및 정량화에 적합합니다.

3D 회전 타원체 생산을위한 효율적이고 유연한 셀 집계 방법

우리는 세포 스페로이드를 재배 할 수있는 모터 구동 원심 미세 유체 장치를 제시합니다. 이 장치를 사용하여, 단일 또는 다중 세포 모형의 스페로이드는 높은 중력 조건 하에서 쉽게 cocultured 될 수 있었습니다.

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Novel Stamp Device를 사용한 2차원 세포 배양에서 3차원 스페로이드/오가노이드 생성

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3D Spheroids의 생성을위한 간단한 한깅 드롭 세포 배양 프로토콜

배우세요 다세포 구상체의 산소 현미경 분석 방법을 형광 현미경을 활용하여. 이 프로토콜은 생체 인쇄 및 조직 공학 연구에 활용 가능한 고효율 구상체 생성 기술을 제공합니다.

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