Name: 생체 내 결합 된 이광자 형광 및 자극 된 라만 산란 현미경을 사용한 생물학적 조직 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: 배우세요 자극 라만 산란 및 이광자 형광 현미경을 결합한 이중 모달 이미징으로 생쥐 척수의 세포 구조를 라벨 없이 시각화하는 방법. 이 기술은 신경퇴행성 질환 및 척수 손상 연구에 필수적인 생화학 및 생물물리학 정보를 제공합니다.

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이 작업은 보조금 16103215, 16148816, 16102518, T13-607/12R 16102920, T13-706/11-1, T13-605/18W, C6002-17GF, C6001-19E, N_HKUST603/19, 혁신 및 기술위원회 (ITCPD/17-9), 대학 보조금위원회 우수 제도 영역 (AoE / M-604 / 16, AOE / M-09 / 12) 및 보조금 RPC10EG33을 통한 홍콩 과학 기술 대학 (HKUST)을 통해 홍콩 연구 보조금위원회에서 지원했습니다.

저자는 공개 할 것이 없으며 경쟁 할 재정적 이익이 없습니다.

이 프로토콜에서, TPEF-SRS 현미경의 기본 셋업이 상세히 설명된다. SRS 이미징의 경우, 펌프와 스토크스 빔은 OPO 내부에서 시간적으로나 공간적으로 겹쳐집니다. 그러나, 이러한 중첩은 현미경 시스템을 통과한 후에 중단될 수 있다. 따라서 펌프와 스토크스 빔의 공동 현지화에 대한 공간적 및 시간적 최적화가 모두 최적의 SRS 이미징을 달성하는 데 필요하고 중요합니다. 펌프와 스토크스 빔 사이의 시간적 지연은 두 빔의 광학 경로 차이와 관련이 있으며, 이는 현미경 시스템38에서 광학 요소의 분산에 의해 결정된다. 펌프 빔의 파장이 상이한 라만 시프트에서 SRS 이미징을 위해 튜닝될 때, 펌프 빔의 광 경로 길이는 광학 렌즈의 굴절률이 파장에 의존하기 때문에 그에 따라 변한다38. 따라서 펌프와 스토크스 레이저 펄스 사이의 시간적 지연은 펌프 빔의 파장에 따라 변하므로 보정이 필요합니다. OPO에는 펌프와 스토크스 빔의 시간적 동기화를 위한...

라만 현미경1,2는 생체 분자의 다양한 화학 결합의 특징적인 주파수를 기반으로 생물학적 조직을 이미지화하는 강력한 라벨 프리 방법으로 부상하고 있습니다. 비침습적이고 잘 적응하는 이미징 기능으로 인해 라만 현미경은 미엘린 외피3,4,5, 지방세포6,7 및 지질 방울8,9,10과 같은 생물학적 조직에서 지질 풍부 성분을 이미징하는 데 널리 사용되었습니다. . 자극된 라만 이득(SRG) 또는 자극된 라만 손실(SRL)로서 획득된 자극된 라만 산란(SRS) 신호는 배경이 없으며, 자발적인 라만 산란과 완벽한 스펙트럼 유사성을 나타낸다11,12. 또한, SRL 및 SRG는 분석물 농도에 선형적으로 의존하므로 생화학 성분9,11,13의 정량적 분석이 가능합니다. 이광자 여기된 형광 현미경(TPEF)은 고유의 광학 단면화 능력, 깊은 침투 깊이 및 낮은 광독성으로 인해 생체 내 생물학적 이미징에 널리 사용되어 왔습니다14,15,16. 그러나, TPEF 이미징의 성능은 형광 태그의 특성에 의존하며, 분해 가능한 색상의 수는 광대역 형광 스펙트럼8,17,18,19로 인해 제한된다. 라벨이 없는 SRS 이미징 및 형광 기반 TPEF 이미징은 두 가지 상보적인 이미징 방식이며, 이들의 조합은 조직의 풍부한 생물물리학적 및 생화학적 정보를 제공할 수 있다. 이 두 가지 이미징 방식은 모두 비선형 광학 (NLO) 프로세스를 기반으로하므로 하나의 현미경 시스템에서 간단하게 통합 할 수 있습니다. SRS와 TPEF 이미징, 소위 이중 모달 이미징의 조합은 세포와 조직의 고차원 이미징 및 프로파일 링을 가능하게하여 복잡한 생물학적 시스템에 대한 포괄적 인 이해를 용이하게합니다. 특히, 피코초(ps) SRS 현미경 검사는 펨토초(fs) SRS 기술11에 비해 높은 스펙트럼 분해능을 갖는 화학 결합 이미징을 달성할 수 있어, 생물학적 조직, 특히 혼잡한 지문 영역20,21에서 여러 생화학적 성분을 구별할 수 있다. 또한, 코히어런트 스토크스 산란(CARS) 현미경의 통합과 함께 일반적으로 사용되는 다른 이중 모달 NLO 현미경 시스템과 비교하여, SRS는 스펙트럼 및 이미지 해석 및 검출 감도 측면에서 CARS에 우수한 성능을 보여줍니다11. SRS-TPEF 현미경은 예쁜꼬마선 충9,22, 제노푸스 래비스 올챙이 뇌5, 마우스 뇌23,24, 척수25,26, 말초 신경27 및 지방 조직7 등과 같은 다양한 생물학적 시스템을 연구하는 강력한 도구로 사용되었습니다.
척수는 뇌와 함께 중추 신경계 (CNS)를 구성합니다. 생리학적 및 병리학적 조건 하에서 생체내 CNS에서의 세포 활성을 시각화하는 것은 CNS 장애28,29,30의 메카니즘을 이해하고 상응하는 치료법을 개발하는 데 매우 중요하다31,32,33. 고속 작용 전위 전도를 위해 축삭돌기를 감싸고 절연하는 Myelin sheath는 CNS 개발에 중요한 역할을합니다. 탈수초화는 다발성 경화증과 같은 백질 장애의 특징으로 생각된다34. 또한, 척수 손상 후35, 미엘린 파편은 대식세포 활성화를 조절하여 만성 염증 및 이차 손상에 기여할 수 있습니다36. 따라서, 살아있는 마우스 모델에서 뉴런 및 신경교세포와 함께 미엘린 외피의 생체내 영상화는 CNS 장애에서 역동적인 과정을 이해하는 데 큰 도움이 된다.
이 프로토콜에서는 자체 제작된 TPEF-SRS 현미경의 기본 설정 절차가 설명되고 마우스 척수에 대한 이중 모달 생체 내 이미징 방법이 도입됩니다.

<table><tbody><tr><td>#2 포셉스</td><td>Dumont</td><td>11223-20</td><td>laminectomy</td></tr><tr><td>10X objective</td><td>Nikon</td><td>CFI Plan Apo Lambda 10X</td><td></td></tr><tr><td>25X objective</td><td>Olympus</td><td>XLPLN25XSVMP2</td><td></td></tr><tr><td>Burn cream</td><td>Betadine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>Sony</td><td>&alpha; 6300</td><td></td></tr><tr><td>전류 증폭기</td><td>Stanford research</td><td>SR570</td><td></td></tr><tr><td>전류 광전자 증배관 모듈</td><td>Hamamatsu</td><td>H11461-01</td><td></td></tr><tr><td>D2 665 nm 장역 통과 이색성 거울</td><td>Semrock</td><td>FF665-Di02-25x36</td><td>epi-fluorescence 신호를 검출 모듈 D3로 유도하기 위해</td></tr><tr><td>700 nm 단역 통과 이색성 거울</td><td>Edmund</td><td>69-206</td><td>SRS를 분리하기 위해 TPEF 감지 경로</td></tr><tr><td>제모 크림</td><td>Veet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FS1 975nm 단역 통과 필터</td><td>Edmund</td><td>86-108</td><td>스토크스 빔 차단용</td></tr><tr><td>FS1 대역 통과 필터</td><td>Semrock</td><td>FF01-850/310</td><td>스토크 빔 차단용</td></tr><tr><td>Fs2 대역 통과 필터</td><td>Semrock</td><td>FF01-525/50</td><td>YFP 신호</td></tr><tr><td>Fs2 단역 통과 필터</td><td>Semrock</td> <td>선택용FF01-715/SP-25</td><td>fs 여기 레이저 빔 차단용</td></tr><tr><td>반파 플레이트</td><td>Thorlabs</td><td>SAHWP05M-1700</td><td></td></tr><tr><td>고속 광검출기</td><td>MenloSystems</td><td>FPD 310-F</td><td>스톡스 빔 변조 확인용</td></tr><tr><td>요오드</td><td>베타딘</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IR 스코프</td><td>FJW</td><td>FIND-R-SCOPE 적외선 뷰어 2X 키트 모델 84499C2X</td><td></td></tr><tr><td>Iris</td><td>Thorlabs</td><td>CPA1</td><td></td></tr><tr><td>L1</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-060-B-ML</td><td></td></tr><tr><td>L10</td><td>Thorlabs</td><td>LA4052-A</td><td></td></tr><tr><td>L2</td><td>Thorlabs</td><td>LA1422-B</td><td></td></tr><tr><td>L3</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-050-B</td><td></td></tr><tr><td>L4</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-060-B-ML</td><td></td></tr><tr><td>L7</td><td></td><td></td><td>f=100 mm, AB 코팅</td></tr><tr><td>L8</td><td>Thorlabs</td><td>LA4874-A</td><td></td></tr><tr><td>L9</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-035-B-ML</td><td></td></tr><tr><td>락인 증폭기</td><td>APE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>미러</td><td>Thorlabs</td><td>PF10-03-P01</td><td></td></tr><tr><td>전동 플리퍼</td><td>Thorlabs</td><td>MFF101/M</td><td></td></tr><tr><td>다기능 획득 카드</td><td>National Instrument</td><td>PCIe-6363</td><td></td></tr><tr><td>오실로스코프</td><td>텍트로닉스</td><td>TDS2012C</td><td></td></tr><tr><td>포토다이오드</td><td>APE</td><td></td><td>SRS 신호 감지용</td></tr><tr><td>피코초 레이저 소스</td><td>APE</td><td>피코에메랄드</td><td></td></tr><tr><td>편광 빔 스플리터</td><td>Thorlabs</td><td>CCM1-PBS252/M</td><td></td></tr><tr><td>파워 미터</td><td>Newport</td><td>843-R</td><td></td></tr><tr><td>식염수</td><td>브라운</td><td></td><td></td></tr><tr><td>스캔 렌즈 L5</td><td>Thorlabs</td><td>SL50-CLS2</td><td></td></tr><tr><td>스캐닝 미러</td><td>Cambridge Technology</td><td>6215H</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 젤</td><td>World Precision Inc.</td><td>KWIK-SIL</td><td></td></tr><tr><td>Ti:sapphire fs 레이저</td><td>코히런트</td><td>카멜레온 울트라 II</td><td></td></tr><tr><td>튜브 렌즈 L6</td><td>Thorlabs</td><td>TTL200-S8</td><td></td></tr></tbody></table>

생체 내 결합 된 이광자 형광 및 자극 된 라만 산란 현미경을 사용한 생물학적 조직 이미징

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

자극된 라만 산란(SRS) 현미경 검사는 내재적 분자 진동을 기반으로 자연 미세환경에서 생물학적 조직을 라벨 없이 이미징할 수 있게 해줌으로써 세포 내 분해능에서 생물학적 과정에 대한 생체 내 연구를 위한 완벽한 도구를 제공합니다. 이광자 여기형광(TPEF) 이미징을 SRS 현미경에 통합함으로써 조직의 이중 모달 생체 내 이미징은 세포 대사, 면역 반응 및 조직 리모델링 등과 관련된 동적 과정을 이해하는 데 도움이 되는 다양한 관점에서 중요한 생화학 및 생물 물리학 정보를 획득할 수 있습니다. 이 비디오 프로토콜에서는 TPEF-SRS 현미경 시스템의 설정뿐만 아니라 동물 척수의 생체 내 이미징 방법이 도입됩니다. 척수는 중추 신경계의 일부로서 뇌와 말초 신경계 간의 의사 소통에 중요한 역할을합니다. 인지질이 풍부한 Myelin sheath는 축삭을 둘러싸고 절연하여 작용 잠재력의 염분 전도를 허용합니다. 척수에서 미엘린 외피의 생체 내 영상은 신경 퇴행성 질환 및 척수 손상의 진행을 연구하는 데 중요합니다. 이 프로토콜은 또한 고해상도 생물학적 이미지를 획득하기 위한 동물 준비 및 생체내 TPEF-SRS 이미징 방법을 기술한다.

미엘린 외피뿐만 아니라 척추 축색돌기의 생체내 이중 모달 영상은 등쪽 뿌리 신경절 구심성 뉴런에서 EYFP를 발현하는 Thy1-YFPH 형질전환 마우스를 사용하여 수행된다(도 3). 이 표지 된 구심성 뉴런은 말초 신경에서 척수로 감각 정보를 전달하며, 중앙 지점은 척수 등쪽 기둥에 위치합니다. TPEF-SRS 현미경을 사용하면 조밀하게 분포된 미엘린 시스를 라벨이 없는 SRS 이미징을 사용하여 명확하게 시각화할 수 있으며, TPEF 이미징을 사용하여 드물게 표지된 YFP 축색돌기를 관찰할 수 있습니다. 이중 모델 이미징에 의해 축삭이 미엘린 칼집의 두꺼운 층으로 밀접하게 감싸여 있음이 밝혀졌습니다 (그림 3C). 액솔레마가 미엘린 외피의 맨손인 랜비어(NR)의 노드는 작용 전위의 빠른 염분 전파에 필수적인 역할을 한다. TPEF-SRS 척수 이미지에서 알 수 있는 바와 같이(<strong class="xf...

자극된 라만 산란(SRS) 현미경은 특정 화학 결합의 고유 진동을 기반으로 생체 분자의 라벨 없는 이미징을 가능하게 합니다. 이 프로토콜에서, 통합 SRS 및 이광자 형광 현미경의 도구 셋업은 살아있는 마우스의 척수에서 세포 구조를 시각화하기 위해 기술된다.

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic ...

세포 내 분해능과 화학적 특이성을 가진 생물학적 조직의 생체 내 이미징은 세포 대사, 면역 반응 및 조직 리모델링과 관련된 동적 과정을 이해하는 강력한 도구입니다. 이광자 형광과 자극된 라만 산란 현미경을 결합하면 세포 내 분해능을 통해 생물학적 조직의 중요한 생화학적 및 생물물리학적 정보를 여러 관점에서 획득할 수 있습니다. 특히,이 이중 모달 현미경 검사는 신경 퇴행성 질환 및 척수 손상의 진행을 연구하기 위해 마우스 척수에서 세포 역학 및 상호 작용을 이미지화하는 데 사용될 수 있습니다.시작하려면 키 스위치를 대기 모드에서 켜짐 위치로 전환하여 티타늄 사파이어 레이저를 켜고 레이저가 예열될 때까지 30분 동안 기다립니다. 그런 다음 OPO 제어판의 시작 버튼을 클릭하여 OPO를 켜고 레이저가 예열될 때까지 20분 동안 기다립니다. 피코초 레이저가 예열되면 스톡스 빔의 전력을 약 20밀리와트로 낮추고 스토크스 빔의 레이저 셔터를 열고 OPO 출력에 고속 사진 검출기를 배치하여 빔을 감지하여 스토크스 빔의 변조 깊이를 확인합니다.그런 다음 BNC 커넥터가있는 동축 케이블을 사용하여 광검출기의 출력 포트를 오실로스코프의 입력 포트에 연결하여 레이저 펄스를 모니터링하십시오. 그런 다음 OPO 제어 소프트웨어에서 EOM 제어 창을 열고 오실로스코프에 표시된 펄스 강도 다이어그램에 따라 EOM 전력 및 위상을 조정하여 20메가헤르츠에서 최대 변조 깊이를 달성합니다. OPO 제어 소프트웨어에서 Stokes 출력을 중지하면서 펌프 레이저 셔터를 엽니다.그런 다음 신호 설정 상자를 클릭하여 펌프 빔의 파장을 796 나노 미터로 설정 한 다음 OPO 전원 상자 설정을 클릭하고 20을 입력하여 광 정렬을 위해 전력을 최소로 설정하십시오. 다음으로, 편광 빔 스플리터 뒤에 정렬 플레이트 P1을 약 10cm로 놓고 P1 뒤에 플레이트 P2를 광학 경로의 약 30cm로 배치합니다. 피코초 레이저 빔의 현미경 셔터를 연 후 미러 M1을 조정하여 P1의 관통 구멍에서 피코초 레이저 빔 중심을 찾습니다. 적외선 스코프를 사용하여 미러 M1을 조정할 때 P1에서 빔 스폿의 위치를 관찰하십시오. 마찬가지로, 미러 M2를 조정하여 P2의 관통 구멍에서 피코초 레이저 빔 중심을 찾습니다. 적외선 스코프를 사용하여 미러 M2를 조정할 때 P2에서 빔 스폿의 위치를 관찰하십시오. 피코초 빔 중심이 두 정렬 플레이트의 관통 구멍에 위치 할 때까지 거울을 조정 한 후 현미경 제어 소프트웨어에서 피코초 빔의 셔터를 닫습니다.다음으로, 펨토초 레이저 빔의 현미경 셔터를 엽니다. 미러 M3을 조정하여 P1의 관통 구멍에서 펨토초 레이저 빔 스폿 중심을 찾은 다음 미러 M4를 조정하여 P2의 관통 구멍에서 펨토초 레이저 빔 스폿 중심을 찾습니다. 펨토초 레이저 빔 중심이 두 정렬 플레이트의 관통 구멍에 위치할 때까지 미러를 조정한 후 펨토초 빔의 현미경 셔터를 닫습니다. 다음으로, 목표의 위치에 카메라를 배치하여 두 빔 지점의 위치를 시각화하고 카메라 화면에 펌프 빔의 위치를 참조로 표시합니다.그런 다음 렌즈 L3 앞에 정렬 플레이트 P0을 놓고 육각 키를 사용하여 광학 미러 하나를 조정하여 스톡스 빔 중심이 레이저 출력 포트에서 정렬 플레이트의 관통 구멍을 통과하도록하십시오. 적외선 범위를 사용하여 조정 중에 P0에서 빔 스폿의 위치를 확인합니다. 그런 다음 정렬 플레이트 P0을 제거하고 육각 키를 사용하여 광학 미러 두 개를 조정하여 Stokes 빔의 중심이 카메라의 펌프 빔의 참조 표시와 함께 함께 로컬링되도록 합니다.Stokes 빔이 P0 및 카메라 평면의 펌프 빔과 엄격하게 겹칠 때까지 미러를 계속 조정하십시오. 잠금 증폭기 제어 소프트웨어를 열고 펌프 레이저의 파장을 796나노미터로, 펌프 및 스토크스 빔의 전력을 샘플에서 각각 15밀리와트 및 25밀리와트에 해당하는 50 및 70밀리와트로 설정합니다. 그런 다음 잠금 증폭기 위상 최적화를 위해 올리브 오일을 사용하십시오.올리브 오일은 신호 다시 산란 또는 EPI-SRS 검출을 향상시키기 위해 바닥에 부착 된 티슈 페이퍼로 슬라이드에 밀봉됩니다. 올리브 오일 샘플을 무대에 놓고 25X 목표의 초점을 샘플에 조정하십시오. 현미경 제어 소프트웨어를 사용하여 텍스트 원고에 언급 된 이미징 매개 변수를 설정하십시오.그런 다음 잠금 증폭기 제어 소프트웨어를 사용하여 시간 상수 값을 10마이크로초로 설정합니다. 다음으로, 샘플 위에 레이저 빔을 스캔하여 SRS 신호 강도가 최대에 도달할 때까지 22.5도의 스텝 크기로 위상을 튜닝합니다. 그런 다음 레이저 셔터가 닫힌 상태에서 샘플을 스캔하고 평균 SRS 신호가 0에 가까워질 때까지 한 밀리볼트의 스텝 크기로 오프셋 값을 튜닝합니다.다음으로, OPO 제어 소프트웨어에서 지연 관리자 대화 상자를 열고 올리브 오일을 스캔하여 올리브 오일 SRS 신호가 최대에 도달 할 때까지 지연 단계를 조정하십시오. 그런 다음 스캔을 중지하고 지연 관리자 대화 상자에서 데이터 추가 버튼을 클릭하여 현재 지연 데이터를 기록하십시오. 다양한 화학 샘플을 이미징하여 서로 다른 라만 시프트에서 지연 데이터를 유사하게 획득한 후, 지연 관리자 대화상자에서 다섯 번째 순서로 적합한 데이터를 선택하여 현재 데이터 포인트를 다섯 번째 차수 다항식 함수에 맞춥니다.그런 다음 사용자 정의로 사용 버튼을 클릭하고 확인란을 선택하여 적합 데이터를 적용합니다. 지연 단계는 적합 지연 곡선에 따라 다른 파장에서 자동 조정됩니다. 생체 내 이미징의 경우, 척수가 노출되고 식염수에 담근 상태에서 안정화 단계에서 마우스를 고정시킵니다.이제 안정화 단계를 TPEF-SRS 현미경 아래의 다섯 축 스테이지에 장착합니다. 그런 다음 두 개의 헤드 막대로 마우스 헤드를 고정하고 홀딩 플레이트를 내려 호흡 중 가슴 운동을위한 충분한 공간을 제공하여 모션 아티팩트를 완화시킵니다. 다음으로, 척수 혈관구조의 Brightfield 이미지가 10X 목표 하에서 관찰될 수 있을 때까지 초점을 조정하도록 Z-번역 단계를 조정한다.다섯 축 단계의 두 축 번역 단계를 조정하여 시야의 중앙에 척수 등정맥을 찾습니다. 다음으로, 다섯 축 스테이지의 롤 및 피치 각도를 조정하여 Brightfield 이미지를 기반으로 목표 축에 수직인 척수 등쪽 표면을 조정합니다. 그런 다음 10X를 TPEF-SRS 이미징을 위한 25X 수침 목표로 교체합니다.SRS 이미징의 경우, 전동 플리퍼에 연결된 스위치 버튼을 눌러 목표 위의 편광 빔 스플리터를 선택합니다. TPEF 이미징의 경우 전동 플리퍼에 연결된 스위치 버튼을 눌러 목표 위의 이색성 미러 D2를 선택합니다. 마지막으로 텍스트 원고에 설명된 대로 이미징 매개 변수를 설정하고 샘플 스캔을 시작합니다.마우스 척수에서 드물게 표지된 YFP 축색돌기와 미엘린 외피의 생체내 이중 모달 영상은 축삭이 미엘린 외피의 두꺼운 층에 의해 밀접하게 감싸져 있음을 밝혀냈다. TPEF-SRS 척수 이미지에서 볼 수 있듯이, 랜비어의 노드는 축삭 직경이 감소하고 겨드랑이마는 세포외 매트릭스에 직접 노출된다. 형광 및 SRS 이미징을 위한 새로운 프로브와 결합하여 이광자 여기된 형광 SRS 현미경은 다양한 생체 분자의 구조적 및 기능적 이미징을 동시에 달성하여 복잡한 생물학적 과정에 대한 이해를 촉진할 수 있습니다.

in-vivo-imaging-biological-tissues-with-combined-two-photon

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

출처: Espinoza, R., et al. 조직 진단을 위한 마우스 뇌의 실시간 2색 자극 라만 산란 영상. J. Vis. Exp. (2022).  이 비디오는 쥐의 뇌 조직 절편에 대한 2색 자극 라만 산란(SRS) 이미징을 보여줍니다. 두 개의 동기화된 레이저 빔이 조직 부분으로 향하여 분자 진동을 여기시켜 빔의 상대적인 강도 변화를 초래합니다. 조직의 지질과 단백질은 레이저 빔의 고유한 주파수 쌍을 사용하여 검출됩니다. 그런 다음 결과 신호에 별도의 색상이 할당되어 조직의 단백질과 지질을 식별하는 데 도움이 되는 2색 이미지를 생성합니다.

마우스 뇌 조직의 2색 자극 라만 산란 이미징

분자 결합의 고유 진동에 따라 코 히어 런트 반 스톡스 라만 산란 (CARS) 현미경 레이블없는 화학적으로 선택적 라이브 세포 이미징을 허용합니다. 사파이어 레이저와 OPO 레이저 본 작업은 펨토초의 Ti에 기초한 표준 광자 레이저 스캐닝 현미경에 상보 현미경 기술의 구현을 제공한다.

사파이어와 OPO 레이저 기반 표준 레이저 스캐닝 현미경 :에 Ti에 코 히어 런트 반 스톡스 라만 산란 (CARS) 시스템의 구현

이 원고에서, 레이저 스캐닝 현미경과 SRS 실험 설정의 통합에 의해 얻어진 자극된 라만 산란(SRS) 현미경의 구현이 설명된다. SRS 현미경은 두 개의 펨토초(fs) 레이저 소스, Ti-Sapphire(Ti:Sa) 및 동기화된 광학 파라메트릭 발진기(OPO)를 기반으로 합니다.

자극된 라만 산란을 기반으로 한 비선형 현미경 구현

형태학적 변화는 활성화 다음 면역 반응 섬유 아세포 세포에서 발생하고 세포 모집에 변경을 촉진. 유전자 조작섬유아세포 특이적 단백질 1(FSP1)-cre와 함께 2광자 이미징을 활용; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) 마우스 라인과 녹색 형광 태그 lipopolysaccharide-FITC, 우리는 진피 섬유아세포와 생체 내 형태학적 변화에 있는 lipopolysaccharide의 고도로 특정 한 섭취를 설명할 수 있습니다.

피부에 있는 유전으로 표를 붙인 기자 세포의 Vivo 2 색 2-광자 화상 진찰에서

자극라만 산란 (SRS) 현미경 검사법은 특정 화학 적 moieties의 선택적, 라벨없는 이미징을 허용하고 효과적으로 생체 내에서 지질 분자를 이미지하기 위해 사용되었습니다. 여기에서, 우리는 SRS 현미경 검사법의 원리에 대한 간략한 소개를 제공하고 Caenorhabditis elegans에있는 지질 저장에 그것의 사용을 위한 방법을 기술합니다.

자극라만 산란 현미경 검사를 사용하여 Caenorhabditis elegans의 지질 저장 역학의 라벨 프리 이미징

자극된 라만 산란(SRS) 현미경은 강력하고 비파괴적이며 라벨이 없는 이미징 기술입니다. 한 가지 새로운 응용 분야는 자극 라만 조직학이며, 여기서 단백질과 지질 라만 전이에서 두 가지 컬러 SRS 이미징이 의사 헤마톡실린 및 에오신 이미지를 생성하는 데 사용됩니다. 여기에서는 조직 진단을 위한 실시간 이색 SRS 이미징을 위한 프로토콜을 시연합니다.

조직 진단을 위한 마우스 뇌의 실시간 두 가지 색상 자극 라만 산란 영상

무지개 유사 라만 염료의 전자 사전 공명 자극 라만 산란 (epr-SRS) 이미징은 고도로 다중화 된 에피토프 기반 단백질 이미징을위한 새로운 플랫폼입니다. 여기에서는 항체 준비, 조직 샘플 염색, SRS 현미경 어셈블리 및 epr-SRS 조직 이미징을 포함한 실용적인 가이드를 제시합니다.

라만 염료를 이용한 고도의 다중화 조직 이미징

이 논문은 동일한 현미경 플랫폼에 통합 된 자극 된 라만 산란 (SRS)과 일관된 스토크스 라만 산란 (CARS)의 해상도, 감도 및 이미징 대비를 직접 비교합니다. 결과는 CARS가 더 나은 공간 분해능을 가지며, SRS는 더 나은 콘트라스트와 스펙트럼 분해능을 제공하며, 두 방법 모두 비슷한 감도를 가지고 있음을 보여줍니다.

화학 이미징을 위한 하이퍼스펙트럼 자극 라만 산란 및 일관된 안티스토크스 라만 산란 현미경의 직접 비교

우리는 광대역 자극 라만 산란 (SRS) 현미경으로 화학 이미지를 획득하기위한 프로토콜을 제시합니다. 차등 다중 채널 잠금 검출로 작동하는 SRS 현미경을 기반으로 하는 프로토콜은 시료 준비, SRS 장치의 조정 및 화학적으로 이질적인 샘플의 서로 다른 구성 요소를 분리하기 위한 화학측정법을 설명합니다.

광대역 자극 라만 산란 현미경을 기반으로 한 멀티플렉스 화학 이미징

label-free 광학 이미징 방식을 결합한 멀티모달 플랫폼을 활용하여 세포 역학 및 신진대사를 시각화하고 정량화하기 위한 프로토콜을 개발했습니다. 다광자 형광, 2차 고조파 생성 및 유도 라만 산란 현미경을 통한 이미징을 통해 세포 및 분자 환경에 대한 전체적인 개요를 생성할 수 있습니다.

세포 대사 연구를 위한 멀티모달 광학 이미징 플랫폼

배우세요 자극 라만 산란 및 이광자 형광 현미경을 결합한 이중 모달 이미징으로 생쥐 척수의 세포 구조를 라벨 없이 시각화하는 방법. 이 기술은 신경퇴행성 질환 및 척수 손상 연구에 필수적인 생화학 및 생물물리학 정보를 제공합니다.

생체 내 결합 된 이광자 형광 및 자극 된 라만 산란 현미경을 사용한 생물학적 조직 이미징

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