자연 형질전환, 단백질 발현 및 필라멘트성 시아노박테리움 포미듐 라쿠나의 동결보존(Cryoconservation of Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna)

이 프로토콜은 oscillatoriales에 속하는 필라멘트 시아 노박테리움이 자연 변형에 의해 어떻게 변형 될 수 있는지를 설명합니다. 또한 다양한 종류의 움직임을 어떻게 연구 할 수 있는지 보여줍니다. 자연 변환은 작동하는 경우 가장 간단한 변환 기술입니다.

DNA, 세포 및 성장 배지 만 필요합니다. 지금까지 다른 진동 부재는 자연 변형으로 변형 될 수 없었습니다. 우리는 우리의 연구가 다른 그룹이 다른 oscillatoria를 시도하도록 자극하기를 바랍니다.

변형을 위해서는 건강하고 건강한 문화와 좋은 DNA 준비를하십시오. 모션 연구의 경우 항상 초음파 처리 문화를 사용하십시오. 치료는 신선해야합니다.

절차를 시연하는 것은 내 실험실의 기술자 인 Nora Weber가 될 것입니다. 50 밀리리터의 액체 F2 배지를 실행 중인 배양물에서 나온 P.lacuna 필라멘트 한 밀리리터와 함께 두 개의 250밀리리터 플라스크 각각에 접종하여 시작하십시오. 섭씨 25도에서 약 5 일 동안 동요 아래 흰 빛으로 재배하십시오.

5일 후, 100 밀리리터의 P.lacuna 세포 현탁액을 10, 000 RPM에서 3분 동안 균질화하고 750 나노미터에서 광학 밀도를 측정하였다. 이어서, 세포 현탁액을 6, 000 배 G.에서 15분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하고, 펠렛을 800 마이크로리터의 나머지 액체 및 추가 F2+ 배지에 현탁시킨다. 밀리리터 카나마이신 당 120마이크로그램의 DNA와 10마이크로그램의 DNA를 포함하는 8개의 F2+Bacto 한천 플레이트를 각 한천 플레이트의 중앙에 취하십시오.

즉시 DNA 위에 100 마이크로리터의 세포 현탁액을 피펫한다. 여분의 액체가 증발 할 수 있도록 깨끗한 벤치에 뚜껑이없는 한천 판을 유지하십시오. 접시를 닫고 이틀 동안 섭씨 25도에서 백색광으로 재배하십시오.

이틀 후, 각 한천 플레이트의 필라멘트를 접종 루프가있는 밀리리터 카나마이신 당 120 마이크로 그램을 함유 한 여러 개의 신선한 F2 + Bacto 한천 플레이트에 배포하십시오. 접시를 섭씨 25도에서 백색광으로 재배하고 현미경으로 정기적으로 배양물을 확인하십시오. 14 ~ 28 일 후에 죽은 갈색 필라멘트를 확인하고 현미경으로 변형 된 필라멘트를 검색하십시오.

변형 된 필라멘트는 건강하고 녹색으로 보이며 대부분의 필라멘트와 다릅니다. 각 단일 변형 필라멘트를 밀리리터 카나마이신 당 250 마이크로그램의 F2 + 배지 10 밀리리터가있는 50 밀리리터 플라스크로 옮깁니다. 셰이커에서 섭씨 25도에서 백색광으로 재배하고 최대 4 주 동안 성장을 관찰하십시오.

필라멘트를 밀리리터 카나마이신 당 250 마이크로그램을 함유하는 한천 배지로 다시 옮기고 필라멘트가 성장할 때까지 기다립니다. 그런 다음, 카나마이신 농도를 다시 증가시켜 분리를 가속화시킨다. GFP 발현을 위해, 40X 또는 63X 배율에서 형광 현미경으로 단일 필라멘트를 관찰하고 밝은 필드 전송 이미지 및 형광 이미지를 캡처한다.

750 나노 미터에서 추정 된 광학 밀도가 0.35가 될 때까지 약 5 일 동안 백색광에서 50RPM 수평 교반하에 F2 배지에서 P.lacuna를 배양하십시오. 샘플을 섭씨 네 도에 보관합니다. 필라멘트를 초음파로 균질화하여 최대 전력과 사이클에서 일분 동안 균질화하십시오.

750 나노미터에서 광학 밀도를 측정하고 P.lacuna를 함유하는 배지 여덟 밀리리터를 여섯 센티미터 페트리 접시에 옮긴다. 샘플이 실온에 도달 할 때까지 몇 분 동안 기다린 다음 셀로판 호일로 페트리 접시를 덮으십시오. 현미경 슬라이드를 카메라로 표준 현미경의 X-Y 테이블에 놓습니다.

현미경 조명을 켜고 4X 또는 10X 대물렌즈를 빛의 경로로 이동합니다. 그런 다음 페트리 접시를 슬라이드 위에 놓습니다. 테이블의 X, Y 및 Z 움직임에 따라 단일 필라멘트 또는 필라멘트 번들을 조정합니다.

단일 필라멘트 또는 번들의 움직임을 관찰하고 표준 현미경 카메라로 움직임을 기록하십시오. 대물 렌즈가 액체에 닿지 않는지 확인하십시오. 피펫 0.5 밀리리터의 P.lacuna를 함유 한 용액의 6 센티미터 페트리 접시의 박토 한천 표면에.

액체가 표면에 들어가도록하십시오. 약 20 분 후, 페트리 접시를 닫고 4X 또는 10X 목표를 사용하여 표면에서 필라멘트의 움직임을 관찰하십시오. 안구 카메라와 미니 컴퓨터 시스템을 사용하여 타임랩스 녹화를 캡처합니다.

필라멘트는 먼저 눈으로 초점을 맞춘 다음 안구 카메라를 통해 초점을 맞추어야합니다. 후속 이미지 사이의 시간 간격이 다섯 초에서 한 분인지 확인하십시오. 미니 컴퓨터의 Linux 스크립트를 프로그래밍하여 타임랩스 기록을 제어합니다.

다섯 밀리미터 LED가 장착된 LED 홀더를 준비하여 아래에서 위로 20mm 평방 면적을 조사합니다. LED 강도를 측정하고 조정합니다. 전체 설정이 어두운 방 또는 닫힌 어두운 컨테이너에 있는지 확인하십시오.

P.lacuna가 들어있는 배지 여덟 밀리리터를 여섯 센티미터 페트리 접시에 넣고 뚜껑으로 페트리 접시를 닫은 다음 LED가 페트리 접시의 중앙에 오도록 LED 홀더에 놓습니다. 일반적으로 이틀 후, 광 처리의 위치를 직접 겨냥한 스마트 폰 카메라로 페트리 접시의 이미지를 캡처하십시오. 홀더와 흰색 시트를 배경으로 사용하여 모든 사진에 대해 동일한 거리와 조명 조건을 보장하십시오.

ImageJ 소프트웨어를 열고 파일, 열기를 클릭하고 파일을 선택하십시오. 그런 다음 Enter 키를 클릭합니다. 직선 단추를 선택하고 마우스 왼쪽 단추를 눌러 페트리 접시의 한쪽 끝에서 반대쪽 끝으로 선을 그립니다.

선이 필라멘트 원의 중심을 통과하는지 확인하십시오. 분석 및 측정을 클릭하여 페트리 요리의 길이를 확인하십시오. 그런 다음 ImageJ 메뉴에서 프로파일 분석 및 플롯을 클릭하십시오.

원 외부의 픽셀 강도에 대한 평균값과 원 내부의 픽셀 강도에 대한 또 다른 평균값을 추정합니다. 이 값 사이의 Y 위치에 마우스를 가리켜 원의 양쪽 면의 X 값을 추정합니다. 두 값을 모두 기록하고 차이를 계산합니다.

그런 다음 직선 버튼을 선택하고 픽셀 강도의 중간 최대값으로 선을 그립니다. 마지막으로 분석을 클릭 한 다음 측정을 클릭하여 내부 셀 원의 길이를 가져옵니다. P.lacuna와 PAK1의 형질전환 후의 삽입물의 통합 및 분리가 여기에 도시되어 있다.

형질전환 후 일주일 경에 외부 프라이머를 사용한 PCR 테스트에는 일반적으로 전기영동 젤 상에 두 개의 밴드가 있는데, 하나는 야생형 밴드의 크기를 가지며, 하나는 저항 카세트의 삽입을 나타내는 느린 이동 밴드입니다. 여기서, 레인 1 내지 4는 내성 필라멘트의 단리의 7일, 11일, 14일, 및 17일 후의 필라멘트의 PCR 산물을 나타내고, 레인 5는 야생형의 PCR 산물을 나타낸다. 칠일 샘플에서, 삽입물은 염색체의 작은 분획에 존재한다.

이 분율은 야생형 밴드가 보이지 않는 17일까지 증가하며, 즉, 분리가 완료됩니다. 이 이미지는 내인성 피코시아닌 베타 프로모터의 조절하에 sfGHP 발현을 위한 벡터 pMH1을 나타낸다. P.lacuna 상동성 서열, pUC19 벡터 백본, 및 sfGFP 및 카나마이신 내성을 갖는 삽입물이 여기에 도시되어 있다.

pMH1에서, sfGHP 유전자는 피코시아닌 베타 유전자의 세 개의 프라임으로 배치되고; In pMH1, the sfGHP gene은 phycocyanin beta gene의 세 개의 프라임에 위치하며; In pMH1, the sfGHP gene은 phycocyanin beta gene의 세 개의 프라임에 위치하며; In pMH1, the sfGHP gene은 phycocyanin beta gene의 세 개의 프라임에 위치하며; In pMH1, the sfGHP gene은 phy P.lacuna 야생형 필라멘트 및 PAK1, PAK2, PAK3, 및 pMH1로 형질전환한 후의 형광 이미지가 여기에 도시되어 있다. sfGFP의 발현은 cpc 560 프로모터, a2813 프로모터, psbA2S 프로모터, 또는 내인성 cpc 베타 프로모터에 의해 구동된다.

여기에 제시된 병합 된 이미지는 Phormidium lacuna의 운동성을 보여줍니다. 한천 표면의 움직임이 여기에 표시됩니다. 시간 간격은 일분이었다.

액체 매질에서의 움직임이 여기에 제시된다. 시간 간격은 10초였다. 자연 변환은 간단한 방법입니다.

플라스미드 DNA와 상동 서열의 저항성 카세트를 세포와 혼합하고 항생제가있는 배지에서 세포가 자라게하십시오. 유전자는 불활성화될 수 있고 단백질은 과발현될 수 있다. 이것은 모든 기본 연구 및 생명 공학 연구에 중요합니다.

자연 변형이 확립 된 단일 세포 시아 노 박테리아에서는 광합성 또는 광수용체에 대한 분자 연구 등이 다루어졌습니다.