해마와 전두엽 피질의 Dendritic Spine Visualization을위한 빠른 골지 얼룩
2021년 12월 3일
이 프로토콜은 쥐의 해마 및 내측 전두엽 피질에서 뉴런을 염색하기 위해 신경계의 모든 부분에 적응할 수있는 신속한 골지 방법의 변형을 기술합니다.
비교적 간단하지만 골지 함침 기술은 몇 가지 까다로운 단계를 가지고 있으며이를 제대로 수행하지 못하면 분석에 적합하지 않은 세포가 생성됩니다. 이 기술은 골지 함침 뉴런의 신속하고 재현 가능한 표지를 제공합니다. 또한 평균의 작은 표준 오차는 실험 간의 비교를 허용합니다.
이 기술에 대한 가장 어려운 부분은 비정상적인 일관성과 고정이 있기 때문에 cryostat 섹션을 절단하는 것이므로 슬라이드 플랫에 올려 놓는 것은 약간의 도전이 필요합니다. 먼저, 소량의 조직 배지를 미리 차가운 냉동 척에 놓습니다. 장갑을 낀 손에 블록의 한쪽면을 약간 해동하고 조직 매체에 올려 놓음으로써 cryostat 척에 뇌 블록을 장착하십시오.
나이프와 블록에 냉동 스프레이를 사용하십시오. 안티 롤 플레이트 또는 브러시를 사용하여 절단하는 동안 섹션을 평평하게 유지하십시오. 영하 22도에서 냉동 상태에서 100 마이크로 미터 섹션을 자릅니다.
가능한 경우 실온 슬라이드를 사용하여 해동 장착하고 신속하게 섹션에 반대하십시오. 또는 슬라이드를 냉동 장치에 보관하여 동결시킵니다. 차가운 포셉 또는 차가운 페인트 브러시로 섹션을 옮긴 다음 마운트를 해동하십시오.
서너 개의 코로나 섹션을 가라 앉히십시오. 조각 사이에 종이 물티슈로 나이프를 닦으십시오. 칼을 더 청소해야하는 경우 다음 조각을 자르기 전에 100 % 에탄올을 사용하고 말리십시오.
슬라이드를 랙에 배치하고 솔루션이 섹션에 액세스할 수 있도록 충분히 멀리 간격을 둡니다. 절편을 증류수에 두 번 넣고 4분 동안 골지 함침 용액에 넣기 전에 10분 동안 놓습니다. 커버 슬립을 분리하여 커버 슬립이 단면에 하나만 놓이도록 합니다.
슬라이드에 유리 커버 슬립을 놓기 전에 넉넉한 양의 장착 매체로 유리 슬라이드를 덮으십시오. 덮개가 미끄러지면 마른 슬라이드가 사흘에서 닷새 동안 비다공성 종이에 표시되어 특히 첫날 이후에 달라 붙지 않도록 약간 움직였습니다. 나중에 슬라이드를 슬라이드 홀더로 옮기고 이상적으로는 적어도 삼 주 동안 마른 슬라이드를 검사하기 전에 옮깁니다.
해마의 내측 전두엽 피질과 CA1 영역 모두의 피라미드 뉴런에서 수지상 척추 밀도를 분석하려면 이미지 분석 프로그램을 사용하여 수지상 길이를 측정하십시오. 핸드 카운터를 사용하여 수상 돌기의 척추를 세고 척추의 길이와 수를 기록하십시오. 분석을 위해, 함침된 동안 세포체와 수상 돌기를 가진 뉴런과 인접한 세포와 연속적이고 구별 가능한 수상 돌기를 선택하십시오.
도면은 해마의 CA1 영역에서 골지 함침 세포의 예를 보여주며 저전력과 고전력으로 나타내었다. 이 그림은 CA1 및 내측 전두엽 피질에서 환경 농축 후 사춘기 수컷 및 암컷 쥐의 피라미드 세포에서 기저 수지상 척추 밀도가 증가한 실험을 보여줍니다. 절단 할 때 섹션을 충분히 차갑게 유지하는 것은 어렵고 그렇게하기 위해 많은 냉동 스프레이를 사용합니다.
그런 다음 슬라이드에 섹션을 가져 와서 평평하게 말리는 것이 어렵습니다. 이 기술은 신경 해부학 적 특성을 검사하는 데 사용됩니다. 단독으로 또는 다른 신경 해부학 적 추적 방법과 함께 사용할 수 있습니다.
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개요
본 연구에서는 쥐의 해마와 내측 전두엽 피질 내 뉴런을 특이적으로 염색하기 위해 수정된 신속 골지법(rapid Golgi method)을 상세히 설명합니다. 이 기술은 뉴런의 효과적인 라벨링을 가능하게 하여 신경해부학적 특성의 분석을 돕습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 신경해부학
- 세포생물학
배경
- 골지 염색법(Golgi impregnation technique)은 뉴런 염색을 위한 잘 확립된 방법입니다.
- 이 방법의 적용을 통해 수지상 돌기 구조와 가시 밀도를 조사할 수 있습니다.
- 본 방법은 신경계 내의 다양한 영역에 맞게 조정하여 적용할 수 있습니다.
- 조직의 일관성 문제로 인해 동결절편기를 이용한 절편 제작 시 어려움이 있을 수 있습니다.
연구 목적
- 더 나은 신경세포 표지를 위해 기존의 Golgi 방법을 개선하기 위함입니다.
- 특정 뇌 영역의 수지상 돌기 가시 밀도를 조사하기 위함입니다.
- 환경적 요인이 신경세포 형태학에 미치는 영향을 탐구하기 위함입니다.
사용된 방법
- 쥐 뇌 조직의 신속 골지 염색 기법.
- 100 µm 두께의 크라이오스탯 절편 제작 시의 고정밀 절단법.
- 절편을 슬라이드에 정확하게 부착시키기 위한 해동 기술.
- 효과적인 뉴런 염색을 위한 골지 용액 내 배양.
- 이미지 분석 소프트웨어를 이용한 수지상 돌기 길이 측정 및 스파인 수 측정 분석.
주요 결과
- 이 기법을 통해 분석에 적합한 뉴런의 재현성 있는 라벨링이 이루어졌다.
- 환경 풍요화에 따라 피라미드 뉴런의 스파인 밀도가 증가함이 확인되었다.
- 수컷 및 암컷 청소년 쥐 모두에서 기저 수지상 돌기 스파인 밀도의 변화를 성공적으로 식별하였다.
결론
- 본 연구는 수정된 Golgi법이 신경해부학적 분석을 위한 신뢰할 수 있는 접근법임을 검증합니다.
- 수지상 돌기 가시 밀도에 대한 통찰은 신경 가소성의 이해에 기여합니다.
- 향후 응용 분야에는 뇌 형태학에 미치는 환경적 영향의 평가가 포함될 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
이 신속 Golgi 염색법은 신경정신질환 모델과 관련된 주요 뇌 영역에서 수지상 돌기 가시(dendritic spine) 밀도를 시각화하기 위해 재현성이 높고 변동성이 적은 접근 방식을 제공합니다. 해마와 전전두엽 피질에서 시냅스 구조의 일관된 정량화를 가능하게 함으로써, 이 기술은 중추신경계(CNS) 약물 발견 프로그램에서의 표적 검증 및 기전적 위험 제거(mechanistic de-risking)를 지원합니다. 냉동 조직 보관과의 호환성 및 실험 간의 최소한의 변동성은 종단적 전임상 연구에 대한 분석 신뢰도를 향상시킵니다.
바이오 제약 R&D에서의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 질환 관련 신경 회로 내의 시냅스 가소성 및 수지상 돌기 형태와 관련된 치료 가설의 검증을 가능하게 함.
- 운영적 가치: 실험 간 신뢰할 수 있는 비교를 위해 수지상 돌기 10 µm당 표준화된 정량적 스파인 밀도 측정값을 제공함.
- 예측적 가치: 환경 풍요화 및 약리학적 모델에서 구조적 신경 해부학을 기능적 결과와 연결함으로써 생물학적 리스크 감소를 지원함.
스크리닝 및 분석법 개발
- 분석 준비도: 배경 파편을 최소화하면서 일관되게 잘 함침된 뉴런을 생성하여, 신뢰할 수 있는 수지상 돌기 가시화 및 계수를 가능하게 합니다.
- 재현성: 실험 간 돌기 밀도의 편차가 매우 작음을 입증하여, 분석의 정밀도와 통계적 유의성을 뒷받침합니다.
- 확장성: 처리 전까지 뇌 조직의 축적 및 냉동 보관이 가능하여, 스크리닝 파이프라인 내의 일괄 처리와 워크플로우 효율성을 촉진합니다.
중개 및 전임상 연구
- 질환 관련성: 인지, 우울증 및 조현병 모델과 연관된 해마 및 전전두엽 피질 영역에 적용 가능함.
- 중개 연속성: 뉴런 구조에 미치는 화합물의 효과를 평가하기 위해 바이오마커와 일치하는 리드아웃으로서 스파인 밀도 분석을 가능하게 함.
- 기전적 리스크 감소: 구조적 변화(예: 풍부한 환경 제공 후 스파인 밀도 증가)를 기능적 가소성과 연결하여 CNS 프로그램의 타겟 신뢰도를 뒷받침함.
파이프라인 및 워크플로우 통합
이 방법은 초기 타겟 검증부터 전임상 표현형 스크리닝에 이르는 발견 연속체에 적합하며, 특히 신경 가소성과 시냅스 무결성을 평가하는 CNS 중심 프로그램에 유용합니다.
- 발견 생물학: 시냅스 건강 및 뉴런 연결성의 대리 지표로서 수지상 돌기 구조와 가시 밀도에 대한 가설 검증을 지원합니다.
- 스크리닝: 고함량 분석 및 화합물 효과 비교에 적합한 정량적이고 재현 가능한 결과(수지상 돌기 10 µm당 가시 수)를 제공합니다.
- 분석: 이미지 분석 및 수동 계수를 통해 조건별 가시 밀도의 통계적 비교가 가능하며, 낮은 평균 표준 오차로 데이터 신뢰도를 높입니다.
- 중개 연구: 학습 및 기억 모델에서 기능적 결과와 상관관계가 있는 구조적 판독값을 제공함으로써 전임상 검증과 일치합니다.
- 기업적 재사용: 여러 뇌 영역 및 질환 모델에 적용 가능한 표준화되고 재사용 가능한 신경 해부학적 플랫폼을 나타냅니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 시냅스 가소성 평가에서 기전적 모호성을 줄여 표적 검증의 예측 신뢰도를 높입니다.
- 운영적 가치: 일관된 염색, 낮은 배경 노이즈 및 실험 간 최소한의 편차를 통해 재현성과 표준화를 향상시킵니다.
- 전략적 가치: 수상돌기 구조에 명확한 효과가 입증된 화합물을 우선순위화할 수 있는 신뢰할 수 있는 신경해부학적 데이터를 제공하여 go/no-go 결정 프로세스를 개선합니다.
- 포트폴리오 영향: 인지 및 행동 종말점과 연관된 구조적 CNS 바이오마커를 정량화함으로써 위험 조정된 개발 진척을 가능하게 합니다.
실행 시 고려 사항
- -22°C에서 절편의 평평함과 무결성을 유지하기 위해 크라이오스탯 절편 제작 및 조직 취급에 관한 전문 지식이 필요합니다.
- 슬라이드 전송 중 절편 손상을 방지하기 위해 적절한 해동-마운팅 기술과 안티-롤 플레이트 또는 브러시 사용이 필수적입니다.
- 일관된 뉴런 표지를 보장하기 위해 표준화된 염색 시간(Golgi 용액에서 10분)과 마운팅 매질 도포가 필요합니다.
- 이미징 전 장기간의 건조 기간(초기에 3~5일, 이후 ≥3주)이 소요되므로 계획적인 워크플로우 일정이 필요합니다.
- 이미지 분석 도구와 수동 카운터를 사용하여 수지상 돌기 가시의 정확한 개수 측정 및 길이 측정을 수행할 숙련된 인력이 필요합니다.
