Name: 자연 형질전환, 단백질 발현 및 필라멘트성 시아노박테리움 포미듐 라쿠나의 동결보존(Cryoconservation of Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: 배우세요 필라멘트성 시아노박테리움 Phormidium lacuna의 자연 형질전환 및 운동성 분석 방법을. 이 기술은 Oscillatoriales 목의 유전학 연구와 생명공학 응용에 중요한 기초 자료를 제공합니다.

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저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

시아노박테리아의 많은 균주가 배양 컬렉션32,33,34,35,36으로부터 이용가능하지만, 이들 종들이 특정 특성에 적응하기 때문에 야생으로부터 새로운 시아노박테리아에 대한 요구가 여전히 존재한다. P. lacuna는 암석 풀에서 수집되었으며 소금 농도 및 온도30의 변화에 적응됩니다. 이 종의 균주는 2008, 2009 및 2010의 여행 중에 발견되었습니다. 여기에 설명 된 절차에 따라 P. lacuna의 5 균주가 분리되었고,이 균주 중 4 개는 멸균되었습니다. 균주 P. lacuna HE10JO는 rRNA 및 게놈 시퀀싱에 의해 확인된 해양 박테...

시아노박테리아는 광합성을 에너지원으로 활용하는 원핵생물이다1,2. 연구는 시아 노 박테리아 종에 점점 더 초점을 맞추고 있습니다. 몇몇 시아노박테리아는 DNA3으로 형질전환될 수 있다. 유전자는 이들 종에서 녹아웃되거나 과발현될 수 있다. 그러나, 형질전환은몇몇 종 4,5,6,7,8,9,10,11 로 제한되며, 배양 수집 또는 야생 8로부터의 균주에서 형질전환을 확립하는 것은 어려울 수 있다. 필라멘트 종 Phormidium lacuna (그림 1)의 균주는 염 농도 또는 온도와 같은 환경 조건이 시간이 지남에 따라 변동하는 해양 암석 풀에서 분리되었습니다. 이 필라멘트 시아 노 박테리아는 그들이 속한 Oscillatoriales12 순서에 대한 모델 유기체로 사용될 수 있습니다.
전기천공에 의한 유전자 전달을 시험하는 시험 동안 13,14는 P. lacuna가 자연 형질전환(15)에 의해 형질전환될 수 있다는 것을 발견하였다. 이 과정에서 DNA는 일부 세포에 의해 자연적으로 흡수됩니다. 변환16,17의 다른 방법과 비교할 때, 자연 변환은 절차를 복잡하게 만들 수있는 추가 도구가 필요하지 않다는 장점이 있습니다. 예를 들어, 전기 천공에는 적절한 큐벳, 손상되지 않은 와이어 및 적절한 전압의 선택이 필요합니다. P. lacuna는 현재 자연 변형에 취약한 유일한 Oscillatoriales 회원입니다. 원래 프로토콜은 전기 천공 프로토콜을 기반으로하기 때문에 여전히 불필요 할 수있는 몇 가지 세척 단계가 포함되어 있습니다. 프로토콜을 단순화하기 위해 다양한 접근 방식을 테스트하여 여기에 제시된 변환 프로토콜로 이어졌습니다.
게놈 서열은 유전자 녹아웃 또는 과발현에 기초한 추가 분자 연구에 필수적이다. 게놈 서열은 단기간 내에 차세대 시퀀싱 기계로 얻을 수 있지만, DNA의 추출은 어려울 수 있으며 종에 따라 다릅니다. P. lacuna를 사용하면 몇 가지 프로토콜이 테스트되었습니다. 그런 다음 변형된 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB) 기반 방법이 확립되어 실험실에서 계속 작업하기 위해 각 정제주기의 DNA 순도 및 DNA 수율을 수용할 수 있게 되었습니다. 다섯 균주의 게놈은 이 프로토콜로 시퀀싱될 수 있었다. 다음 논리적 형질전환 단계는 P. lacuna에서 단백질 발현을 확립하는 것이었다.
이 프로토콜에서 마커 단백질로서 사용된 sfGFP는 임의의 형광 현미경으로 검출될 수 있다. 시험된 모든 프로모터는 P. lacuna sfGFP 발현을 위해 사용될 수 있었다. 형질전환으로부터 발생하는 균주의 수가 증가함에 따라 배양물을 저장하는 방법이 필요하게 되었다. 이러한 방법은 에스케리치아 콜라이 및 다른 많은 박테리아(18)에 대해 확립된다. 표준 프로토콜에서, 글리세롤 배양물을 제조하고, 액체 질소로 옮기고, -80°C에서 저장한다. 이 방법은 몇 단계 만 거치면 되며 확립 된 종에 대해 매우 신뢰할 수 있습니다. P. lacuna에 대한 표준 프로토콜은 살아있는 세포가 모든 경우에 회복 될 수 없었기 때문에 실현 가능하지 않았습니다. 그러나 해동 후 글리세롤을 제거했을 때 모든 시험의 세포는 생존했습니다. P. lacuna의 운동성 분석을 위해 간단한 방법이 제시되며, 이는 IV 형 필리 또는 광수용체의 역할을 조사하기 위해 녹아웃 돌연변이 유발과 결합 될 수 있습니다. 이들 검정은 단세포 시아노박테리아19,20,21의 분석과 다르며 또한 다른 오실라토리아에 유용할 수 있다.

<table><tbody><tr><td>오토클레이브 3870 ELV</td><td>Tuttnauer</td><td>3870 ELV</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>OttoNorwald</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>BG-11 담수 솔루션</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3061</td><td></td></tr><tr><td>BG-11 매체</td><td>Merck</td><td>73816-250ML</td><td></td></tr><tr><td>붕산</td><td>Merck</td><td>10043-35-3</td><td>H3BO3</td></tr><tr><td>염화칼슘 이수화물</td><td>Carl Roth</td><td>10035-04-8</td><td>CaCl2 &middot; 2 H2O</td></tr><tr><td>세포 배양 플라스크 Cellstar 필터 스크류 캡 포함, sterile, 250 mL</td><td>Greiner</td><td>658190</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 플라스크 Cellstar 필터 스크류 캡 포함, sterile, 50 mL</td><td>Greiner</td><td>601975</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge LYNX 4000</td><td>Thermo Scientific</td><td>75006580</td><td>및 로터</td></tr><tr><td>Centrifuge microstar 17</td><td>VWR International</td><td>N/A</td><td>for up to 13,000</td></tr><tr><td>rpm Cetyltrimethylammonium Bromide (CTAB)</td><td>PanReac AppliChem</td><td>57-09-0</td><td>C19H42BrN</td></tr><tr><td>클로로포름 : 이소아밀 알코올 24 : 1</td><td>PanReac AppliChem</td><td> A1935</td><td></td></tr><tr><td>코발트(II) 클로라이드 헥사하이드레이트</td><td>Merck</td><td>7791-13-1</td><td>CoCl2 &middot; 6 H2O</td></tr><tr><td>구리(II) 황산염 펜타하이드레이트</td><td>Merck</td><td>7758-99-8</td><td>&nbsp; CuSO4 &middot; 5 H2O</td></tr><tr><td>D(+)-비오틴</td><td>Carl Roth</td><td>58-85-5</td><td>&nbsp; C10H16N2O3S</td></tr><tr><td>DNA ladder 1 kb</td><td>New England Biolabs</td><td>N3232</td><td></td></tr><tr><td>DNA ladder 100 bp</td><td>New England Biolabs</td><td>N3231</td><td></td></tr><tr><td>전기 피펫팅 도움말 accujet-pro S</td><td>Brand GmbH</td><td>26360</td><td>1-25 mL</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>VWR</td><td>64-17-5</td><td>C2H6O</td></tr><tr><td>에틸렌디아민 테트라아세트산 다이소듐 염 이수화물</td><td>Carl Roth</td><td>6381-92-6</td><td>EDTA-Na2 &middot; 2 H2O</td></tr><tr><td>형광 현미경 ApoTome</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경 Axio Imager 2</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>French Pressure Cell Press</td><td>American Instrument Company</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>겔 도컴 시스템 Saffe Image</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gelelctrophoresis system Mupid-One/-exu</td><td>ADVANCED Glassware</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, different</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Carl Roth</td><td>56-81-5</td><td>C3H8O3</td></tr><tr><td>Iron(III) chloride hexahydrate</td><td>Merck</td><td>10025-77-1</td><td>&nbsp; FeCl3 &middot; 6 H2O</td></tr><tr><td>카나마이신</td><td>시그마-알드리치</td><td>25389-94-0</td><td></td></tr><tr><td>카나마이신 황산염</td><td>칼 로스</td><td>25389-94-0</td><td>C18H36N4O11 &middot; H2SO4</td></tr><tr><td>Lauroylsarcosine, 나트륨 염 (Sarcosyl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>137-16-6</td><td>C15H28NO3 &middot; Na</td></tr><tr><td>LB Broth (Lennox)</td><td>Carl Roth</td><td>X964.4</td><td></td></tr><tr><td>광원, 형광등 L18W/954 일광</td><td>OSRAM</td><td></td><td>시아노박테리아</td></tr><tr><td>재배 광원, LED 패널 XL 6500K 140 W</td><td>Bloom Star</td><td>N/A</td><td>시아노박테리아 재배, 최대 1,000 &마이크로; mol m-2 s-1</td></tr><tr><td>마그네슘 클로라이드 헥사하이드레이트</td><td>Carl Roth</td><td>7791-18-6</td><td>MgCl2 &middot; 6 H2O</td></tr><tr><td>망간(II) 클로라이드 테트라하이드레이트</td><td>Serva</td><td>13446-34-9</td><td>MnCl2 &middot; 4 H2O</td></tr><tr><td>현미경 DM750</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>미디 프렙 플라스미드 추출 키트 NucleoBond Xtra 미디 키트</td><td>Macherey-NAGEL GmbH & Co. KG</td><td>REF740410.50</td><td></td></tr><tr><td>미니컴퓨터 Raspberry Pi 4 +</td><td>Conrad Electronics</td><td>2138863-YD</td><td>타임랩스 녹화용</td></tr><tr><td>안구 카메라 EC3</td><td>Leica</td><td></td><td>최대 30초 연속 녹화</td></tr> 안<tr><td>구 카메라 MikrOkular Full HD</td><td>Bresser</td><td></td><td>라즈베리 파이 미니 컴퓨터</td></tr><tr><td>페트리 접시 폴리스티롤, 100 mm x 20 mm</td><td>Merck</td><td>P5606-400EA</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시 폴리스티롤, 60 mm x 15 mm</td><td>Merck</td><td>P5481-500EA</td><td></td></tr><tr><td>광도계 Nanodrop ND-1000</td><td>Peqlab Biotechnologie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>광도계 Uvikon XS</td><td>Goebel Instrumentelle Analytik GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>와 결합 된 타임 랩스 기록의 경우Pipetman 100-1,000 &마이크로; L</td><td>Gilson</td><td>SKU: FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman 10-100 &마이크로; L</td><td>Gilson</td><td>SKU: FA10004M</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 피펫 10 mL, 멸균</td><td>Greiner</td><td>607107</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 튜브, 멸균, 15 mL</td><td>Greiner</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 튜브, 멸균, 50 mL</td><td>Greiner</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>포타슘 브로마이드</td><td>Carl Roth</td><td>7758-02-3</td><td>KBr</td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>Carl Roth</td><td>7447-40-7</td><td>KCl</td></tr><tr><td>전원 공급 장치 Statron 3252-1</td><td>Statron Ger&auml; tetechnik GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>전원 공급 장치 Voltcraft PPS 16005</td><td>Conrad Electronics</td><td></td><td>for LED</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Promega</td><td>MC500C</td><td>from Maxwell 16 miRNA 조직 키트 AS1470</td></tr><tr><td>Q5 중합효소</td><td>New England Biolabs</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>염기서열분석 키트 다음Seq 500/550 v2.5</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>염기서열분석 시스템 다음Seq 550 SY-415-1002</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shaker Unimax 2010</td><td>Heidolph 재배 기기</td><td></td><td></td></tr><tr><td>아세트산 나트륨</td><td>Carl Roth</td><td>127-09-3</td><td>NaCH3COO</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Carl Roth</td><td>7647-14-5</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>인산이수소나트륨 일수화물</td><td>Carl Roth</td><td>10049-21-5</td><td>NaH2PO4 &middot; H2O</td></tr><tr><td>불화나트륨</td><td>Carl Roth</td><td>7681-49-4</td><td>NaF</td></tr><tr><td>탄산수소나트륨</td><td>Carl Roth</td><td>144-55-8</td><td>NaHCO3</td></tr><tr><td>몰리브덴산나트륨 이수화물</td><td>Serva</td><td>10102-40-6</td><td>Na2MoO4 &middot; 2 H2O</td></tr><tr><td>질산나트륨</td><td>Merck</td><td>7631-99-4</td><td>NaNO3</td></tr><tr><td>황산나트륨</td><td>Carl Roth</td><td>7757-82-6</td><td>Na2SO4</td></tr><tr><td>스트론튬 클로라이드 헥사하이드레이트</td><td>Carl Roth</td><td>10025-70-4</td><td>SrCl2 &middot; 6 H2O</td></tr><tr><td>티아민 염산염</td><td>Merck</td><td>67-03-8</td><td>C12H17ClN4OS &middot; HCl</td></tr><tr><td>TRIS</td><td>칼 로스</td><td>77-86-1</td><td>C4H11NO3</td></tr><tr><td>초음파 장치 UP100H sonotrode MS3</td><td>Hielscher 초음파 기술</td><td>UP100H</td><td></td></tr><tr><td>Ultraturrax Silent Crusher M</td><td>Heidolph Instruments</td><td></td><td>Homogenizer</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Carl Roth</td><td>57-13-6</td><td>CH4N2O</td></tr><tr><td>비타민 B12</td><td>Sigma</td><td>68-19-9</td><td>C63H88CoN14O14P</td></tr><tr><td>비타민 용액</td><td></td><td></td><td>0.3 &micro; M thiamin-HCl, 2.1 nM 비오틴, 0.37 nM 시아노코발라민</td></tr><tr><td>증류기, 수처리</td><td>VEOLIA 수처리 기술</td><td>ELGA_21001</td><td></td></tr><tr><td>아연 황산염 헵타하이드레이트</td><td>Sigma</td><td>7446-20-0</td><td>ZnSO4 &middot; 7 H2O</td></tr><tr><td>software, URL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>gatb-minia DNA 조립</td><td>을 위한 프로그램https://github.com/GATB/gatb-minia-pipeline</td> 는 <td>짧은 DNA 판독으로 큰 스캐폴드를 만들고,</td> 이미지 처리(픽셀 강도, 원 직경)를 위한 Linux 기반 <td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td>소프트웨어RAST</td><td></td></tr> <tr><td>주석 서버</td><td>https://rast.nmpdr.org</td><td>입력: 게놈 DNA 염기서열, 열린 판독 프레임 감지, 단백질 염기서열 및 그 기능</td><td></td> 나열</tr><tr><td>Culture media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>인공 해수</td><td>0.41 M NaCl , 53 mM MgCl2,28 mM Na2SO4, 10 mM CaCl2 , 9 mM&nbsp; KCl, 2.4 mM NaHCO3 ,0.84 mM KBr, 0.49 mM H3BO3, 90 &micro; M SrCl2, 72 &마이크로; M NaF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>f/2 -액체 매체</td><td>인공 해수, 0.1 % (v/v) 미량 원소 용액, 0.05 % (v/v) 비타민 용액, 0.88 mM NaNO3, 36 &micro; M NaH2PO4&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>f/2+ 액체 매체</td><td>f/2-매체, 10배 증가 NaNO3 및 NaH2PO4 (0.88 mM NaNO3, 36 &micro; M NaH2PO4</td><td></td><td></td></tr><tr><td>f/2+-한천</td><td>3 % (w/v) bacto 한천, 인공 해수, 0.1 % (v/v) 미량 원소 용액, 0.05 % (v/v) 비타민 용액, 8.8 mM NaNO3, 0.36 mM NaH2PO4</td><td></td><td></td></tr><tr><td>f/2-한천</td><td>3 % (w / v) bacto 한천, 인공 해수, 0.1 % (v / v) 미량 원소 용액, 0.05 % (v / v) 비타민 용액, 0.88 mM NaNO 3, 36 &micro; M NaH2PO4</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trace 원소 용액</td><td>0.36 mM NaH2PO4, 12 &micro; M Na2EDTA, 39 nM CuSO4, 26 nM Na2MoO4 , 77 nM ZnSO4, 42 nM CoCl2, 0.91 & 마이크로; M MnCl2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>비타민 해결책</td><td>0.3 &마이크로; M 티아민-HCl, 2.1nM 비오틴, 0.37nM 시아노코발라민</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

자연 형질전환, 단백질 발현 및 필라멘트성 시아노박테리움 포미듐 라쿠나의 동결보존(cryoconservation of filamentous cyanobacterium phormidium lacuna)

Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna

시아 노 박테리아는 태양 에너지가 바이오 매스 생산에 사용되는 기본 연구 및 생명 공학 프로젝트의 초점입니다. Phormidium lacuna는 새로 분리 된 필라멘트 성 시아 노박테리움입니다. 이 논문은 새로운 필라멘트 시아 노 박테리아가 해양 암석에서 어떻게 분리 될 수 있는지 설명합니다. 또한 필라멘트에서 DNA를 추출하는 방법과 게놈을 시퀀싱하는 방법을 설명합니다. 많은 단세포 종에 대해 형질전환이 확립되지만, 필라멘트성 시아노박테리아에 대해서는 덜 빈번하게 보고된다. P. lacuna의 자연 변형을위한 단순화 된 방법이 여기에 설명되어 있습니다. P. lacuna는 자연 변형이 확립 된 Oscillatoriales 주문의 유일한 구성원입니다. 이 논문은 또한 자연 변형이 수퍼 폴더 녹색 형광 단백질 (sfGFP)을 발현하는 데 어떻게 사용되는지를 보여줍니다. 내인성 cpcB 프로모터는 Synechocystis sp. PCC6803으로부터의 cpc560, A2813, 또는 psbA2 프로모터보다 약 5배 더 강한 발현을 유도하였다. 또한, P. lacuna 및 Synechocystis sp.CPP 6803의 동결보존을 위한 방법이 확립되었고, 액체 매질 및 한천 및 플라스틱 표면에서의 운동성을 평가하는 방법이 기재되어 있다.

상기 언급된 방법에 따라, P. lacuna 의 5개의 상이한 균주를 락풀로부터 분리하고 서열화하였다(도 1 및 표 1). 모든 배양물은 P. lacuna HE10JO를 제외한 계대 배양의 ∼1년 후에 멸균되었다. 이 균주는 여전히 해양 박테리아 인 Marivirga atlantica로 오염되어 있습니다. 후속 헬고랜드 여행 동안, 다른 필라멘트 시아 노 박테리아는 P. lacuna 와 다르며 특성화되어야하는 암석 웅덩이에서 분리되었습니다.
몇몇 DNA 추출 및 정제 방법을 P. lacuna에 대해 시험하였다. 최상의 결과는 전술한 바와 같이 최적화된 CTAB 방법으로 얻어졌다. DNA 수율은 310 ± 50 μg/mL, OD260 nm/OD280 nm는 1.7 ± 0.03, OD260 nm/OD230...

Phormidium lacuna 는 해양 암석에서 분리 된 필라멘트 성 시아 노 박테리움입니다. 이 기사에서는 천연 공급원으로부터의 필라멘트의 분리, DNA 추출, 게놈 시퀀싱, 자연 변형, sfGFP의 발현, 냉동 보존 및 운동성 방법에 대해 설명합니다.

자연 형질전환, 단백질 발현 및 필라멘트성 시아노박테리움 포미듐 라쿠나의 동결보존(Cryoconservation of Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna)

Cyanobacteria are the focus of basic research and biotechnological projects in which solar energy is utilized for biomass production. Phormidium lacuna is ...

이 프로토콜은 oscillatoriales에 속하는 필라멘트 시아 노박테리움이 자연 변형에 의해 어떻게 변형 될 수 있는지를 설명합니다. 또한 다양한 종류의 움직임을 어떻게 연구 할 수 있는지 보여줍니다. 자연 변환은 작동하는 경우 가장 간단한 변환 기술입니다.DNA, 세포 및 성장 배지 만 필요합니다. 지금까지 다른 진동 부재는 자연 변형으로 변형 될 수 없었습니다. 우리는 우리의 연구가 다른 그룹이 다른 oscillatoria를 시도하도록 자극하기를 바랍니다.변형을 위해서는 건강하고 건강한 문화와 좋은 DNA 준비를하십시오. 모션 연구의 경우 항상 초음파 처리 문화를 사용하십시오. 치료는 신선해야합니다.절차를 시연하는 것은 내 실험실의 기술자 인 Nora Weber가 될 것입니다. 50 밀리리터의 액체 F2 배지를 실행 중인 배양물에서 나온 P.lacuna 필라멘트 한 밀리리터와 함께 두 개의 250밀리리터 플라스크 각각에 접종하여 시작하십시오. 섭씨 25도에서 약 5 일 동안 동요 아래 흰 빛으로 재배하십시오.5일 후, 100 밀리리터의 P.lacuna 세포 현탁액을 10, 000 RPM에서 3분 동안 균질화하고 750 나노미터에서 광학 밀도를 측정하였다. 이어서, 세포 현탁액을 6, 000 배 G.에서 15분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하고, 펠렛을 800 마이크로리터의 나머지 액체 및 추가 F2+ 배지에 현탁시킨다. 밀리리터 카나마이신 당 120마이크로그램의 DNA와 10마이크로그램의 DNA를 포함하는 8개의 F2+Bacto 한천 플레이트를 각 한천 플레이트의 중앙에 취하십시오.즉시 DNA 위에 100 마이크로리터의 세포 현탁액을 피펫한다. 여분의 액체가 증발 할 수 있도록 깨끗한 벤치에 뚜껑이없는 한천 판을 유지하십시오. 접시를 닫고 이틀 동안 섭씨 25도에서 백색광으로 재배하십시오.이틀 후, 각 한천 플레이트의 필라멘트를 접종 루프가있는 밀리리터 카나마이신 당 120 마이크로 그램을 함유 한 여러 개의 신선한 F2 + Bacto 한천 플레이트에 배포하십시오. 접시를 섭씨 25도에서 백색광으로 재배하고 현미경으로 정기적으로 배양물을 확인하십시오. 14 ~ 28 일 후에 죽은 갈색 필라멘트를 확인하고 현미경으로 변형 된 필라멘트를 검색하십시오.변형 된 필라멘트는 건강하고 녹색으로 보이며 대부분의 필라멘트와 다릅니다. 각 단일 변형 필라멘트를 밀리리터 카나마이신 당 250 마이크로그램의 F2 + 배지

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

출처: Weber, N. et. al., 필라멘트 시아노박테리움 포르미디움 라쿠나의 자연 변형, 단백질 발현 및 냉동 보존. J. Vis. 경험. (2022년)이 비디오는 사상체 시아노박테리아의 광주성을 연구하기 위한 집중된 LED 기반 분석을 보여줍니다. 박테리아는 광원을 향해 이동하여 조명 중심에 조밀한 축적물을 형성하며, 이는 캡처된 이미지의 픽셀 강도 분석을 통해 시각화되고 정량화됩니다.

집중광 조명을 이용한 사상체 시아노박테리아의 광주성 분석

출처: Weber, N., et al., 필라멘트 시아노박테리움 포르미디움 라쿠나의 자연 변형, 단백질 발현 및 냉동 보존. J. Vis. 경험. (2022년)이 비디오는 상동 재조합을 통해 안정적인 GFP 발현 및 항생제 내성을 달성하기 위해 플라스미드 DNA를 사용하여 사상형 시아노박테리아에서 자연 형질전환을 수행하는 절차를 설명합니다.

필라멘트 시아노박테리움 Phormidium lacuna의 자연 변형 및 GFP 발현

출처: Weber, N., et al., 필라멘트 시아노박테리움 포르미디움 라쿠나의 자연 변형, 단백질 발현 및 냉동 보존. J. Vis. 경험. (2022년)이 비디오는 필라멘트 배양물을 균질화하여 균일한 현탁액을 생성하고, 현미경 슬라이드 위에 페트리 플레이트 분석 설정을 준비하고, 필라멘트 움직임을 시각화함으로써 Phormidium lacuna 의 활공 운동성을 평가하는 절차를 보여줍니다.

Phormidium lacuna 필라멘트의 활공 운동성

합성 생물학 비정규 아미노산의 co-translational 삽입을 사용 하 여 전례 없는 속성으로 단백질의 엔지니어링을 수 있습니다. 여기, 우리는 어떻게 소설 형광 분 광 속성, "금" 형광 성 단백질 (GdFP), 불리는 GFP 형 fluorophore의 spectrally 레드 이동 변종 생산 대장균 에서 선택적 압력 관 (SPI)를 통해 제시.

정식이 아닌 아미노산의 선택적 압력 관에 의해 '황금' 형광 및 질량 분석 및 형광 단백질 분석 엔지니어링

이 프로토콜에는 남조류에 과도 DNA 압축을 시각화 하는 방법을 설명 합니다. 동기 재배, 형광 현미경 검사 법, 급속 한, 및 높은 모니터링 전압 cryo 전자 단층 촬영 사용 됩니다. 이러한 방법론에 대 한 프로토콜을 제공 하 고 미래의 응용 프로그램 및 개발 논의.

높은 전압 Cryo 전자 단층 촬영으로 박테리아의 DNA 압축의 시각화

이 프로토콜 cryo 전자 현미경 검사 법, 효율적으로 최소한의 노력 및 독성, 단백질 추출, 정화, 포유류 세포에 있는 유전자를 표현 하는 데 사용 되는 잠재 시스템을 포함 하 여 이온 채널 구조를 결정 하는 데 사용 하는 기법을 설명 합니다. 그리고 품질 검사, 샘플 그리드 준비 및 심사, 뿐만 아니라 데이터 수집 및 처리.

식 및 단일 입자 Cryo 전자 현미경 검사 법에 의하여 구조 결심에 대 한 인간의 지질 민감한 양이온 채널 TRPC3의 정화

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시안게이트 모듈형 복제 툴킷을 사용하여 컨쥬게이션에 의한 시아노박테리아의 유전자 변형

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필라멘트 시아노박테리아의 타임랩스 현미경 분석을 위한 수직 고정화 방법

배우세요 필라멘트성 시아노박테리움 Phormidium lacuna의 자연 형질전환 및 운동성 분석 방법을. 이 기술은 Oscillatoriales 목의 유전학 연구와 생명공학 응용에 중요한 기초 자료를 제공합니다.

자연 형질전환, 단백질 발현 및 필라멘트성 시아노박테리움 포미듐 라쿠나의 동결보존(Cryoconservation of Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna)

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