형광 이미징을 위한 식물 조직의 광학 클리어링

여기에서는 형광 단백질의 안정성을 유지하면서 식물 조직을 투명하게 만드는 방법에 대해 설명한다. 이 기술은 물리적 단면화없이 제거 된 식물 조직의 깊은 이미징을 용이하게합니다.

이 방법은 온전한 형태학, 발달 과정 및 식물 - 미생물 상호 작용을 드러내기 위해 전체 식물 이미징에 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 식물체에 손상을 입히지 않고 식물 몸체의 내부를 직접 관찰 할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 광범위한 식물 종과 조직에 적용되므로 식물 생물 연구에서 새로운 현상의 발견을 가속화하는 데 도움이 될 수 있습니다.

고정은 이 절차에서 중요한 단계입니다. 클리어링 단계 전에, 하나는 고정 후 형광 단백질의 강도를 확인해야합니다. 식물 샘플을 마이크로 튜브의 고정 용액에 침지하기 시작하고, 고정 용액의 부피가 샘플 부피의 다섯 배 이상인지 확인하십시오.

마이크로 튜브를 파라 필름으로 밀봉하고 바늘을 사용하여 구멍을 뚫습니다. 마이크로 튜브를 데시케이터에 놓고 진공도를 약 690 밀리미터의 수은으로 천천히 조정하여 기포가 샘플에서 서서히 나타나도록하십시오. 건조기를 배출 한 후 진공 펌프를 끕니다.

시료를 방해하지 않고 건조제를 조심스럽게 배출하십시오. 진공 펌프를 다시 켜고 데시케이터를 배출 한 후 전원을 끕니다. 마이크로튜브의 고정 용액을 부딪히지 않고 데시케이터를 조심스럽게 엽니다.

고정 용액을 제거하고 마이크로 피펫으로 1x PBS를 추가하십시오. 1분 동안 저장한 후 기존 PBS를 새 1x PBS로 교체합니다. 클리어링 용액의 샘플 부피의 다섯 배에서 PBS를 제거한 후, 마이크로 튜브를 파라필름으로 밀봉하고 바늘로 구멍을 뚫었다.

샘플을 건조기에 넣습니다. 진공 펌프를 대피시키고 끕니다. 데시케이터를 부드럽게 연 다음 마이크로튜브를 닫습니다.

마이크로 튜브를 반전, 청소 과정을 가속화하기 위해 일에서 이틀마다. 스페이서 프레임의 경우, 실리콘 고무 시트를 면도날로 절단하여 샘플 두께에 따라 실리콘 고무 시트 두께를 조정한다. 실리콘 프레임을 커버 글라스 위에 놓은 다음 처리 된 샘플을 프레임 내에 놓고 약 100 마이크로 리터의 제거 용액을 첨가하여 기포를 제거하십시오.

클리어링 용액의 증발을 방지하기 위해 다른 커버 글래스로 덮으십시오. 샘플을 형광 현미경으로 관찰하십시오. 관찰 후 샘플을 마이크로튜브 내의 클리어링 용액으로 복귀시킨다.

다양한 종의 고정된 잎을 이틀 동안 PBS 또는 ClearSee에서 여덟 일 동안, ClearSee 또는 ClearSeeAlpha에서 배양하였다. ClearSee는 다양한 종의 잎을 맑게 할 수 있습니다. 큐티큘러를 추출한 후, ClearSee는 쌀잎을 맑게 할 수 있었습니다.

ClearSeeAlpha의 아황산나트륨 성분은 환원 효과로 인한 폴리페놀 산화를 방지하므로 ClearSeeAlpha는 갈색 색소 침착없이 담배와 티라니아 피스틸을 제거 할 수 있습니다. 애기장대의 유비퀴틴-10 프로모터 H2B-mClover 잎을 사흘 동안 PBS 또는 ClearSee로 처리하였다. 클리어시브 처리는 애기장대 H2B-m클로버 잎의 옅은 녹색을 감소시키고 PBS 인큐베이션과 비교하여 H2B-m클로버의 형광 강도를 향상시켰다.

ClearSee 처리된 잎은 950 나노미터 여기로 이광자 여기 현미경으로 관찰되었다. 세포벽은 칼카가루-화이트로 염색된다. 핵은 유비퀴틴-10 프로모터, H2B-mClover로 표지된다.

Y Z 및 X Z 이미지는 흰색 점선으로 표시된 위치의 단면입니다. 고정 용액의 준비는 샘플을 고정시키는 데 중요합니다. 그러나 진공 상태에서 샘플의 손상을 방지하기 위해주의를 기울여야합니다.

현미경 이미징은 이 절차에 따라 식물 발달 및 감염 동안 다수의 유전자 발현 패턴 및 세포내 통신을 연구하기 위해 수행될 수 있다.