Name: 식물 - 곰팡이 상호 작용에서 펙틴을 검출하는 이중 염색 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: 학습하세요 커피 잎에서 펙틴을 검출하는 이중 염색 방법으로 식물-곰팡이 상호 작용을 관찰하는 기법입니다. 이 방법은 생물영양성 및 부패영양성 병원균을 진단하는 데 활용됩니다.

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저자들은 허드슨 W. P. 드 카르발호 박사에게 이 작품을 개발하기 위한 지원에 감사를 표하고 싶다. 저자들은 또한 광 현미경 검사 시설을 제공 한 전자 현미경 연구소 ''엘리엇 와타나베 키타 지마 교수''에 감사드립니다. 저자들은 식물 재료에 병변을 공급해 준 Flávia Rodrigues Alves Patrício 박사에게 감사드립니다.

1. 완충용액 및 시약의 제조
<ol><li>증류수 100 mL에 카코딜레이트 나트륨 4.28 g을 첨가하여 2 M 카코딜레이트 완충액을 제조하고 0.2 N HCl로 pH를 7.25로 조정하였다.</li>
	<li>100 mL의 25% 수성 글루타르알데히드, 10% 수성 포름알데히드 10 mL, 25 mL의 2 M 카코딜레이트 완충액, 및 0.5 mL의 0.5 MCaCl2 26을 혼합하여 카르노프스키 고정제 용액 100 mL를 제조하였다. 증류수로 부피를 100 mL까지 구성하십시오. 참고 : 솔루션은 6 개월 동안 냉장고에 보관할 수 있습니다. 주의: 카코딜레이트 완충 용액은 독성이 있습니다. 따라서 흄 후드 또는 열린 영역에서 고정 솔루션을 처리하십시오. 취급하는 동안 용액 증기를 흡입하지 말고 장갑을 착용하십시오.</li>
	<li>다음을 혼합하여 Hoagland 수성 영양액을 제조하였다: 3 mM Ca(NO3)2.4H2O, 2 mM NH4H2PO4, 5 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4.7H2O, 9.07 mM MnSO4, 0.765 mM ZnSO4.7H2O, 46.4 mM H3BO3, 0.09 mMNa2MoO4. H2O, 0.01 mM CuSO4, 및 36 mM FeSO4.7H2O로서철-EDTA (에틸렌디아민테트라아세트산)27.</li>
</ol>2. 식물 샘플 및 곰팡이 접종
참고 : 커피 녹에 의해 영향을받는 잎에 대한 실험의 경우, 커피 아라비카 cv의 다섯 2 개월 된 묘목. Catuaí는 브라질 상파울루 주 피라시카바 상파울루 대학의 농업 원자력 에너지 센터 (CENA)의 온실에서 재배되고 보관되었습니다.
<ol><li>Hoagland 수용액(pH∼5.5)으로 채워진 500 mL 플라스틱 냄비에 커피 식물을 재배하고, 27 ± 3°C로 유지된 성장 챔버에서 250 μmol 광자 s-1 m-2 의 광자 플럭스에서 LED 램프에 의해 생성된 12시간 광주기로 4개월 동안 성장시킨다. Hoagland 영양 용액을 4 개월 동안 매주 교체하십시오.</li>
	<li>다섯 개의 식물로부터 네 개의 확장된 잎을 그들의 비축 표면에 1 x 103H. vastatrix 우레도포자로 접종하고, 참고문헌28에 기재된 방법에 따른다. 예방 접종 후, 검은 비닐 봉지로 식물을 덮어서 어둠 속에서 48 시간 동안 보관하십시오. 접종 후 30 일 후에 병변을 수확하십시오. </li>
	<li>Coffea arabica cv의 Cercospora coffeicola에 의한 수확 특징적인 병변. Obatã 식물은 브라질 상파울루 주 캄피나스 생물 연구소에 위치하고 있습니다 (좌표 : -22.906506126269942, -47.015075902025266). 샘플을 처리하기 전에 입체 현미경으로 병변을 분석하여 커피 C. coffeicola conidia의 존재를 확인합니다. 이어서, 질병 병인학(22)을 확인하기 위해 코니디아와 함께 일부 슬라이드를 장착한다.</li>
</ol>3. 샘플 수확, 고정 및 탈수
<ol><li>메스와 트위저를 사용하여, 병변의 중간 부위에서 ∼10mm2 잎 샘플을 수확한다(황색 반점; 그림 1) 30mL의 Karnovsky 고정 용액에 담그십시오(그림 1 및 그림 2A). 고정 단계는 냉장고에서 48 시간 동안 수행 할 수 있습니다.</li>
	<li>적어도 4회 동안, 잎 샘플을 저진공(500-600 mBar)으로 하여 각각 15분 동안 오일 펌프를 사용하여 잎 조직 내의 고정 용액의 투과성을 증가시켰다. 샘플 회전을 사용하여 이 단계를 수행합니다(그림 1).</li>
	<li>고정 후, 잎 샘플을 증류수에 희석한 0.5 M 카코딜레이트 완충액(pH 7.2)에서 각각 5분 동안 3회 세척한 다음, 이를 등급별 에탄올 계열(30%, 50%, 70%, 90%(2x) 및 100%(2x))로 옮겨 각 에탄올 농도에서 15분 동안 처리하였다(도 1 및 도 2B).</li>
</ol>4. 고용인 임베딩 절차
<ol><li>점차적으로 샘플을 글리콜 메타 크릴 레이트 (GMA)로 세 단계로 옮기고 제조업체의 지시에 따라 수행하십시오. 먼저, GMA 분말(1 g)을 100 mL의 염기성 수지(historesin kit; 물자 표) 자기 교반하에 아래 단계를 따르십시오.<ol>
<li>샘플을 1:2 용액 A:100% 에탄올에 3시간 동안 담그십시오.</li>
		<li>샘플을 1:1 용액 A:100% 에탄올에 3시간 동안 침지시킨다.</li>
		<li>샘플을 2-4 일 동안 순수한 염기성 수지에 담그십시오. 이 단계 동안, 샘플을 15분 동안 하루에 적어도 네 번 저진공으로 가하고, 이어서 회전시킨다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 중합
참고: 중합 공정에는 1.2mL 플라스틱 몰드, 기본 수지 및 경화제가 필요합니다(상업용 키트의 자세한 내용은 재료 표 참조).
<ol><li>용액 A 15 mL(단계 4.1)를 비이커에서 경화제 1 mL와 섞어 2분 동안 회전시켜 중합 용액(용액 B)을 생성한다.</li>
	<li>중합 용액 (용액 B) 1.2 mL를 플라스틱 몰드에 넣는다. 나무 픽을 사용하여 병변 잎 샘플을 순수한 기본 수지에서 용액 B로 옮깁니다 (그림 2C). 핀셋은 조직 분쇄를 일으킬 수 있으므로 사용하지 마십시오.</li>
	<li>용액 B가 5분 이내에 빠르게 점성이 되므로 잎 샘플을 플라스틱 몰드에 수직으로 신속하게 방향을 정하십시오. 하나 이상의 병변 잎 샘플을 단일 주형에 배치할 수 있다. 참고 : 많은 샘플을 신청하기 전에 위의 단계를 여러 번 연습하는 것이 좋습니다. 많은 샘플이 존재하는 경우, 주형들 사이에서 중합 시간이 상이하고, 잎 샘플의 수직 배향은 달성하기 어려울 수 있다.</li>
	<li>잎 샘플의 수직 방향이 달성되면 30 분 동안 기다린 다음 플라스틱 몰드를 실리카 겔이 들어있는 플라스틱 또는 유리 챔버로 옮겨 습도를 방지하십시오. 중합을 위해 2-3 시간 동안 기다리십시오.</li>
	<li>일단 수지와 잎 샘플이 2-3 h 기간 후에 중합되면, 블록 베이스를 샌딩 파일로 샌딩하여 생성된 블록을 플라스틱 몰드로부터 분리한다. 그런 다음 블록을 나무 조각에 붙입니다(그림 2D).</li>
</ol>6. 단면화
<ol><li>8cm 강철 블레이드가 장착된 회전식 마이크로톰(그림 2E)을 사용하여 블록을 5μm 두께의 섹션으로 자릅니다. 섹션을 증류수로 덮인 유리 슬라이드 위에 놓습니다. 물 위에 떠 있는 섹션과 함께 슬라이드를 40°C의 핫플레이트로 옮겨 건조시키고 유리 슬라이드에 대한 섹션의 접착을 촉진한다.</li>
	<li>건조 후(그림 2F), 유리 슬라이드에 블록 참조 이름과 슬라이드 번호로 레이블을 붙입니다.</li>
</ol>7. 이중 염색 과정
<ol><li>섹션을 락토페놀(물 중 40% 글리세롤, 20% 페놀 및 20% 젖산)의 5% 코튼 블루 2mL로 덮고 45°C에서 5분 동안 핫플레이트에서 가열합니다(그림 3A).</li>
	<li>슬라이드를 증류수로 채워진 비이커에서 3회 세척하여 과량의 염료를 제거하였다(도 3B-D).</li>
	<li>2 mL의 0.01% 루테늄 레드를 물에 1분 동안 얼룩지게 한다(그림 3E).</li>
	<li>증류수가 채워진 비이커에서 슬라이드를 3회 세척하여 과량의 염료를 제거하였다(도 3F, G).</li>
	<li>섹션 위에 증류수 한 방울을 넣고 가벼운 현미경 분석을 수행하기 위해 24mm x 60mm 커버슬립으로 섹션을 덮습니다.</li>
</ol>

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저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

본 연구는 생물영양 병리계에서 하우스토리아를 캡슐화하는 세포벽의 펙틴 조성을 조사하기 위해 대안적인 이중 염색 조직화학 시험을 도입한다. 그 목적은 또한 그것에 의해 유도된 괴사성 균류 및 세포벽 변화를 검출하는 방법의 효능을 입증하는 것이다. 여기서, 커피 실질마 세포벽의 펙틴은 녹균인 헤밀리아 혈관염의 목과 하우스토리움을 모두 캡슐화할 수 있다. 실바 등은 또한 커피-H. 바스타트릭스 파토스14,29에서 셀룰로스 및 칼로스에 의한 캡슐화를 기술하였다. 방어 메카니즘과 관련된 세포벽 폴리머 중에서, 펙틴은 식물-병원체 시스템(10,11,12)에서 중요한 역할을 한다. 따라서 펙틴 기능에 대한 지식은 조직병리학적으로 큰 가치가 ...

식물의 세포벽 방어 메커니즘은 곰팡이 감염을 억제하는 데 중요합니다. 연구에 따르면 19세기 1,2 이후 세포벽 두께와 조성의 변화가보고되었습니다. 이러한 변화는 유두의 형성을 자극하는 곰팡이 병원체에 의해 유도 될 수 있으며, 이는 곰팡이가 세포에 들어가는 것을 방지하거나 진균 성 하우스토리아에서 숙주 세포 원형질체를 분리하기 위해 균사를 캡슐화하는 데 사용될 수 있습니다. 동적 세포벽 장벽 (즉, 유두와 완전히 둘러싸인 haustorium)의 생산은 식물 저항을 촉진시키는 데 중요합니다3. 곰팡이 관련 질환에 대한 조직병리학적 연구는 이러한 메카니즘의 발생을 조사하였고, 진균 공격에 대한 내성 메카니즘으로서 세포벽 중합체, 셀룰로스, 헤미셀룰로오스(arabinoxylans) 및 칼로스를기술하였다 4,5,6,7.
세포벽은 미생물 공격에 대한 첫 번째 장벽으로, 식물과 곰팡이 상호 작용을 손상시킵니다. 펙틱 다당류는 세포벽을 구성하며 호모갈락투로난이 가장 풍부한 폴리머인 유디코트 식물의 일차 세포에서 세포벽 조성물의 약 30%를 차지한다(대략 60%)8. 골지는 갈락투론산 사슬을 포함하는 복합 펙틴 화합물을 분비하며, 이는메틸화 8,9일 수도 있고 아닐 수도 있다. 2012 이후, 문헌은 펙틴 메틸 에스테르 화의 정도가 미생물 펙틱 효소10,11,12에 의한 감염시 상용성을 결정하는 데 중요하다고 지적했다. 따라서, 식물-진균 병리계에서 펙틱 화합물의 존재 및 분포를 검증하기 위한 프로토콜이 요구된다.
유두나 하우스토리아의 캡슐화를 검출하기 위해 다양한 기술들이 사용되어 왔다. 사용 된 참조 방법은 고정 조직의 투과 전자 현미경 (TEM)과 살아있는 및 고정 조직의 광 현미경입니다. TEM과 관련하여, 몇몇 연구는 곰팡이 저항성 13,14,15,16에서 세포벽 임명의 구조적 역할을 입증했으며, 렉틴과 항체의 사용은 탄수화물 중합체16을 위치시키는 복잡한 방법이라는 것을 입증했다. 그러나 연구에 따르면 광 현미경 검사는 중요한 접근법이며 조직 화학 및 면역 조직 화학 도구는 유두와 haustorium encasement 6,7의 구성을 더 잘 이해할 수 있습니다.
병원성 곰팡이는 두 가지 주요 유형의 생활 방식을 보여줍니다 : 생물 영양 및 괴사. 생물 영양 진균은 영양을 위해 살아있는 세포에 의존하는 반면, 괴사 성 곰팡이는 숙주 세포를 죽인 다음 죽은 조직에 산다17. 라틴 아메리카에서는 곰팡이 헤밀리아 vastatrix에 의해 야기 된 커피 잎 녹이 커피 작물에서 중요한 질병입니다18,19. 헤밀리아 바스타트릭스는 생물영양 거동을 나타내고, 내성 커피 종 또는 품종에서 관찰된 구조적 변화 중에서도, 과민성 반응, 세포벽 상에 칼로스, 셀룰로스 및 리그닌의 침착, 뿐만 아니라 세포 비대(14)가 보고되었다. 저자의 지식에 따르면, 문헌은 커피 녹 저항에서 펙틴의 중요성에 대한 정보를보고하지 않습니다. 한편, 자궁경부정맥증을 유발하는 괴사성 진균은 펙티나제 및 폴리갈락투로나제20과 같은 세포벽 분해와 관련된 일련의 효소를 통해 펙틴을 표적으로 한다. 곰팡이 Cercospora coffeicola에 의해 야기 된 커피의 Cercosporiosis는 또한 커피 작물21,22에 대한 주요 위협입니다. 이 곰팡이는 잎과 열매 모두에서 괴사 성 병변을 일으 킵니다. 침투 후, C. coffeicola는 세포 내 및 세포 간 경로23,24,25를 통해 식물 조직을 식민지화합니다.
본 프로토콜은 세포벽에 곰팡이 구조 및 펙틴의 존재를 조사한다. 이 프로토콜은 곰팡이와의 생체 영양 상호 작용에서 숙주에 의해 유도되는 펙틴 (펙틴의 폴리 우론 산의 산성 그룹에 특이적인 루테늄 레드 염료로 염색)과 관련된 식물 반응을 확인하는 데 유용합니다. 또한 괴사 성 곰팡이가 펙트 세포벽의 분해에 미치는 영향을 확인하는 데 도움이됩니다. 본 결과는 이중 염색 방법이 곰팡이의 구조와 생식 단계를 구별하는 데 효과적이라는 것을 나타냅니다.

<table><tbody><tr><td>블레이드 DB80 HS</td><td>Leica</td><td></td><td>14035838383 Sectioning</td></tr><tr><td>Cacodylate buffer</td><td>EMS</td> <td># 11652</td><td>고정</td></tr><tr><td>코튼 블루 Lactophenol</td><td>Metaqu&iacute; 운모</td><td>70SOLSIG024629</td><td>염색</td></tr><tr><td>포름알데히드</td><td>EMS</td><td>#15712</td><td>고정</td></tr><tr><td>글루타르알데히드</td><td>EMS</td><td>#16216</td><td>고정</td></tr><tr><td>히스토레신 키트</td><td>Technovit /EMS</td><td>#14653</td><td>임베딩용 히스토레신</td></tr><tr><td>핫 플레이트</td><td>Dubesser</td><td>SSCD25X30-110V</td><td>염색</td></tr><tr><td>현미경</td><td>Zeiss</td><td>#490040-0030-000</td><td>이미지 캡처</td></tr><tr><td>Microtome (Leica RM 2540)</td><td>Leica</td><td>149BIO000C1 14050238005</td><td>Sectioning</td></tr><tr><td>Plastic molding cup tray</td><td>EMS</td><td>10176-30</td><td>Staining</td></tr><tr><td>Ruthenium red</td><td>LABHouse</td><td>#006004</td><td></td></tr><tr><td>Staining Software Axion Vision</td><td>Zeiss</td><td>#410130-0909-000</td><td>이미지 캡처</td></tr><tr><td>진공 펌프</td><td>Prismatec</td><td>131 TIPO 2 V.C.</td><td>고정</td></tr></tbody></table>

식물 - 곰팡이 상호 작용에서 펙틴을 검출하는 이중 염색 방법

Double-Staining Method to Detect Pectin in Plant-Fungus Interaction

식물 세포는 곰팡이 감염으로부터 자신을 방어하기 위해 구성 적 또는 유도성 인 다른 구조적 메커니즘을 사용합니다. 캡슐화는 식물 세포 원형질체로부터 진균성 하우스토리아를 분리하는 효율적인 유도성 메카니즘이다. 반대로, 세포벽의 고분자 성분 중 하나 인 펙틴은 괴사 성 상호 작용에서 여러 펙톨리아 효소의 표적입니다. 여기에서, 광학 현미경을 통해 펙틴 및 진균 균사를 검출하는 프로토콜이 제시된다. 녹균인 헤밀리아 바스타트릭 스에 의해 감염된 커피 잎의 세포에서 펙틴이 풍부한 캡슐화와 세르코스포라 코페이콜라 에 의해 유도된 중엽 세포벽 변형이 조사된다. Lesioned 잎 샘플을 Karnovsky 용액으로 고정시키고, 탈수시키고, 2-4일 동안 글리콜 메타크릴레이트에 포매하였다. 모든 단계는 세포간 공간에서 공기를 제거하고 매립 과정을 개선하기 위해 진공 펌핑으로 이어졌다. 매립된 블록을 5-7 μm 두께의 섹션으로 절편화하고, 물로 덮인 유리 슬라이드 상에 증착시키고, 이어서 40°C에서 30분 동안 가열하였다. 다음으로, 슬라이드를 락토페놀 중의 5% 코튼 블루로 이중 염색하여 곰팡이를 검출하고, 물에서 0.05% 루테늄 레드로 염색하여 펙틴(펙틴의 폴리우론산의 산성기)을 검출하였다. Hemileia vastatrix 의 곰팡이 haustoria는 펙틴에 의해 캡슐화 된 것으로 밝혀졌습니다. 커피 자궁 경부증에서 중엽 세포는 세포벽의 용해를 나타 냈으며 세포 간 균사와 conidiophores가 관찰되었습니다. 여기에 제시된 방법은 식물-진균 상호작용에서 펙틴-관련 반응을 검출하는데 효과적이다.

GMA 임베디드 섹션의 코튼 블루 락토페놀 염색은 생영양 및 괴사성 진균 상호작용 모두에서 커피 메소필 세포 사이와 내부 사이에 여러 곰팡이 구조의 존재를 밝혀냈다.
생물영양 병리계에서, 이중 염색 방법을 사용하여 염색할 때, 세포벽 및 치밀한 원형질체 함량을 함유하는 헤밀리아 vastatrix hyphae는 해면질과 팰리세이드 실질종 모두에서 진한 파란색으로 나타난다(도 4A,B). haustorium 모세포 (Hmc) 및 haustoria는 또한 강한 진한 청색을 나타낸다 (그림 4C). 루테늄 적색으로 역염색할 때, 세포간 공간에서의 진균 분포가 명확하게 정의된다(그림 4D). 진한 파란색 Hmc의 존재는 감염 영역을 감지하는 데 도움이됩니다. 상호 작용 중에 H...

이 프로토콜은 커피-곰팡이 상호작용에서 펙틴을 검출하는 현미경 방법을 기술한다.

Plant cells use different structural mechanisms, either constitutive or inducible, to defend themselves from fungal infection. Encapsulation is an ...

이 프로토콜은 식물-곰팡이 상호작용을 식별할 수 있게 하기 때문에 중요하다. 펙틴을 착색하는 것 외에도 병원균 세포벽 중합체의 결함을 입증하고 곰팡이 구조를 식별 할 수 있습니다. 이 간단하고 복잡하지 않은 기술은 광 현미경을 사용하여 수행 할 수 있으며 주사 전자 현미경과 같은 값 비싼 장비가 필요하지 않습니다.또한, 그것은 조직 병리학 적 연구를위한 식물 구조의 우수한 구별을 얻는 빠른 기술입니다. 이 기술은 식물 - 곰팡이 상호 작용을 식별합니다. 따라서 커피 녹 및 자궁 경부 스포리증과 같은 생물 영양 및 괴사 성 곰팡이로 인한 질병을 진단하기 위해 협력합니다.시작하려면, 메스와 트위저를 사용하여 병변의 중간 영역에서 약 10 평방 밀리미터 잎 샘플을 수확하고, 그것을 30 밀리리터의 Karnovsky 고정 용액에 담그십시오. 잎 샘플을 오일 펌프를 사용하여 15분 동안 500 내지 600 밀리바의 저진공으로 피험하고, 잎 조직 내의 고정 용액의 투과성을 증가시키기 위해 적어도 4배 이상 실시한다. 고정 후, 잎 샘플을 증류수에 희석한 0.5 M 카코딜레이트 완충액으로 각각 5분 동안 세 번 세척한 다음, 각 에탄올 농도에서 15분 동안 등급화된 에탄올 시리즈로 옮긴다.샘플을 글리콜 메타크릴레이트로 점진적으로 옮기기 위해, 자기 교반 하에 글리콜 메타크릴레이트 분말 1그램을 100 밀리리터의 염기성 수지와 혼합함으로써 용액 A를 만든다. 이어서, 샘플을 용액 A 및 100%에탄올 중 하나 내지 두 개의 비율로 세 시간 동안 침지시킨다. 샘플을 용액 A:100%에탄올에 대해 1 대 1의 비율로 세 시간 동안 침지시킨 다음, 이틀 내지 나흘 동안 순수한 염기성 수지에 침지하였다.샘플을 15분 동안 하루에 적어도 네 번 저진공으로 가하고, 이어서 회전시켰다. 15 밀리리터의 용액 A를 비이커에서 경화제 1 밀리리터와 섞어서 2 분 동안 회전시켜 중합 용액 B.이 중합 용액 B의 1.2 밀리리터를 플라스틱 몰드에 넣는다. 나무 픽을 사용하여 병변 잎 샘플을 순수한 기본 수지에서 용액 B로 옮기고 핀셋을 사용하면 조직이 부서질 수 있으므로 핀셋을 사용하지 마십시오.용액 B가 빠르게 점성이 되므로 잎 샘플을 플라스틱 몰드에 수직으로 신속하게 방향을 정하십시오. 잎 샘플의 수직 방향이 달성되면 30 분 동안 기다린 다음 플라스틱 몰드를 실리카 겔이 들어있는 플라스틱 또는 유리 챔버로 옮겨 습도를 방지하십시오. 일단 수지와 잎 샘플이 두세 시간 후에 중합되면, 블록 베이스를 샌딩 파일로 샌딩하여 생성된 블록을 플라스틱 몰드로부터 분리한다.그런 다음 블록을 나무 조각에 붙입니다. 여덟 센티미터 강철 블레이드가 장착 된 회전 마이크로 톰을 사용하여 블록을 다섯 마이크로 미터 두께의 섹션으로 자릅니다. 섹션을 증류수로 덮인 유리 슬라이드 위에 놓습니다.그런 다음 슬라이드를 핫 플레이트로 옮겨 섭씨 40도에서 건조시키고 유리 슬라이드에 대한 섹션의 접착력을 촉진하십시오. 건조 후 유리 슬라이드에 블록 참조 이름과 슬라이드 번호로 레이블을 붙입니다. 락토페놀에 5 % 면화 파란색 두 밀리리터로 섹션을 덮고 섭씨 45도의 핫 플레이트에서 5 분 동안 가열하십시오.증류수가 채워진 비이커에서 슬라이드를 세 번 세척하여 과량의 염료를 제거한다. 1 분 동안 물에 0.01 % 루테늄 레드 두 밀리리터로 얼룩 지게하십시오. 증류수가 채워진 비이커에서 슬라이드를 세 번 세척하여 과량의 염료를 제거한다.섹션 위에 증류수 한 방울을 넣고 가벼운 현미경 분석을 수행하기위한 커버 슬립으로 섹션을 덮으십시오. 이중 염색 방법에서, 세포벽과 조밀한 원형질체 함량을 함유하는 헤밀리아 vastatrix hyphae는 해면질과 팰리세이드 실질 둘 다에서 진한 파란색으로 나타났다. haustorium 모세포와 haustoria는 또한 진한 파란색을 나타냈다.루테늄 레드로 염색된 카운터는 세포간 공간에서의 진균 분포를 명확하게 정의하였다. 상호 작용 동안, Hemileia vastatrix haustorium 모세포는 숙주 세포벽을 부수고 펙틱 화합물로 둘러싸인 haustorial 목을 개발했습니다. 펙틴이 풍부한 분홍색 - 붉은 색의 목의 캡슐화는 haustorial 형성을 막을 수 없습니다.어떤 경우에는 펙틴이 풍부한 캡슐화가 하우스토리움을 불완전하게 감싸 안았습니다. 그리고 어떤 경우에는 haustorium이 완전히 캡슐화됩니다. 펙틴이 풍부한 세포벽은 곰팡이가 존재하지 않는 병변 경계에서 무결성을 유지합니다.이중 염색 방법은 세포 간 균사의 존재를 입증했습니다. 상호작용 영역에서, 펙틴 세포벽은 용해로 인해 완전성을 잃는 것으로 나타났다. 코니디아와 같은 생식 구조는 부축 표피에서 발견되었습니다.Cercospora coffeicola hyphae는 컬링 구조로서 substomatic 챔버에서 발견되었고, 병변 부위의 팰리세이드 실질은 세포벽 용해를 겪는 것으로 보인다. 핀셋은 조직 분쇄를 일으킬 수 있으므로 사용하지 마십시오. 녹, 탄저병, 자궁 경부 스포리증, smuts 및 기타 생물 영양, 반생물 영양 및 괴사 성 식물 - 곰팡이 상호 작용에 대한 추가 조직 병리학 적 연구는 다른 병리학 시스템에서이 기술의 잠재적 인 사용을 조사하기 위해 수행되어야합니다.

double-staining-method-to-detect-pectin-in-plant-fungus-interaction

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 동영상은 루테늄 레드와 락토페놀 코튼 블루를 사용하여 커피 녹병 식물에서 식물과 곰팡이가 상호 작용하는 동안 펙틴과 키틴을 시각화하는 이중 염색 방법을 보여줍니다. 이 절차는 곰팡이 감염 중 식물 방어 메커니즘을 이해하는 데 도움이 됩니다.

이중 염색 방법: 루테늄 레드와 락토페놀 코튼 블루를 사용하여 식물-곰팡이 상호 작용을 시각화하는 기술

이 비디오는 현미경을 사용하여 곰팡이 균사에서 박테리아 생물막을 성장시키고 정성적으로 분석하는 방법을 설명합니다. 박테리아 생물막은 곰팡이 표면에 자주 형성되며 대사 협력, 경쟁 또는 포식과 같은 수많은 박테리아-곰팡이 상호 작용 과정을 포함합니다.

진균균사에서 박테리아를 형성하는 생물막을 시각화하기 위한 시료 전처리 방법

이 동영상은 식물 조직에서 아라비노갈락탄 단백질(AGP)과 펙틴을 국소화하는 면역염색 기술을 보여줍니다. 고정 및 수지 포매 식물 조직 절편은 AGP 및 펙틴 특이적 1차 및 형광 2차 항체와 셀룰로오스 결합 형광 염료로 염색되어 세포벽에서 조직 특이적 공동 국소화를 나타냅니다.

식물 조직에서 아라비노갈락탄 단백질과 펙틴의 면역 국소화

식물 세포벽 구성은 조직 유형에 따라 다르며 리그닌, 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스 및 펙틴을 포함할 수 있습니다. 세포 유형 수준에서 차이를 시각화하기 위해 다양한 염색 기술이 개발되었습니다. 이 논문은 일반적으로 사용되는 세포벽 염색 기술을 편집한 것입니다.

의 조직 화학 염색<em&gt; 애기 장대</em&gt; 차 전지 벽 요소

중요한 형광 염료는 현대 곰팡이 세포 생물학에 있는 살아있는 세포 화상 진찰 분석을 위한 필수적인 공구입니다. 이 논문은 필라멘트 균류에서 플라즈마 막 역학, 내분비 / 외신 세포증 및 세포 벽 형태 형성을 추적하기위한 확립되고 덜 알려진 형광 염료의 응용 프로그램에 대해 자세히 설명합니다.

필라멘트 곰팡이의 살아있는 세포 이미징을 위한 막 및 세포벽 선택적 형광 염료의 적용

이 프로토콜은 아라비노갈락탄 단백질과 펙틴의 면역지역화를 위한 식물 물질이 어떻게 고정되는지, 친수성 아크릴 수지에 내장되어, 단면화및 유리 슬라이드에 장착되는지 자세히 설명합니다. 우리는 세포벽 관련 전형이 특정 항체로 검출될 것임을 보여준다.

식물 조직의 세포 벽에 있는 아라비노갈락탄 단백질과 펙틴의 형광 면역 국소화

여기의 프로토콜은 Zea mays 와 Festuca rubra의 두 종에 대한 뿌리의 arbuscular mycorrhizal 식민지화 패턴과 전략을 평가하는 방법을 설명합니다. MycoPatt 방법을 사용하면 매개 변수 계산, 균근 구조를 디지털 데이터로 변환하고 뿌리에서 실제 위치를 매핑 할 수 있습니다.

Festuca rubra와 Zea mays의 뿌리에서 식민지화 패턴과 곰팡이 전략을 탐구하는 도구로서의 균근 지도

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토양의 불투명도로 인해 구성 미생물 간의 상호 작용은 세포 분해능으로 쉽게 시각화 될 수 없습니다. 여기에서는 곰팡이 - 미생물 상호 작용을 조사하기위한 새로운 기회를 제공하는 두 가지 미세 유체 도구가 제시됩니다. 이 장치는 다재다능하고 사용하기 쉬우므로 세포 수준에서 높은 시공간 제어 및 고해상도 이미징이 가능합니다.

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현재 논문은 식물 관련 내생균의 분리, 분리물의 장기 보존, 형태학적 특성 분석 및 후속 분자 식별 및 균유전체 분석을 위한 전체 DNA 추출을 위한 상세하고 적절한 프로토콜을 제공하는 것을 목표로 합니다.

Mycoheterotrophic 식물에서 내생균 균류를 식별하기 위한 분리, 특성화 및 전체 DNA 추출

이 보고서는 단세포 연쇄상구균 조류인 Penium margaritaceum을 배양하고 실험적으로 조작하는 데 사용되는 기본 방법을 설명합니다. 또한 단클론 항체 및 기타 형광 프로브를 사용한 라이브 셀 라벨링 및 주사 전자 현미경을 포함한 현미경 기반 이미징의 기본 프로토콜을 제공합니다.

페니움 마가리타세움(Penium margaritaceum)에 대한 실험적 스크리닝 프로토콜, 면역세포화학 및 현미경 기반 이미징 기법

학습하세요 커피 잎에서 펙틴을 검출하는 이중 염색 방법으로 식물-곰팡이 상호 작용을 관찰하는 기법입니다. 이 방법은 생물영양성 및 부패영양성 병원균을 진단하는 데 활용됩니다.

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