설치류의 외과적으로 유도된 녹내장에 대한 Limbal Vascular Plexus의 전체 원형 소작
February 15th, 2022
이 프로토콜의 목표는 아급성 안구 고혈압을 유발하는 변연 혈관 신경총의 360° 열 소작을 기반으로 하는 녹내장 신경 퇴행의 새로운 모델을 특성화하는 것입니다.
우리는 일시적인 안압 상승을 기반으로 강력하고 진행적인 녹내장 변성을 유도하는 간단한 방법을 개발했습니다. 이것은 녹내장 병태생리학의 핵심을 연구할 수 있는 독특한 기회입니다. 이는 학습이 쉽고, 비침습적이며, 비용이 저렴하고, 재현성이 높은 모델로, 각 실험에 대해 감소된 수의 동물을 사용하여 생체 내 기능 분석 및 단기 실험 설계를 가능하게 합니다.
망막과 시신경은 중추 신경계의 평가 가능한 부분이므로 이러한 구조의 점진적 손상을 모델링하면 다른 신경 퇴행성 질환에 대한 귀중한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 실험용 눈과 반대쪽 대조군 눈의 기준선 안압(IOP)을 측정하려면 마취된 쥐를 벤치 탑의 복부 욕창 위치에 놓아 각막 표면이 안압계 끝에 쉽게 접근할 수 있도록 합니다. 안압계 팁이 중앙 각막 영역에 수직으로 약간 닿도록 배치합니다.
그런 다음 측정 버튼을 눌러 측정값을 획득합니다. 다음으로, 실체 현미경 아래에서 쥐를 약간 측면 욕창 위치에 놓고 실험 눈을 40배 배율로 검사합니다. 시술 중에는 카멜로스 나트륨 또는 히알루론산 나트륨 한 방울을 주입하여 반대쪽 대조 눈을 윤활하십시오.
다음으로, 구부러진 집게를 사용하여 실험용 안구를 부드럽게 앞으로 밀어 림버스의 360도 주변 혈관을 노출시킵니다. 그런 다음 다른 손으로 저온 안과 소작기를 사용하여 각막 주변의 혈관을 부드럽게 소작합니다. 각막 주변부를 소작하지 않도록 주의하십시오.
수술한 눈에서 공막 변연에 작은 원형 소작 자국이 나타나고, 변연 혈관이 소멸되고, 동공이 확장되는 것을 관찰하여 수술 절차의 성공을 확인합니다. 수술 후 앞서 설명한 대로 양쪽 눈의 수술 직후 IOP를 확인합니다. 그런 다음 안과용 프레드니솔론 아세테이트를 실험 눈의 앞쪽 표면에 한 방울 떨어뜨립니다.
40초 후 안과 항생제 연고로 교체한다. 비스테로이드성 항염증제와 항생제 연고로 구성된 국소 약물로 실험 눈의 임상 추적 관찰을 매일 적용합니다. 광운동 반응 분석을 위해 습관화를 위해 쥐를 사각형으로 4개의 컴퓨터 모니터가 있는 플랫폼에 놓습니다.
자유롭게 움직이는 쥐의 눈 사이의 비디오 프레임에 빨간색 십자선 커서를 유지하면 가상 실린더의 중심을 나타냅니다. 회전하는 등급에 의해 유도된 쥐의 머리와 목의 반사적 추적으로 구성된 광운동 반응을 관찰합니다. 처음에는 공간 주파수가 낮은 자극을 도입한 다음 움직임 추적이 눈에 띄지 않을 때까지 주파수를 점진적으로 늘립니다.
패턴 망막 전전도를 기록하려면 쥐를 마취한 후 각막의 측두엽에 활성 전극을 조심스럽게 삽입합니다. 또한 기준 전극을 동측 측두안각의 피하 조직에 삽입하고 접지 전극을 뒷다리 중 하나에 삽입합니다. 그런 다음 쥐를 자극 화면에서 20cm 떨어진 곳에 배치하고, 신호 기준선을 모니터링하고, 수집 시스템의 분석 버튼을 눌러 수집을 시작합니다.
망막을 분리한 후 1밀리리터 PBS가 포함된 24웰 배양 플레이트에 넣어 내부 망막이 위를 향하도록 합니다. PBS에서 묽게 된 0.5%non-ionic 계면활성제로 세척해서 조직을 투과시키십시오. 그런 다음 조직과 차단 용액을 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 배양합니다.
배양 중에 Brn-3a 1차 항체 용액을 준비하고 섭씨 4도에서 보관합니다. 조직 차단 후 섭씨 4도에서 200마이크로리터의 1차 항체 용액에 망막을 72시간 동안 부드럽게 흔들어 배양합니다. 그런 다음 PBS로 티슈를 씻습니다.
2차 항체 용액 200마이크로리터에 조직을 실온에서 2시간 동안 배양한 다음 형광 핵 염색을 위해 핵 카운터 염색 용액으로 10분 동안 배양합니다. PBS를 세 번 세척한 후 유리체 면을 위로 유지하면서 두 개의 작은 브러시를 사용하여 망막을 유리 현미경 슬라이드로 옮깁니다. 등쪽 망막 사분면을 현미경 슬라이드에 놓습니다.
마지막으로 유리 커버 슬립에 200마이크로리터의 안티페이드 장착 매체를 바르고 현미경 분석을 위해 평평하게 장착된 망막에 놓습니다. 컨포칼 에피형광 현미경에서 40배 확대 대물렌즈를 사용하여 플랫 마운트를 검사하여 망막 신경절 세포를 추정합니다. 안구 적출 후 안구 부분의 일부를 포함하여 시신경의 안와 내 부분의 근위 부분을 제거합니다.
그런 다음 즉시 샘플을 200-300 마이크로리터의 냉고정액이 들어 있는 바이알 또는 튜브에 넣습니다. 2시간 후 차가운 100마이크로몰 나트륨 카코딜레이트 완충액으로 조직을 세척합니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 1 % 오스뮴 테트라 옥사이드와 5 나노 몰 염화 칼슘에 1 시간 동안 조직을 부드럽게 흔들어 고정시킵니다.
차가운 카코딜산나트륨 완충액으로 3회 세척한 후 시신경 절편을 차가운 증류수로 세척한 후 밤새 배양하고 섭씨 4도에서 1% 소변기 아세테이트를 세척합니다. 다음 날, 물로 세 번 씻은 후 아세톤 농도를 증가시켜 조직을 점진적으로 탈수시킵니다. 그런 다음 조직을 순수 에폭시 수지에 24시간 동안 매립하기 전에 매립 및 에폭시 수지 아세톤 용액을 3회 수행합니다.
다음날 시편 캐리어에서 샘플을 꺼내 섭씨 60도에서 48시간 동안 매립 금형으로 옮깁니다. 중합 후 울트라 마이크로톰을 사용하여 시신경 조각의 횡단 반박형 절편을 절단합니다. 그런 다음 섹션을 수집하여 현미경 유리 슬라이드로 옮깁니다.
톨루이딘 블루로 절편을 염색하고 광학 현미경을 사용하여 100배 배율로 이미지를 촬영합니다. 초구조 해석의 경우 초박형 단면을 수행하고 구리 그리드에 수집합니다. 그런 다음 투과 전자 현미경 검사를 위해 소변기 아세테이트와 구연산납으로 섹션을 염색합니다.
전체 원형 소작술은 대조군에 비해 수술 직후 IOP 상승을 유도했습니다. 수술 후 IOP의 피크는 1일차에 관찰되었으며 6일째에 기준선 수준으로 점진적으로 감소했습니다. 또한, 망막 기능은 각각 광운동 반사 및 패턴 망막 전기 조영술을 사용하여 행동 및 전기 생리학적으로 평가되었습니다.
수술 후, 두 매개 변수 모두 3일째에 안구 고혈압 급성기와 30일째에 2차 변성 단계의 두 가지 뚜렷한 장애 단계를 보여주었습니다. 대조군 시신경과 비교했을 때, 축삭돌기 수와 반얇은 횡방향 시신경 절편은 수술 후 점진적으로 감소했다. 대조군의 눈에서 시신경의 투과 전자 현미경 사진은 얇은 신경교세포 돌기와 명백한 축삭 미세소관 및 신경 필라멘트로 분리된 조밀하게 포장된 수초화 섬유를 보여주었습니다.
대조적으로, 안구 고혈압 3일 후, 몇 가지 퇴화된 섬유, 신경교세포 과정에서의 세포질 액포, 신경교세포핵의 응축된 염색질이 관찰되었습니다. 7일 후, 퇴행성 축삭 섬유와 고긴장성 신경교세포 과정이 증가했습니다. 그리고 14일 후, 축삭돌기 사이의 신경교세포 돌기의 침범과 관련된 시신경 섬유의 더 많은 불균형이 관찰되었습니다.
또한, 망막 신경절 세포의 밀도는 주로 등쪽 및 측두엽 망막 사분면에서 시간이 지남에 따라 감소했습니다. 이 절차를 수행하는 동안 소작 팁으로 변부 혈관을 부드럽게 만지고 탯줄 주변을 절약하고 공막 연부 주변에서 지속적인 소작 자국이 관찰되도록 합니다. 이 절차에 따라 안구 구조의 기능적 생화학적 및 면역조직화학적 평가 및 녹내장 생리병리학에 인정할 수 있는 기타 방법과 같은 다양한 방법을 적용할 수 있습니다.
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개요
이 연구는 변압 혈관 얼기의 360° 열 코터 화를 통해 유발된 녹내장 신경 퇴행 모델을 제시하며, 이는 아급성 안압 상승으로 이어집니다. 이 모델은 녹내장 병리 생리학 연구를 가능하게 하고, 생체 내 기능 분석을 위한 비침습적이고 저렴한 방법론을 사용합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 안과학
- 신경 퇴행
배경
- 녹내장은 시신경 퇴행과 시력 상실의 중요한 원인입니다.
- 기저 메커니즘을 이해하는 것은 치료 전략 개발에 도움이 될 수 있습니다.
- 이 모델은 망막 및 시신경의 진행성 신경 퇴행을 연구하도록 설계되었습니다.
- 이 방법은 재현 가능하며 더 적은 수의 동물이 필요하여 실험 효율성을 향상시킵니다.
연구 목적
- 녹내장 연구를 위한 견고한 모델을 확립하는 것.
- 안압 상승이 망막 및 시신경 건강에 미치는 영향을 조사하는 것.
- 다양한 평가 기법을 사용하여 신경 반응 분석을 가능하게 하는 것.
사용된 방법
- 모델은 높은 안압을 유발하기 위해 변압 혈관의 360° 얼기를 포함합니다.
- 생물학적 모델로 쥐를 사용하며, 안압 상승을 유도하기 위해 수술이 수행됩니다.
- 안압 측정 및 시동기 반응 평가는 주요 방법론적 단계입니다.
- 수술 후 망막 신경세포층 세포의 조직학적 평가가 수행됩니다.
- 패턴 전기 망막도 포함한 전기생리학적 기록은 망막 기능을 평가하기 위해 수행됩니다.
주요 결과
- 이 연구는 유도된 안압 상승에 대한 망막 및 시신경 퇴행을 성공적으로 시연합니다.
- 주요 발견에는 안압 변화와 이에 따른 시동기 반응으로 입증된 시력 기능 변화가 포함됩니다.
- 조직학적 분석은 망막 신경세포층 세포의 손실을 확인하여 모델의 타당성을 입증합니다.
- 전기생리학적 데이터는 녹내장 손상을 나타내는 중요한 손상을 보여줍니다.
결론
- 이 새로운 모델은 녹내장의 병리 생리학 연구를 위한 귀중한 플랫폼을 제공합니다.
- 이 발견은 녹내장뿐만 아니라 다른 신경 장애와 관련된 신경퇴행 과정에 대한 통찰을 제공합니다.
- 이 연구는 안과 및 신경퇴행성 질환의 치료 및 개입 전략에 대한 미래 연구의 기초를 확립합니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Robust preclinical models of glaucoma are essential for de-risking neuroprotective strategies and validating targets implicated in retinal ganglion cell degeneration. The described full-circle limbal vascular plexus cauterization in rodents enables reproducible induction of subacute ocular hypertension, supporting predictive confidence in early-stage discovery and translational research. This model's in vivo functional and histological outputs facilitate portfolio triage and mechanistic interrogation of neurodegenerative pathways relevant to ophthalmic drug development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables hypothesis-driven interrogation of glaucoma pathophysiology and neurodegeneration mechanisms.
- Supports functional target validation by linking intraocular pressure elevation to retinal ganglion cell loss.
- Facilitates mechanistic de-risking through quantifiable, progressive optic nerve degeneration.
- Provides a platform for evaluating candidate neuroprotective interventions in a controlled setting.
Screening & Assay Development
- Delivers a standardized, reproducible model for downstream functional and histological assays.
- Enables quantitative assessment of visual function via optomotor response and pattern electroretinogram.
- Supports assay development for RGC quantification and optic nerve pathology.
- Allows for scalable, short-term experimental designs with reduced animal usage.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant endpoints by modeling progressive RGC and optic nerve degeneration.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation of neuroprotective strategies.
- Facilitates risk-adjusted advancement decisions based on functional and structural readouts.
- Supports translational biomarker development through in vivo and ex vivo analyses.
Pipeline & Workflow Integration
This model integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging early mechanistic studies with translational validation of ophthalmic drug candidates.
- Discovery Biology: Provides a platform for null hypothesis testing and pathway clarification in glaucoma research.
- Screening: Offers reproducible, quantitative outputs for functional and histological assay readiness.
- Analytics: Enables statistical comparison of intraocular pressure, RGC counts, and optic nerve pathology across conditions.
- Translational Research: Supports alignment with clinical endpoints and biomarker strategies for neurodegeneration.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable, standardized model for diverse neuroprotective and mechanistic studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in glaucoma target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of preclinical workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by enabling robust early de-risking.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of ophthalmic and neuroprotective assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in rodent ocular surgery and functional vision assessment.
- Needs access to tonometry, electrophysiology, and advanced microscopy infrastructure.
- Demands cross-team standardization of surgical and analytical protocols for reproducibility.
- Adaptable to various rodent strains and experimental timelines with protocol optimization.
- Limitations include species-specific differences in ocular anatomy and disease progression.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:57
Ocular Hypertension Surgery and Clinical Follow-up
2:53
Optomotor Response Analysis and Recording of Pattern-Electroretinogram
4:04
Quantification of Retinal Ganglion Cell Somas
5:38
Examination of the Optic Nerve
7:33
Results: Characterization of Glaucomatous Neurodegeneration by Limbal Vascular Plexus Cauterization
9:26
Conclusion
