Name: 탠덤 이온 이동성 실험을 위한 순환 이온 이동성 분광계 사용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: 배우세요 순환 이온 이동성 분광계를 활용한 탠덤 IMS/IMS 실험으로 당질 이성질체를 구별하고 분자 네트워크를 구축하는 방법. 이 기술은 질량 분석만으로는 얻기 어려운 구조 정보를 제공합니다.

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S.O.는 그의 박사 학위 (보조금 ANR-18-CE29-0006)에 자금을 지원 한 프랑스 국립 연구소에 감사드립니다.

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

SELECT SERIES 순환 IMS는 업스트림 크로마토그래피 분리 없이 정의된 이온 집단(주어진 m/z 및 이온 이동성)을 선택할 수 있는 강력한 도구입니다. 이 계측기는 MS/MS 및 IMS/IMS 스펙트럼을 모두 추출할 수 있는 이 이온 집단의 이차원 단편화 맵을 생성할 수 있는 가능성을 제공합니다. 그러나 사용자는 실험 프로세스 중에주의가 필요한 몇 가지 중요한 점에 유의해야합니다.
먼저, 사용자는 MS 격리 창에서 가능한 등압 오염물의 존재에 대해 주의 깊게 점검해야 한다. 실제로, 사중극자의 격리 창은 비교적 넓으며, 사중극자에서 공선택될 수 있는 약간 다른 m/z 의 이온을 아는 것은 사용자가 이온 이동성에 대한 관심의 피크를 적절하게 할당하는 데 도움이 될 것이다.
둘째, 초기 분리를 수행할 때, 사용자는 모든 이온이 순환 이온 이동성 셀 주위에서 동일한 수의 통과를 겪도록 보장해야 ...

생체 분자의 완전한 화학적 특성화는 근본적인 생물학적 및 기능적 특성을 이해하는 열쇠입니다. 이를 위해 "omics"과학은 최근 몇 년 동안 생물학적 농도에서 화학 구조의 대규모 특성화를 목표로 발전했습니다. 프로테오믹스 및 대사체학에서 MS는 생물학적 매질에서 발견되는 구조적 이질성을 푸는 핵심 도구가되었으며, 특히 탠덤 MS (MS / MS)를 통해 구조 정보를 제공 할 수있는 감도와 능력 덕분입니다. MS / MS 전략에서 이온은 질량에 따라 선택된 다음 단편화되고 마지막으로 분자의 지문을 확립하기 위해 단편의 질량을 획득합니다. MS/MS 스펙트럼은, 특히, 스펙트럼 데이터베이스1,2와 일치시키거나, 부모 구조들3,4를 잠정적으로 재구성하는데 사용될 수 있다. 유사한 스펙트럼이 유사한 화합물에 속한다는 가정 하에서, MS/MS 데이터는 유사성 점수5,6을 통해 관련 종을 연결하는 분자 네트워크(MN)를 구축하는데 사용될 수도 있다.
그러나, 이온의 질량 대 전하 비율 (m/z)을 검출하는 MS의 고유 한 특성 때문에, 기술은 (스테레오) 이성질체의 범위 내에 속하는 다수의 구조적 특징에 눈이 멀다. 예를 들어, 탄수화물은 몇몇 단당류 서브유닛으로 만들어지며, 이들 중 다수는 입체이성질체 또는 심지어 에피머(예를 들어, Glc vs. Gal 또는 Glc vs. Man)이다. 이들 서브유닛은 글리코시드 결합에 의해 연결되며, 이는 아노머 탄소의 결합(regioisomerism) 및 입체 구성(anomerism)의 위치에 의해 상이할 수 있다. 이러한 특성은 독립형 MS가 탄수화물 이성질체7를 구별하는 것을 어렵게 만들고, 고에너지 활성화 방법8,9,10을 사용하여 위치 이성체주의만을 해결할 수 있다. 유도체화는 입체이성체기11의 동등성을 방해하는 옵션이지만, 광범위한 샘플 준비가 필요하다. 또 다른 더 간단한 옵션은 MS를 IMS와 같은 이성체에 민감한 분석 차원과 결합하는 것입니다.
이 프로토콜은 IMS의 기본 개념에 이미 익숙한 사용자를 위해 설계되었으며 자세한 검토는 다른 곳에서12,13 사용할 수 있기 때문에 IMS의 원칙에 대한 간략한 개요 만 여기에 나와 있습니다. IMS는 버퍼 가스 및 전기장과의 이온의 상호 작용에 의존하여 궁극적으로 기상 형태에 따라 이온을 분리하는 기상 분리 방법입니다. MS에 결합된 IMS의 다른 원리는 상용 기기에서 찾을 수 있습니다: 일부는 높은 전기장과 낮은 전기장(필드 비대칭 IMS, FAIMS)을 번갈아 가며 작동하는 반면, 대부분은 낮은 필드 한계 내에서 작동하며, 특히 드리프트 튜브 IMS(DTIMS, 선형적으로 감소하는 전기장), 이동파 IMS(TWIMS, 대칭 전위파), 갇힌 IMS(TIMS, 전기장에 대한 버퍼 가스 포획 이온의 높은 흐름)13 . 낮은 필드 방법은 분리 중에 버퍼 가스와 상호 작용하는 이온의 표면 (Å2 또는 nm2)을 나타내는 이온 - 가스 쌍의 특성 인 소위 CCS에 대한 액세스를 허용합니다. CCS는 이론적으로 계측기와 무관하므로 서로 다른 실험실 간에 재생할 수 있는 데이터를 생성하는 데 유용합니다14. 이온 이동성 분리는 다양한 파라미터, 특히 이동성 셀의 가스 압력 및 가스 온도의 변동에 의해 영향을 받을 수 있습니다. CCS 교정은 교정제와 관심 종 모두 유사하게 영향을 받기 때문에이를 해결할 수있는 방법입니다13. 그러나 온도 조절실에 계측기를 설치하고 신뢰할 수있는 가스 압력 제어 시스템을 갖추어야합니다.
IMS의 흥미로운 진화는 IMS / IMS로, 2006 년 Clemmer의 그룹에 의해 MS / MS15,16의 아날로그로 처음 소개되었습니다. IMS/IMS에서, 관심 이온은 이온 이동성에 기초하여 선택적으로 분리된다; 이어서, 활성화되고(가능한 단편화까지), 활성화된 이온 또는 단편의 새로운 IMS 분석이 수행된다. 첫 번째 도구 설계에서는 두 개의 IMS 셀을 직렬로 배치하여 활성화가 서있는 이온 깔때기로 분리했습니다. 그 이후로 여러 IMS / IMS 설정이 제안되었지만 (검토를 위해 Eldrid 및 Thalassinos17 참조), IMS / IMS 기능을 갖춘 최초의 상업용 질량 분광계는 201918 년에만 사용할 수있게되었습니다. 이 장비는 IMS 셀의 순환 설계라는 또 다른 기술적 혁신과 결합하여 초기 개념을 크게 개선했습니다.
순환 IMS 셀은 이론적으로 드리프트 경로 길이를 거의 무한히 증가시킬 수 있게 하며, 따라서 계측기의 분해능19을 증가시킨다. 이것은 순환 TWIMS 셀이 주 이온 광학 축에 직교하여 배치되는 특정 계측기 형상에 의해 달성되었다. IMS 셀의 입구에 있는 다기능 어레이 영역은 이온 경로의 방향을 제어할 수 있게 한다: (i) IMS 분리를 위해 이온을 옆으로 보내는 것, (ii) MS 검출을 위해 앞으로 보내는 것, 또는 (iii) IMS 셀로부터 후진하여 프리어레이 셀에 저장될 수 있다. 이러한 프리어레이 저장 세포로부터, 이온이 활성화될 수 있고 단편이 이온 이동성 측정을 위해 IMS 셀에 재주입될 수 있으며, 이는 입체이성질체20을 특성화하는데 성공적으로 사용된 접근법이다. 궁극적으로, 수집된 데이터에는 전구체 및 그 단편에 대한 이온 이동성 및 m/z 정보가 포함됩니다.
글리칸 분석을 위해이 순환 설계를 사용한 최근 간행물 (Ollivier et al.21)에서 우리는 그러한 IMS / IMS 데이터에 포함 된 단편의 이동성 프로파일이 분자 네트워킹 전략에 사용될 수있는 생체 분자의 지문으로 작용한다는 것을 보여주었습니다. IM-MN이라고 불리는 결과 네트워크는 구조적으로 관련된 방식으로 글리코믹스 데이터 세트를 구성하게 된 반면, MS/MS 데이터(MS-MN)로만 구축된 네트워크는 거의 정보를 공개하지 않았습니다. 이 간행물을 보완하고 Cyclic IMS 사용자가 이 워크플로를 구현하는 데 도움이 되도록 이 프로토콜은 데이터 수집에 사용되는 프로토콜에 대한 전체 설명을 제공합니다. 이 프로토콜은 사용자가 IM-MN 네트워크(see21)를 구축하는 데 사용할 수 있는 IMS/IMS 데이터 생성에만 초점을 맞춥니다. IM-MN의 구축은 분자 네트워킹을 위한 프로토콜이 이미 이용가능하기 때문에22 본 명세서에서 고려되지 않을 것이다. 가치 있고 재현 가능한 IMS/IMS 인수를 생성하기 위해 따라야 할 중요한 사항이 강조됩니다. Ollivier et al.에 의해 연구 된 올리고당 중 하나의 예를 들면. 도 21에 도시된 바와 같이, 다음의 단계들이 상세하다: (i) 샘플 준비, (ii) 사이클릭 IMS 계측기의 튜닝, (iii) 데이터의 자동화된 피크 피킹, 및 (iv) CCS 캘리브레이션.

<table><tbody><tr><td>33-&alpha;-L- plus 23-&alpha;-L-Arabinofuranosyl-xylotetraose (XA3XX/XA2XX) 혼합물</td><td>Megazyme Ltd., Wicklow, Ireland</td><td>O-XAXXMIX</td><td>XA2XX + XA3XX 혼합물</td></tr><tr><td>33-&alpha;-L-Arabinofuranosyl-xylotetraose (XA3XX)</td><td>Megazyme Ltd., Wicklow, Ireland</td><td>O-XA3XX</td><td>Pure XA3XX standard</td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, Eppendorf Quality, 무색, 1,000 튜브</td><td>Eppendorf, 함부르크, 독일</td><td>0030120086</td><td>탄수화물 원액 및 희석</td></tr><tr><td>FALCON 50 mL 폴리프로필렌 코니컬 튜브 30 x 115 mm</td><td>Corning Science M&eacute를 준비하는 데 사용됩니다. xico S.A. de C.V., Reynosa, Tamaulipas, Mexico</td><td>352070</td><td>100 mM LiCl</td></tr><tr><td>리튬 클로라이드 (ACS 시약, &ge; 99 %)</td><td>Sigma-Aldrich Inc., Saint Quentin Fallavier, France</td><td>310468</td><td>리튬으로 시료를 도핑하는 데 사용됨</td></tr><tr>Major<td>Mix IMS/Tof Calibration Kit</td><td>Waters Corp., Wilmslow, UK</td><td>186008113</td><td>MS 및 IMS</td></tr><tr><td>MassLynx 4.2 SCN1016 Release 6용 검량 솔루션(Cyclic IMS 2.9.1 Release 9용 Waters 임베디드 분석기 플랫폼)</td><td>Waters Corp., Wilmslow, UK</td><td>721022377</td><td>기기 제어 및 데이터 처리를 위한 Cyclic IMS 공급업체 소프트웨어</td></tr><tr><td>HPLC PLUS 그래디언트 등급</td><td>Carlo-Erba 시약용 메탄올, Val de Reuil, 프랑스</td><td>412383</td><td>고순도 용매</td></tr><tr><td>MS Leucine Enkephaline Kit</td><td>Waters Corp., Wilmslow, UK</td><td>700002456</td><td>질량</td></tr>분석기 <tr><td>SCHOTT DURAN 100 mL 붕규산 유리병</td><td>VWR INTERNATIONAL, Radnor, Pennsylvania, US</td><td>218012458</td><td>500 &micro의 용액을 준비하는 데 사용됩니다. M LiCl in 50:50 MeOH/Water</td></tr><tr><td>SELECT SERIES Cyclic IMS</td><td>Waters Corp., Wilmslow, UK</td><td>186009432</td><td>cylic IMS 셀이 장착된 이온 이동성 질량 분석기</td></tr><tr><td>웹사이트: http://mzmine.github.io/</td> <td>MZmine 개발 팀</td><td>-</td><td>MZmine 소프트웨어 다운로드 링크</td></tr><tr><td>웹사이트: https://github.com/siollivier/IM-MN</td><td>INRAE, UR BIA, BIBS 시설, 낭트, 프랑스</td><td>-</td><td>CCS 보정 기능이 포함된 사내 R 스크립트에 대한 링크</td></tr></tbody></table>

탠덤 이온 이동성 실험을 위한 순환 이온 이동성 분광계 사용

Using a Cyclic Ion Mobility Spectrometer for Tandem Ion Mobility Experiments

화학 구조의 정확한 특성화는 근본적인 생물학적 메커니즘과 기능적 특성을 이해하는 데 중요합니다. 질량 분광법 (MS)은 인기있는 도구이지만 모든 구조적 특징을 완전히 드러내기에 항상 충분하지는 않습니다. 예를 들어, 탄수화물은 생물학적으로 관련이 있지만, 그 특성화는 수많은 수준의 이성체에 의해 복잡합니다. 이온 이동성 분광법 (IMS)은 이온 입체 형태에 민감하고 따라서 이성체에 민감하기 때문에 흥미로운 보완물입니다. 
또한, 최근 발전으로 기술이 크게 향상되었습니다: 마지막 세대의 순환 IMS 계측기는 향상된 분해능 또는 탠덤 이온 이동성(IMS/IMS) 실험을 수행할 수 있는 가능성과 같은 선형 IMS 계측기에 비해 추가 기능을 제공합니다. IMS/IMS 동안, 이온은 이온 이동성에 기초하여 선택되고, 단편화되고, 그 단편에 대한 이온 이동성 정보를 얻기 위해 재분석된다. 최근의 연구에 따르면 이러한 IMS / IMS 데이터에 포함 된 단편의 이동성 프로파일은 특정 글리 칸의 지문으로 작용할 수 있으며 구조적으로 관련된 방식으로 글리코믹 데이터 세트를 구성하기위한 분자 네트워킹 전략에 사용될 수 있습니다. 
따라서 이 프로토콜의 목표는 샘플 준비부터 재현 가능한 스펙트럼을 산출하는 이온 이동성 차원의 최종 CCS(충돌 횡단면) 교정에 이르기까지 IMS/IMS 데이터를 생성하는 방법을 설명하는 것입니다. 하나의 대표적인 글리칸의 예를 들자면, 이 프로토콜은 순환 IMS 장비에 IMS/IMS 제어 시퀀스를 구축하는 방법, IMS 도달 시간을 드리프트 시간(즉, 이온에 적용된 효과적인 분리 시간)으로 변환하기 위해 이 제어 시퀀스를 설명하는 방법, 그리고 원시 데이터로부터 관련 이동성 정보를 추출하는 방법을 보여줄 것이다. 이 프로토콜은 IMS/IMS 실험의 중요 사항을 명확하게 설명하도록 설계되었으므로 새로운 순환 IMS 사용자가 간단하고 재현 가능한 인수를 수행할 수 있도록 도와줍니다.

아라비녹실란 오타당류인 XA2XX가 이 프로토콜을 설명하기 위한 예로 선택되었다. 이 화합물은 상업적으로 입수가능하지만, 단지 다른 아라비녹실란 펜타사카라이드 XA3XX(순수한 XA3XX도 상업적으로 입수가능함)와의 혼합물로서만 입수가능하다. XA2XX 및 XA3XX의 구조는 보충 그림 S1에 나와 있습니다. 상용 혼합물 중의 XA2XX와 XA3XX의 비율이 ∼50:50이므로, 혼합물의 20 μg/mL에서의 용액을 50:50 MeOH/H2O + 500 μM LiCl에서 ~10 μg/mL의 XA2XX 농도에 도달하도록 제조하였다.
먼저, XA2XX+XA3XX 혼합물의 MS 분석을 고해상도 MS를 사용하여 수행하였다. 두 화합물이 이성질체이...

이온 이동성 분광법 (IMS)은 생체 분자의 특성화를위한 질량 분광법에 대한 흥미로운 보완물이며, 특히 이성체에 민감하기 때문입니다. 이 프로토콜은 분자의 분리 및 그 단편의 이동성 프로파일의 생성을 허용하는 탠덤 IMS (IMS/IMS) 실험을 설명합니다.

Accurate characterization of chemical structures is important to understand their underlying biological mechanisms and functional properties. Mass ...

이 프로토콜은 질량 분광계에서 분자의 활성화시 생성된 단편에 대한 이온 이동성 프로파일을 기록하고 이성질체 구조를 구별하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 글리칸이 그들의 주요 구조적 특징 중 일부와 관련하여 11 개의 그룹으로 분류 될 수있게하며, 따라서 그렇지 않으면 얻기 어려운 정보를 제공합니다. 그것은 매우 일반적이며 많은 연구 분야에서 관심있는 대사 산물이나 약물과 같은 많은 분자 패밀리에 적합한 분자 네트워크를 구축하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 접근법은 이온 이동성 분광법에서 새로운 개념을 최대한 활용하며, 질량 분광법만으로는 두 구조를 구별하지 못하는 경우에 유용 할 것입니다. 실험은 질량 분광법과 이온 이동성에 대한 훌륭한 명령을 필요로합니다. 그러나 실험자는 각 단계를주의 깊게 따르는 경우 방법을 성공적으로 구현해야합니다.절차를 시연하는 것은 내 실험실의 박사 과정 학생 인 Simon Ollivier가 될 것입니다. 시작하려면 튜닝 페이지에서 단일 패스 IMS 시퀀스를 설정하고 계측기를 이동성 모드로 전환한 다음 순환 시퀀스 제어 창을 엽니다. 이 새 창의 순환 함수 탭에서 고급 모드를 선택하고 번들 추가를 선택한 다음 단일/멀티패스를 선택합니다.일련의 이동성 이벤트가 동일한 창의 시퀀스 탭에 나타날 때까지 기다립니다. 모든 교정 이온이 순환 IMS 경마장 주위를 단일 통과하도록 시퀀스를 조정합니다. 그러나 주입 시간이나 꺼내기 및 획득 시간을 변경하지 말고 분리 시간을 한 밀리초로 낮춥니다.보정 혼합물의 일부 이온이 표시된 도달 시간 창에 맞지 않으면 ADC 설정 탭에서 빈당 푸시 수를 늘려 IMS와 직교 가속도 TOF 분석기의 푸셔의 동기화를 변경하십시오. 순환 시퀀스 제어 창에서 두 분 동안의 수집을 기록하려면 획득을 클릭하여 획득 설정 팝업 창을 열고 파일 이름, 설명 및 획득 길이(분)를 입력한 다음 저장을 클릭합니다. MS Tune 페이지에서 계측기를 TOF 모드로 전환하여 신호의 안정성을 확인합니다.샘플의 전체 MS 획득을 일분 동안 기록하고, 이는 동위원소 패턴 및 잠재적 오염물의 존재를 확인하는데 유용할 것이다. 기본 튜닝 페이지의 쿼드/MS 프로파일 탭에서 계측기를 MSMS 모드로 전환합니다. 사중극자에서 분리하기 위해 MSMS 질량 필드에서 표적 철의 질량을 선택하십시오.데이터를 처리할 때 전구체 격리를 확인하기 위해 일분 수집을 기록합니다. 관심 있는 이성질체의 이동성 기반 선택을 수행하려면 순환 시퀀스 제어 창의 계측기를 이동성 모드로 전환하고, 순환 함수 탭에서 번들 추가를 선택한 다음 슬라이싱을 선택합니다. 복잡한 이동성 이벤트 시퀀스가 시퀀스 탭에 나타날 때까지 기다립니다.꺼내기 및 획득 이벤트를 첫 번째 개별 이벤트 바로 뒤에 배치한 다음 실행을 클릭합니다. 실시간으로 표시될 초기 분리 결과를 찾습니다. IMS 피크의 분해능이 만족스러울 때까지 시퀀스에서 이 이벤트에 대한 시간 값을 변경하여 멀티패스 분리에 대한 첫 번째 분리 이벤트의 지속 시간을 늘립니다.참조를 위해 일분 획득을 기록합니다. 일시 중지를 클릭하고 꺼내기 및 획득 이벤트를 꺼내기 아래에 배치하고, 꺼내기를 미리 저장하고, 이벤트를 보류 및 꺼내기를 클릭합니다. 대상 피크가 미리 저장으로 꺼내기 영역에 있고 다른 이온이 꺼내기 또는 보류 및 꺼내기 영역에 있도록 이벤트 지속 시간을 조정합니다.꺼내기 및 획득 이벤트를 사전 저장소에서 재주입 및 두 번째 개별 이벤트 아래의 시퀀스 끝에 배치합니다. 실행을 클릭하여 선택한 모집단을 표시합니다. 절연의 품질을 확인합니다.참조를 위해 일분 획득을 기록합니다. 시퀀스 탭의 사용자 정의 이벤트 시간 옆의 열에서 모든 이벤트의 합계 시간을 찾습니다. CCS 보정을 수행하기 위해 Pre-Store 이벤트의 Reinject 라인에서 발견 된 Time Abs를 기록하십시오.꺼내기 및 획득을 직접 진행하는 개별 이벤트의 지속 시간을 한 밀리초로 설정합니다. 사전 저장소에서 재주입 줄에서 활성화 사용 상자를 선택하고 기본 제공 컨트롤을 사용하여 조각화를 최적화합니다. 조각화가 내장 컨트롤로 만족스럽지 않은 경우 활성화 활성화 상자의 선택을 취소하고 재주입 전압을 수동으로 최적화하고, 사전 어레이 그라디언트를 증가시키고, 결과가 만족스러울 때까지 어레이 오프셋 전압을 낮춥니다.획득 팝업 창에서 두 분 동안의 획득을 기록하려면 드리프트 시간 유지 옵션을 선택하여 도착 시간만 포함하는 파일을 생성하고, M은 _dt.raw로 레이블이 지정된 Z를 생성합니다. 아라비녹실란 펜타사카라이드 혼합물의 MS 분석을 수행한 후, 스펙트럼은 Z 685.24 이상 M에서 단일 피크를 갖는 동위원소 패턴을 표시하였고, 이는 두 화합물이 본질적으로 이성체임을 시사한다. 오각류의 부가물을 순환 IMS 세포를 통해 분리하고, 세 개의 피크를 상이한 도착 시간으로 분리하였다.순수한 XA3XX는 83 및 90 밀리 초의 피크를 나타내는 반면, XA2XX는 94 밀리 초에서 피크를 나타냅니다. IMS 분리의 첫 번째 단계 후, XA3XX에 속하는 이온을 분출하고, IMS-IMS 분석을 위해 94밀리초에서의 피크를 선택하였다. 활성화 없이 이온을 재주입한 후 삼중 통과 분리를 수행하였고, XA2XX에 대한 피크를 199밀리초에서 수득하였다.생성된 IMS-IMS MS 데이터는 Z 차원에 대한 도달 시간 및 M을 사용하여 디컨볼루브되어 IMS-IMS 스펙트럼을 생성하였다. 0.2% 이상의 상대 강도를 초과하는 피크는 CCS 교정을 위해 내보내졌으며, 그 결과 중심 CCS 보정 IMS-IMS 스펙트럼이 생성되었습니다. 전구체 이온의 단리를 확인하는 것이 항상 중요하며, 그렇지 않으면, 스펙트럼은 관심있는 화합물과 오염 물질의 혼합물로부터 올 수 있다.이전에는 IMS-IMS 스펙트럼을 사용하여 네트워크를 구축하고 화합물을 분류했지만 복합 식별을 위해 데이터베이스를 검색하는 데에도 사용할 수 있었습니다. 이 기술은 매우 최근이지만, 우리는 그것이 당학뿐만 아니라 분석가들이 이성질 분자에 직면하는 모든 맥락에서 매우 유용 할 것으로 기대합니다.

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화학

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