해마와 전두엽 피질의 Dendritic Spine Visualization을위한 빠른 골지 얼룩

이 프로토콜은 쥐의 해마 및 내측 전두엽 피질에서 뉴런을 염색하기 위해 신경계의 모든 부분에 적응할 수있는 신속한 골지 방법의 변형을 기술합니다.

비교적 간단하지만 골지 함침 기술은 몇 가지 까다로운 단계를 가지고 있으며이를 제대로 수행하지 못하면 분석에 적합하지 않은 세포가 생성됩니다. 이 기술은 골지 함침 뉴런의 신속하고 재현 가능한 표지를 제공합니다. 또한 평균의 작은 표준 오차는 실험 간의 비교를 허용합니다.

이 기술에 대한 가장 어려운 부분은 비정상적인 일관성과 고정이 있기 때문에 cryostat 섹션을 절단하는 것이므로 슬라이드 플랫에 올려 놓는 것은 약간의 도전이 필요합니다. 먼저, 소량의 조직 배지를 미리 차가운 냉동 척에 놓습니다. 장갑을 낀 손에 블록의 한쪽면을 약간 해동하고 조직 매체에 올려 놓음으로써 cryostat 척에 뇌 블록을 장착하십시오.

나이프와 블록에 냉동 스프레이를 사용하십시오. 안티 롤 플레이트 또는 브러시를 사용하여 절단하는 동안 섹션을 평평하게 유지하십시오. 영하 22도에서 냉동 상태에서 100 마이크로 미터 섹션을 자릅니다.

가능한 경우 실온 슬라이드를 사용하여 해동 장착하고 신속하게 섹션에 반대하십시오. 또는 슬라이드를 냉동 장치에 보관하여 동결시킵니다. 차가운 포셉 또는 차가운 페인트 브러시로 섹션을 옮긴 다음 마운트를 해동하십시오.

서너 개의 코로나 섹션을 가라 앉히십시오. 조각 사이에 종이 물티슈로 나이프를 닦으십시오. 칼을 더 청소해야하는 경우 다음 조각을 자르기 전에 100 % 에탄올을 사용하고 말리십시오.

슬라이드를 랙에 배치하고 솔루션이 섹션에 액세스할 수 있도록 충분히 멀리 간격을 둡니다. 절편을 증류수에 두 번 넣고 4분 동안 골지 함침 용액에 넣기 전에 10분 동안 놓습니다. 커버 슬립을 분리하여 커버 슬립이 단면에 하나만 놓이도록 합니다.

슬라이드에 유리 커버 슬립을 놓기 전에 넉넉한 양의 장착 매체로 유리 슬라이드를 덮으십시오. 덮개가 미끄러지면 마른 슬라이드가 사흘에서 닷새 동안 비다공성 종이에 표시되어 특히 첫날 이후에 달라 붙지 않도록 약간 움직였습니다. 나중에 슬라이드를 슬라이드 홀더로 옮기고 이상적으로는 적어도 삼 주 동안 마른 슬라이드를 검사하기 전에 옮깁니다.

해마의 내측 전두엽 피질과 CA1 영역 모두의 피라미드 뉴런에서 수지상 척추 밀도를 분석하려면 이미지 분석 프로그램을 사용하여 수지상 길이를 측정하십시오. 핸드 카운터를 사용하여 수상 돌기의 척추를 세고 척추의 길이와 수를 기록하십시오. 분석을 위해, 함침된 동안 세포체와 수상 돌기를 가진 뉴런과 인접한 세포와 연속적이고 구별 가능한 수상 돌기를 선택하십시오.

도면은 해마의 CA1 영역에서 골지 함침 세포의 예를 보여주며 저전력과 고전력으로 나타내었다. 이 그림은 CA1 및 내측 전두엽 피질에서 환경 농축 후 사춘기 수컷 및 암컷 쥐의 피라미드 세포에서 기저 수지상 척추 밀도가 증가한 실험을 보여줍니다. 절단 할 때 섹션을 충분히 차갑게 유지하는 것은 어렵고 그렇게하기 위해 많은 냉동 스프레이를 사용합니다.

그런 다음 슬라이드에 섹션을 가져 와서 평평하게 말리는 것이 어렵습니다. 이 기술은 신경 해부학 적 특성을 검사하는 데 사용됩니다. 단독으로 또는 다른 신경 해부학 적 추적 방법과 함께 사용할 수 있습니다.