식물 - 곰팡이 상호 작용에서 펙틴을 검출하는 이중 염색 방법

이 프로토콜은 식물-곰팡이 상호작용을 식별할 수 있게 하기 때문에 중요하다. 펙틴을 착색하는 것 외에도 병원균 세포벽 중합체의 결함을 입증하고 곰팡이 구조를 식별 할 수 있습니다. 이 간단하고 복잡하지 않은 기술은 광 현미경을 사용하여 수행 할 수 있으며 주사 전자 현미경과 같은 값 비싼 장비가 필요하지 않습니다.

또한, 그것은 조직 병리학 적 연구를위한 식물 구조의 우수한 구별을 얻는 빠른 기술입니다. 이 기술은 식물 - 곰팡이 상호 작용을 식별합니다. 따라서 커피 녹 및 자궁 경부 스포리증과 같은 생물 영양 및 괴사 성 곰팡이로 인한 질병을 진단하기 위해 협력합니다.

시작하려면, 메스와 트위저를 사용하여 병변의 중간 영역에서 약 10 평방 밀리미터 잎 샘플을 수확하고, 그것을 30 밀리리터의 Karnovsky 고정 용액에 담그십시오. 잎 샘플을 오일 펌프를 사용하여 15분 동안 500 내지 600 밀리바의 저진공으로 피험하고, 잎 조직 내의 고정 용액의 투과성을 증가시키기 위해 적어도 4배 이상 실시한다. 고정 후, 잎 샘플을 증류수에 희석한 0.5 M 카코딜레이트 완충액으로 각각 5분 동안 세 번 세척한 다음, 각 에탄올 농도에서 15분 동안 등급화된 에탄올 시리즈로 옮긴다.

샘플을 글리콜 메타크릴레이트로 점진적으로 옮기기 위해, 자기 교반 하에 글리콜 메타크릴레이트 분말 1그램을 100 밀리리터의 염기성 수지와 혼합함으로써 용액 A를 만든다. 이어서, 샘플을 용액 A 및 100%에탄올 중 하나 내지 두 개의 비율로 세 시간 동안 침지시킨다. 샘플을 용액 A:100%에탄올에 대해 1 대 1의 비율로 세 시간 동안 침지시킨 다음, 이틀 내지 나흘 동안 순수한 염기성 수지에 침지하였다.

샘플을 15분 동안 하루에 적어도 네 번 저진공으로 가하고, 이어서 회전시켰다. 15 밀리리터의 용액 A를 비이커에서 경화제 1 밀리리터와 섞어서 2 분 동안 회전시켜 중합 용액 B.이 중합 용액 B의 1.2 밀리리터를 플라스틱 몰드에 넣는다. 나무 픽을 사용하여 병변 잎 샘플을 순수한 기본 수지에서 용액 B로 옮기고 핀셋을 사용하면 조직이 부서질 수 있으므로 핀셋을 사용하지 마십시오.

용액 B가 빠르게 점성이 되므로 잎 샘플을 플라스틱 몰드에 수직으로 신속하게 방향을 정하십시오. 잎 샘플의 수직 방향이 달성되면 30 분 동안 기다린 다음 플라스틱 몰드를 실리카 겔이 들어있는 플라스틱 또는 유리 챔버로 옮겨 습도를 방지하십시오. 일단 수지와 잎 샘플이 두세 시간 후에 중합되면, 블록 베이스를 샌딩 파일로 샌딩하여 생성된 블록을 플라스틱 몰드로부터 분리한다.

그런 다음 블록을 나무 조각에 붙입니다. 여덟 센티미터 강철 블레이드가 장착 된 회전 마이크로 톰을 사용하여 블록을 다섯 마이크로 미터 두께의 섹션으로 자릅니다. 섹션을 증류수로 덮인 유리 슬라이드 위에 놓습니다.

그런 다음 슬라이드를 핫 플레이트로 옮겨 섭씨 40도에서 건조시키고 유리 슬라이드에 대한 섹션의 접착력을 촉진하십시오. 건조 후 유리 슬라이드에 블록 참조 이름과 슬라이드 번호로 레이블을 붙입니다. 락토페놀에 5 % 면화 파란색 두 밀리리터로 섹션을 덮고 섭씨 45도의 핫 플레이트에서 5 분 동안 가열하십시오.

증류수가 채워진 비이커에서 슬라이드를 세 번 세척하여 과량의 염료를 제거한다. 1 분 동안 물에 0.01 % 루테늄 레드 두 밀리리터로 얼룩 지게하십시오. 증류수가 채워진 비이커에서 슬라이드를 세 번 세척하여 과량의 염료를 제거한다.

섹션 위에 증류수 한 방울을 넣고 가벼운 현미경 분석을 수행하기위한 커버 슬립으로 섹션을 덮으십시오. 이중 염색 방법에서, 세포벽과 조밀한 원형질체 함량을 함유하는 헤밀리아 vastatrix hyphae는 해면질과 팰리세이드 실질 둘 다에서 진한 파란색으로 나타났다. haustorium 모세포와 haustoria는 또한 진한 파란색을 나타냈다.

루테늄 레드로 염색된 카운터는 세포간 공간에서의 진균 분포를 명확하게 정의하였다. 상호 작용 동안, Hemileia vastatrix haustorium 모세포는 숙주 세포벽을 부수고 펙틱 화합물로 둘러싸인 haustorial 목을 개발했습니다. 펙틴이 풍부한 분홍색 - 붉은 색의 목의 캡슐화는 haustorial 형성을 막을 수 없습니다.

어떤 경우에는 펙틴이 풍부한 캡슐화가 하우스토리움을 불완전하게 감싸 안았습니다. 그리고 어떤 경우에는 haustorium이 완전히 캡슐화됩니다. 펙틴이 풍부한 세포벽은 곰팡이가 존재하지 않는 병변 경계에서 무결성을 유지합니다.

이중 염색 방법은 세포 간 균사의 존재를 입증했습니다. 상호작용 영역에서, 펙틴 세포벽은 용해로 인해 완전성을 잃는 것으로 나타났다. 코니디아와 같은 생식 구조는 부축 표피에서 발견되었습니다.

Cercospora coffeicola hyphae는 컬링 구조로서 substomatic 챔버에서 발견되었고, 병변 부위의 팰리세이드 실질은 세포벽 용해를 겪는 것으로 보인다. 핀셋은 조직 분쇄를 일으킬 수 있으므로 사용하지 마십시오. 녹, 탄저병, 자궁 경부 스포리증, smuts 및 기타 생물 영양, 반생물 영양 및 괴사 성 식물 - 곰팡이 상호 작용에 대한 추가 조직 병리학 적 연구는 다른 병리학 시스템에서이 기술의 잠재적 인 사용을 조사하기 위해 수행되어야합니다.