Bathophenanthroline-based Colorimetric Assay를 이용한 조직 비헴철 함량 측정

여기서 우리는 동물 조직에서 헴이 아닌 내용물을 측정하기위한 프로토콜을 제공했습니다. 대부분의 실험실에서 쉽게 구현할 수있는 간단한 잘 정립 된 비색 분석을 사용합니다. Bathophenanthroline 기반 비색 분석은 정교한 기술이나 고가의 장비가 필요하지 않으며 더 높은 샘플 처리량과 비용 효율성을 위해 마이크로 플레이트 형식에 적용 할 수 있습니다.

이 프로토콜은 철분 과부하 또는 철 효율의 다양한 실험 동물 모델에서 조직 철 수준의 변화를 검출하는 데 적합합니다. 10 ~ 100 그램의 조직 샘플을 메스 블레이드로 절단하여 시작하십시오. 작은 파라필름 위에 분석 저울로 정확하게 무게를 재십시오.

플라스틱 핀셋을 사용하여 티슈 조각을 24 웰 플레이트에 넣으십시오. 표준 인큐베이터에서 섭씨 65도에서 48 시간 동안 말리십시오. 또는 스틱 핀셋을 사용하여 조직의 웨이드 조각을 철이없는 테프론 컵에 넣고 실험실 전자 레인지 소화 오븐에서 건조시킵니다.

말린 각 조직 조각을 분석 저울 내부의 작은 파라폼 조각 위에 놓고 정확하게 무게를 재십시오. 건조된 각 조직 조각을 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 튜브에 산성 혼합물의 불을 넣고 닫으십시오.

여기에서 조직이 생략된 것을 제외하고는 동일한 방법으로 산성 블랭크를 준비한다. 튜브를 섭씨 65도에서 20시간 동안 배양하여 조직을 소화시킨다. 실온으로 냉각한 후 플라스틱 팁이 장착된 마이크로 피펫을 사용하여 500 마이크로리터의 맑은 산 추출물을 새로운 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.

평평한 바닥 96-웰, 투명한 처리되지 않은 폴리스티렌 마이크로 플레이트에 염색체 반응을 직접 준비하십시오. 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트 리더에서 535 나노미터의 파장에서 탈이온수 기준치에 대해 샘플 흡광도를 측정한다.

큐벳 및 96-웰 마이크로플레이트 기반 비색 검정에 의한 비헴철의 결정이 여기에 제시되어 있다. 간, 비장, 심장, 폐 및 골수를 포함한 여섯 마리의 마우스로부터의 55개 조직 샘플에서 큐벳 기반 및 마이크로플레이트 기반 비헴철 수준 사이의 상관관계가 여기에 제시되어 있다. 두 방법론 사이의 높은 상관 관계는 마이크로 플레이트 기반 방법이 원래의 큐벳 기반 방법에 대한 유효한 대안임을 나타냅니다.

마지막으로, 비헴철 수준은 염산과 트리클로로아세트산 또는 염산 단독의 혼합물로 동일한 조직으로부터 유래된 샘플을 산성 소화시킨 후 마이크로플레이트 기반 방법으로 정량하였다. 높은 상관 관계는 트리클로로 아세트산이 산 소화에서 방출 될 수 있음을 보여줍니다. 대표적인 이미지는 바토페난트롤린-기반 비색 분석법으로 측정된 검정 여섯 개의 유전적 배경에서 수컷 검정 여섯 야생형 마우스 및 수컷 헵시딘 녹아웃 마우스의 간, 비장, 심장 및 췌장에서의 비헴철 수준을 보여준다.

헵시딘의 파괴는 심한 간, 췌장 및 심장 철분 축적 및 비장 철분 고갈을 가진 철분 침착 표현형과 같은 혈색소 침착으로 이어집니다. 실험적 철 변조에 따른 청소년 여성 유럽 농어에서의 간장 비헴 철 수준이 여기에 도시되어 있다. 간철분 수치는 철분 처리 동물에서 엄청나게 증가했습니다.

빈혈은 간 철분 저장소의 경미한 감소를 일으킨 반면. 대표적인 이미지는 Bathophenanthroline-Based Colorimetric Assay로 측정 된 한 달 된 초파리의 비 헴 철 수준을 보여줍니다. 결과는 20 마리의 파리의 각 풀에서 비 헴철 함량 또는 각 파리의 예상 철 함량을 보여줍니다.

비행 당 0.64 밀리그램의 평균 체중을 고려합니다. 이 절차를 시도하는 동안 모든 유리 마모를 철저히 청소하고 금속 실험실 재료가 오염 위험으로 인해 시약 또는 용액과 접촉하지 않도록하십시오.