Name: 시아 노 박테리아 세포 밖 소포의 분리 및 특성 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: 배우세요 시아노박테리아 세포 밖 소포 분리 및 특성 분석 방법을. 초여과와 밀도 구배 원심분리를 활용하여 Synechocystis sp. PCC6803의 소포를 정제하고 투과전자현미경으로 관찰합니다.

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저자들은 i3S 과학 플랫폼 "Biointerfaces and Nanotechnology"와 "Histology and Electron Microscopy", 국가 인프라 포르투갈 바이오 이미징 플랫폼 (PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122)의 지원을 인정합니다. 또한 TEM을 위한 초박형 섹션 염색 프로토콜을 최적화하는 데 도움을 준 J. A. Gonzalez-Reyes 교수(스페인 코르도바 대학)와 나노입자 추적 분석을 위해 Cecília Durães 박사와 Ana Rita Pinto 박사(포르투갈 포르토 대학)에게 감사드립니다.
이 작품은 미국 국립 과학 재단 (OCE-2049004 ~ SJB), Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) 기금이 COMPETE 2020 경쟁력 및 국제화 프로그램 (POCI), 포르투갈, 2020 년 포르투갈 및 Fundação para a Ciência e a Tecnologia / Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior 프로젝트 POCI-01-0145-FEDER-029540 (PTDC / BIA-OUT/29540 / 2017 to PO)을 통해 포르투갈 기금으로 자금을 지원했습니다. Fundação para a Ciência e a Tecnologia는 또한 PhD 펠로우십 SFRH / BD / 130478 / 2017 (SL) 및 FCT Investigator grant IF/00256/2015 (PO)로 크게 인정 받고 있습니다. M.C.M.-M. Horizon 2020 Framework Programme(H2020-MSCA-IF-2018-RI-844891) 내의 Marie Skłodowska-Curie Individual Fellowship(재통합 패널)의 지원을 받았습니다.

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

세포밖 소포(EV)는 직경이 ~20-400 nm 사이인 구형 구조로, 거의 모든 유기체에 의해 주변 환경으로 방출된다 1,2,3. 소포는 지질 이중층에 의해 구분되며 스스로를 복제 할 수 없습니다. 그람 음성 박테리아에서, 이러한 구조는 주로 외막에서 작은 부분의 '블빙'에 의해 발생하는 것으로 생각됩니다. 그럼에도 불구하고 편모 운동, 세포 용해 및 내막 및 외막 물질의 분비를 포함한 다른 과정은 소포뿐만 아니라 4,5도 생성 할 수 있습니다. EVs는 지질, 가용성 및 막 단백질, 핵산 및 대사 산물을 포함한 다양한 생체 분자를 포함 할 수 있으며,이 물질을 세포 4,5,6 사이에서 운반 할 수 있습니다. 이러한 특징을 감안할 때, EV는 세포 통신, 생물막 형성, 수평 유전자 전달, 숙주 - 파지 역학 및 영양소 교환 4,6을 포함한 광범위한 생물학적 과정에서 가능한 역할을 이해하기 위해 연구되고 있습니다.
시아 노 박테리아는 단세포 및 필라멘트 생물을 포함한 그람 음성 박테리아의 크고 다양한 그룹입니다. 그들은 생리학과 다양성7,8,9,10에 봉사하는 중요한 생태계 기능 및 생명 공학 11,12에 대한 유용성을 이해하는 것을 포함하여 많은 관점에서 관심이 있습니다. 시아 노 박테리아는 해양, 담수 및 육상 환경의 자유 생물 또는 이끼류, 양치류, 식물 또는 지의류 및 해면체와의 공생 적 연관성13에서 다양한 서식지에서 발견됩니다. 그들은 수생 생태계에서 중요한 주요 생산자 역할을하며, 산소 광합성9,10을 통해 산소와 유기 탄소를 생산하며, 일부는 대기 질소를 고정 할 수 있습니다7. Prochlorococcus, Synechococcus 및 Synechocystis를 포함한 해양 및 담수 시아 노 박테리아는 실험실 조건 14,15,16에서 EV를 생산하고 시아 노 박테리아 소포는 자연 환경 14,17에서도 발견 될 수 있습니다. 시아 노 박테리아 소포의 생물학적 및 생태 학적 기능은 알려지지 않았지만이 분야의 추가 연구는 시아 노 박테리아 생리학, 분화, 의사 소통 전략, 진화 및 영양 상호 작용에 대한 질문에 대한 새로운 통찰력을 제공 할 가능성이 큽니다. 또한, 생체분자의 다양한 카테고리를 운반하는 시아노박테리아 EVs의 능력은 상업적 응용(18,19)을 가질 수 있다.
본 프로토콜은 시아노박테리아 배양물 및 현장 샘플로부터 소포를 분리하고 특성화하는 방법을 기술하여 시아노박테리아 세포밖 소포 생물학의 광범위한 검사를 가능하게 하고 장려한다. 여기에 설명된 워크플로우는 다른 박테리아로부터 EV를 분리하고 특성화하기 위한 프로토콜과 유사하지만, 시아노박테리아 배양물 및 현장 샘플은 전형적으로 숙주-관련 또는 병원성 모델 시스템(20,21,22)에서 일반적으로 관찰되는 것보다 더 낮은 세포 및 소포 농도를 함유한다. 따라서 시아 노 박테리아 EV에 대한 연구는 균주와 매체 배경에 따라 더 다양한 재배 및 소포 분리를위한 특별한 고려 사항과 최적화가 필요합니다. 단일 프로토콜이 모든 균주, 성장 조건 및 다운스트림 응용 분야에서 동등하게 잘 작동하지 않으므로 여러 옵션을 제공하고 관련된 절충안을 논의하여 연구자가 실험 질문을 해결하는 데 가장 적합한 접근 방식을 결정할 수 있도록합니다.

<table><tbody><tr><td>1x 인산염 완충 식염수(PBS), pH 7.4</td><td>집에서 만든 완충</td>액<td>---</td><td>소포와 함께 사용할 수 있는 표준 세척/보관 완충액; 실험실에서 만들거나 상업적으로 구입할 수 있음</td></tr><tr><td>2% 우라닐 아세테이트 용액</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>22400-2</td><td>음성 염색 - TEM</td></tr><tr><td>4x Laemmli 시료 완충액</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0747</td><td>단백질 분해 전 소포 시료의 변성, 지질다당류(LPS) 염색에 필요,</td></tr><tr><td>Amicon Ultra Centrifugal Filter (100 kDa)</td><td>Merck</td><td>UFC9100XX</td><td>원심 한외여과를 위한 대체 옵션</td></tr><tr><td>BG11 배지</td><td><</td><td>em>Synechocystis sp. PCC 6803</td><td></td></tr> <tr><td>Carbon Support Film 200 Mesh, 구리의 배양을 위한 Medium for Household ---medium Large. CF200-Cu</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71150</td><td>투과 전자 현미경(TEM) 그리드</td></tr><tr><td>easiGlow 글로우 방전 클리닝 시스템</td><td>Ted Pella</td><td>91000</td><td>상업용 TEM 그리드 글로우 디스방전기</td></tr><tr><td>EMbed 812 에폭시 수지</td><td>전자 현미경 Sciences</td><td>14120</td><td>초박형 섹션 -</td></tr><tr><td>진공 시스템용 TEM 필터 홀더</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>300-4000</td><td>필터 멤브레인 지지판이 있는 재사용 가능한 유닛</td></tr><tr><td>글루타르알데히드&nbsp; 등급 I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882-10X1ml</td><td>초박형 섹션 - TEM</td></tr><tr><td>HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&prime;-(2-ethanesulfonic acid) sodium salt]</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7006</td><td>시아노박테리아 성장 매체용 완충제</td></tr><tr><td>Lead Citrate, Trihydrate</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>17800</td><td>전자 현미경</td></tr><tr><td>Macrosep Advance Centrifugal Devices에 사용하기 위한 Stain Omega Membrane 100K</td><td>Pall</td><td>MAP100C36</td>: <td>소량 시료의 원심 한외여과,</td></tr><tr><td>Millipore Pellicon 3, TFF 모듈</td>, <td>EMD, Millipore</td><td>XX42P0060 또는 XX42P0080</td>, <td>대용량 시료 농축을 위한 대체 TFF 옵션</td></tr><tr><td>, Milli-Q Reference Water Purification System,</td><td>Merck</td><td>Z00QSV0WW</td><td>Type I 초순수 등급 물 NanoSight 획득을 위한 정수 시스템</td></tr><tr><td></td><td>Malvern Panalytical</td>, <td>LM14 또는 NS300</td><td>나노 입자 추적 분석</td></tr><tr><td>, Optima L80 XP 초원심분리기</td><td>, Beckman Coulter</td><td>L80 XP</td><td>초원심분리기(또는 유사 모델)</td></tr><tr><td>OptiPrep / Iodixanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556</td><td>밀도 구배 매체</td></tr>, <tr><td>Osmium Tetroxide Reagent Plus</td><td>, Sigma-Aldrich</td><td>201030</td><td>초박형 섹션 - TEM</td></tr><tr><td>Pall Centramate PE TFF 홀더</td><td>Pall Corporation</td><td>FS002K10</td><td>TFF 모듈은 10s-100s의 L의 시료를 농축하는 데 적합하며, 예상 부피로 확장하기 위해 추가 30 또는 100 kDa 필터 모듈이 필요합니다</td></tr>. <tr><td>연동 펌프 Masterflex L/S</td><td>Cole-Parmer</td><td>07559-07</td><td>대규모 TFF 모듈 구동용 펌프</td></tr><tr><td>피스톤 구배 분획기</td><td>Biocomp Instruments</td><td>152-001</td><td>자동 밀도 구배 분획</td></tr><tr><td>70 Ti 로터용 폴리카보네이트 튜브</td><td>Beckman Coulter</td><td>355618</td><td>재사용 가능한 초원심분리기 폴리카보네이트 알루미늄 튜브(캡 어셈블리 포함</td></tr>) <tr><td>Pro99 배지</td><td></td> <td>Prochlorococcus---</td><td></td></tr><tr><td>Pro-Q 에메랄드 LPS 젤 염색 키트</td>, <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P20495</td><td>LPS 염색</td></tr><tr><td>SN 배지</td><td>수제 배지</td><td>---</td><td>Synechococcus</td></tr><tr><td>Sodium cacodylate trihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0250-100G</td>와 같은 시아노박테리아 해양 균주의 배양을 위한 배지 TEM SW32Ti 스윙 버킷 로터<td>용 소포 샘플 준비시 완충제</td></tr><tr><td></td><td>Beckman Coulter</td><td>369650</td><td>Ultracentrifuge rotor, 6x ~40 mL 튜브 보유; 벌크 재료</td></tr><tr><td>SW60Ti 스윙의 펠릿화에 적합 버킷 로터</td><td>Beckman Coulter</td><td>335650</td><td>초원심분리기 로터, 6x ~4.5 mL 튜브 보유; 그라디언트 정제 및 최종 소포 세척에 좋음</td></tr><tr><td>주사기 1mL Luer</td><td>BD Plastipak</td><td>303172</td><td>소포 분리 및 nanparticle 추적 분석(NTA) 장비에 샘플 로딩 시</td></tr><tr><td>린지 필터 0.2 &micro; m</td><td>Pall Corporation</td><td>4602</td><td>배양에서 소포 분리용</td></tr><tr><td>TAPS [N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]-3-아미노프로판설폰산]</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5130</td><td>시아노박테리아 성장 매체용 완충제</td></tr><tr><td>투과 전자 현미경</td><td>JEOL</td><td>JEM-1400</td><td>또는 이와 유사한 현미경</td></tr><tr><td>Type 70 Ti 고정각 티타늄 로터</td><td>Beckman Coulter</td><td>337922</td><td>초원심분리기 로터, 8x ~39 mL 튜브 수용; 벌크 물질의 펠릿화에 적합</td></tr><tr><td>Streptomyces griseus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147</td><td>효소의 EV 단백질 단백질 단백질 분해를 위한 효소, LPS 염색에 필요</td></tr><tr><td>SW32Ti 로터용 UltraClear 튜브</td><td>Beckman Coulter</td><td>344058</td><td>일회용 초원심분리기 튜브</td></tr><tr><td>SW60Ti 로터용 UltraClear 튜브</td><td>Beckman Coulter</td><td>344062</td><td>일회용 초원심분리기 튜브</td></tr><tr><td>초소형 PowerTome XL, PT-PC</td><td>RMC 제품,&nbsp; Boeckeler Instruments</td><td>75501</td><td>초박형 섹션용 마이크로톰 - TEM</td></tr><tr><td>Universal 320 R 원심분리기</td><td>Hettich</td><td>Z654736</td><td>이 또는 이와 유사한 범용 벤치탑/플로어 스탠딩 원심분리기는 셀 펠릿화에 사용할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>진공 장치</td><td>KNF Neuberger</td><td>N026.3 AT.18</td><td>또는 이와 유사한 진공 펌프 및 트랩</td></tr><tr><td>Vivaflow 200 100,000 MWCO PES</td><td>Sartorius</td><td>VF20P4</td><td>TFF 모듈, 2-3L에 적합합니다. 더 많은 볼륨을 위해 다른 모듈을 연결할 수 있습니다(그림 1).</td></tr><tr><td>Whatman Polycap TC 캡슐 필터 (0.2/0.2&micro; m)</td> <td>Cytiva</td><td>6717-9502</td><td>대량의 액체</td></tr><tr><td>Zetasizer</td><td>Malvern Panalytical</td><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>동적 광 산란 (DLS) 기기를</td></tr> 필터링하기위한 캡슐 필터</tbody></table>

시아 노 박테리아 세포 밖 소포의 분리 및 특성 분석

Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles

시아노박테리아는 다양한 광합성, 그람 음성 박테리아 그룹으로, 지구 생태계에서 중요한 역할을 하고 필수적인 생명공학 모델로 작용합니다. 최근의 연구는 해양 및 담수 시아 노 박테리아가 미생물의 외부 표면에서 방출되는 작은 막 결합 구조 인 세포 밖 소포를 생산한다는 것을 입증했습니다. 소포는 다양한 생물학적 과정에 기여할 가능성이 있지만, 시아 노 박테리아 생물학에서 그들의 특정 기능적 역할은 크게 알려지지 않았습니다. 이 분야의 연구를 장려하고 발전시키기 위해 시아 노 박테리아 세포 밖 소포를 분리, 농축 및 정화하기위한 상세한 프로토콜이 제시됩니다. 현재의 연구는 Prochlorococcus, Synechococcus 및 Synechocystis의 대규모 문화에서 소포를 성공적으로 분리 한 방법론에 대해 논의 합니다. 이들 균주로부터의 소포 샘플을 정량화하고 특성화하는 방법이 제시된다. 수생장 샘플로부터 소포를 분리하기 위한 접근법이 또한 기술된다. 마지막으로, 시아 노 박테리아 소포 정화, 다양한 다운 스트림 응용 프로그램에 대한 방법 론적 고려 사항 및 접근법 간의 절충안과 함께 직면 한 전형적인 과제도 논의됩니다.

도 1은 시아노박테리아 소포 분리 과정의 개요를 제시하며, 여기에 설명된 프로토콜의 주요 측면을 강조한다. 특히 주목할만한 것은 소포(vesicle) 분획으로부터 시아노박테리아 바이오매스를 분리하고, 소낭 샘플을 농축하고, 소낭을 분리 및 정제하는 단계(도 1, 단계 2 내지 4)이며, 이는 재현가능한 소포 제제를 수득하는데 매우 중요하다. 도 2는 시아노박테리움 시네코시스티스 sp. PCC 6803으로부터의 세포밖 소포의 분리 및 특성화로부터의 대표적인 결과를 제시한다. 이 시아노박테리움의 외막에는 카로티노이드(31)가 함유되어 있으며, 이는 초원심분리를 통해 직접 펠릿화하여 수집된 소포의 샘플에 특징적인 오렌지색 착색을 부여한다(도 2A). 일단 베시클 펠릿이 재현탁되면, 베시클은 우라닐 아세테이트로 샘플을 음으로 염색하거나(그림 2B) 초박형 절편을 관찰하여(도 2C) 투과 전자 현미경(TEM)으로 검사할 수 있다. 베시클 크기 분포 및 농도는 동적 광산란(DLS)(그림 2D) 및 나노입자 추적 분석(NTA)(그림 2E)을 사용하여 평가할 수 있습니다. 기술된 프로토콜에 의해, 전형적으로 mL 당 ∼3.5 ± 1.0 x 108 나노입자가 1.0의 OD730에서 시네코시스티스 sp. PCC 6803의 지수적으로 성장하는 배양물에서 수득되었다. 분리된 EV의 생화학적 분석은 분리된 소포의 물리적 특성화를 보완하기 위해 수행될 수 있다. 일례로서, 정제된 시네코시스티스 sp. PCC 6803 소포를 SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 분리하고, 리포폴리사카라이드(LPS; 도 2F). LPS가 외막(32)에 특이적이기 때문에, LPS 검출은 막 결합된 소포의 존재를 검증할 수 있고, 동일한 균주(33)로부터의 제제들 사이의 상대적 소포 함량을 분석하기 위한 마커로서 기능할 수 있다. 저분자량 대 고분자량 LPS의 상대적 풍부도의 검사는 샘플34,35 사이의 소낭 조성의 변화를 나타낼 수 있다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63481/63481fig01v2.jpg"> 그림 1: 시아노박테리아 EV 분리 및 특성화에 사용되는 실험 절차. 성장 배양 (1) 및 성장 배지 (2)로부터 시아 노 박테리아 바이오 매스의 분리의 개략적 표현. 소포를 함유하는 무세포 샘플을 농축하고(3), EV를 분리하고 정제한다(4). 용도에 따라, 베시클 제제는 투과 전자 현미경 (TEM), 나노입자 추적 분석 (NTA), 동적 광산란 (DLS) 및 리포폴리사카라이드 (LPS) 프로파일 링 (5) 중 하나 또는 이들의 조합을 사용하여 특성화될 수 있다. RT, 실내 온도. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63481/63481fig01largev2.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63481/63481fig02.jpg"> 도 2: 시아노박테리움 시네코시스티스 sp. PCC 6803에 대한 세포밖 소포 분리 및 특성화의 대표적인 결과. (a) 1.0-1.5의 OD730으로 성장한 600 mL Synechocystis sp. PCC 6803 배양물로부터 농축된 무세포 세포외 배지를 초원심분리한 후 수득한 세포밖 소포 펠릿(EVs pellet)의 사진. 외막에서 발견되는 카로티노이드로부터 유래된 소낭 펠릿의 전형적인 오렌지색 착색에 주목하라. (B,C) Synechocystis sp. PCC 6803 소낭 샘플의 음성 염색 (B) 및 초박형 섹션 (C)의 투과 전자 현미경 (TEM) 사진. 스케일 바: 각각 200nm 및 50nm. 샘플을 80 kV에서 작동되는 투과 전자 현미경 상에서 시각화하였다. (d) 소포 직경(nm)의 함수로서 소포 부피의 분포를 묘사하는 전형적인 동적 광산란(DLS) 플롯. 컬러 선은 동일한 샘플의 세 가지 기술적 복제 측정치의 데이터를 나타냅니다. (e) Synechocystis 세포밖 소포 크기 분포의 대표적인 나노입자 추적 분석(NTA) 데이터(nm에서). 검은 선은 세 번의 기술적 반복실험의 평균을 나타내고 빨간색 선은 평균의 표준 오차를 나타냅니다. (F) 리포폴리사카라이드(LPS) 프로파일은 16%(w/v) SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동에 의해 소낭 제제를 분리하고 상용 LPS 염색 키트로 염색한 후 검출되었다. 각각 거친 LPS 및 평활 LPS 형태에 해당하는 저분자량 및 고분자량 LPS가 검출 가능합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63481/63481fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 1 : r을 계산하는 방정식. 지수 성장 동안 두 지점 (일반적으로 시간 코스의 시작과 끝) 사이의 생성 당 세포 당 생성 된 소포의 수는이 방정식을 사용하여 결정됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63481/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

본 프로토콜은 시아노박테리아 배양물로부터의 세포밖 소포의 분리, 농도 및 특성화에 대한 상세한 설명을 제공한다. 서로 다른 규모의 문화에서 소포를 정화하기위한 접근법, 방법론 간의 절충점 및 현장 샘플 작업을위한 고려 사항도 논의됩니다.

Cyanobacteria are a diverse group of photosynthetic, Gram-negative bacteria that play critical roles in global ecosystems and serve as essential ...

이 프로토콜은 다양한 규모, 트레이드 오프, 방법론 간의 차이점 및 현장 샘플 작업에 대한 고려 사항에서 문화에서 소포를 정화하기위한 접근법을 보여 줄뿐만 아니라 중요합니다. 시아노박테리아는 독특한 소포 샘플링 및 분석 과제를 제시합니다. 이러한 기술은 배양 및 환경 샘플에서 소포를 성공적으로 분리하고 농축했습니다.500 밀리리터 미만의 샘플을 농축하려면 유형 1 초순수 등급의 물로 15 ~ 20 밀리리터 한외여과 원심 농축기를 헹구는 것으로 시작하십시오. 원심 분리기에 농축기를 넣고 섭씨 4도에서 4, 400 x g에서 회전하십시오. 실행을 취소하고 단계를 두 번 이상 반복합니다.상청액 샘플을 헹군 농축기에 넣고 동일한 조건에서 스핀하십시오. 샘플이 15 ~ 30 밀리리터의 최종 부피로 농축 될 때까지이 단계를 반복하십시오. 500 밀리리터 이상의 부피를 농축하려면 원고에 설명 된대로 장치를 설정하여 접선 유동 여과를 수행하십시오.연동 펌프를 흡입 라인에 부착하고 고정 라인에 조정 가능한 클램프를 놓습니다. 원고에 설명 된대로 접선 유동 여과를 살균 한 다음 Type 1 초순수 등급 물 1 리터로 장치를 플러시하십시오. 0.2 미크론 미만의 여액을 샘플 저장소에 첨가하십시오.유지 라인의 펌프 속도와 배압 수준을 천천히 증가시켜 여과 라인의 출력을 증가시킵니다. 접선 유동 여과를 계속 실행하고 물질이 제거됨에 따라 배양 상청액으로 저장소를 다시 채운다. 저장고의 부피가 기포를 도입하지 않고 흡기 라인으로의 흐름을 유지하는 데 필요한 가능한 가장 낮은 양에 도달하면 시료 농축을 중단하십시오.클램프로 유출 라인을 닫습니다. 고정 라인의 배압을 제거하십시오. 농축된 상등액을 필터를 통해 10분 동안 재순환시켜 재순환 속도를 분당 20밀리리터에서 40밀리리터로 줄여 회수율을 극대화한다.잔류 라인을 깨끗한 용기로 옮기고 샘플에서 흡입 라인을 제거하고 농축 된 재료를 수집하십시오. 피펫을 사용하여 샘플 저장소에 남아 있는 물질을 회수합니다. 농축된 상청액을 0.2 마이크론 시린지 필터를 통해 여과한다.필요한 경우, 최종 농축액을 섭씨 네 도에서 약 삼 주 동안 보관한 후 소포 정제로 옮깁니다. 농축된 배양 샘플을 펠릿화하기 위해 이를 깨끗한 초원심분리 튜브에 넣고 깨끗한 배지 또는 버퍼를 첨가하여 튜브가 채워지도록 합니다. 원심분리 후, 피펫으로 상층액을 제거한다.펠릿화된 물질을 신선한 배양 배지 또는 세척 완충액, 예컨대 1X 포스페이트 완충 식염수로 재세척하고 원심분리를 반복한다. 최종 펠렛을 한 밀리리터 피펫으로 부드럽게 피펫팅하여 신선한 배양물에 재현탁시키고 깨끗한 용기로 옮깁니다. 밀도 구배 초원심분리를 수행하려면 원고에 설명 된대로 iodixanol 스톡을 준비하십시오.4X 버퍼의 한 부분을 60 % iodixanol 스톡의 세 부분과 혼합하여 45 % iodixanol 용액을 만듭니다. 45% 요오딕사놀을 1X 완충액으로 희석하여 40, 35, 30, 25, 20, 15 및 10% 최종 요오드딕사놀 농도의 구배 배지를 만듭니다. 그런 다음 동일한 양의 모든 요오드딕사놀 구배 스톡을 초원심분리 튜브에 조심스럽게 오버레이하여 전체 튜브 부피를 활용합니다.원심분리 후, 조심스럽게 피펫팅하거나 분획 수집기를 사용하여 대략 4.5 밀리리터 구배에 대해 각각 0.5 밀리리터의 분획을 수집한다. 분석 저울과 보정 된 피펫을 사용하여 밀리리터 당 그램 단위로 각 분획의 밀도를 결정하십시오. 튜브에서 샘플을 제거하고 무게를 결정하고 샘플을 튜브로 되돌립니다.개별 분획을 새 튜브에 깨끗한 버퍼로 희석 한 다음 깨끗한 배지 또는 버퍼 세척하십시오. 조심스럽게 다섯 마이크로 리터의 소포를 바르고 다섯 분 동안 그대로 두십시오. 그리드의 가장자리를 깨끗한 여과지 조각에 터치하여 샘플을 제거합니다.20 ~ 50 마이크로 리터의 2 % 우라닐 아세테이트를 플라스틱 필름으로 덮인 평평한 표면에 피펫을 꺼냅니다. 그런 다음 두 분 동안 그 위에 떠있는 그리드를 놓습니다. 여과지를 사용하여 우라닐 아세테이트를 제거하고 초순수 한 방울에 잠깐 떠서 씻으십시오.깨끗한 주사기를 사용하여 챔버를 초순수로 채우고 기포가 없는지 확인하십시오. 카메라 시작'을 클릭하고 지문 주변의 챔버의 최적 영역을 시각화합니다. 화면 게인' 및 카메라 레벨의 슬라이더를 최대로 밀고 가장 낮은 레벨로 줄여 가장 어두운 파티클을 확인합니다.필요에 따라 초점을 조정하여 입자가 시야각에서 거의 동일하게 보이도록 하고 챔버가 깨끗해질 때까지 매우 깨끗한 물로 계속 세척하십시오. 하나의 밀리리터 주사기를 사용하여 챔버에 소포 샘플을 추가하고 획득 설정을 확인하십시오. SOP 드롭 다운 상자에서 표준 측정'을 선택하고 설정을 변경하여 각각 60 초 비디오의 최소 세 번의 기술 복제본을 수집하십시오.create'를 누르고 스크립트를 실행하고 프롬프트에 따라 약 100 마이크로리터의 샘플을 반복실험 사이의 챔버로 밀어 넣습니다. 분석'을 클릭하고 실험을 열어 입자 매개 변수를 결정하고 샘플 파일을로드하십시오. 선택한 파일 처리'를 선택하고 분석이 완료될 때까지 기다립니다.시아노박테리움 Synechocystis sp. PCC6803으로부터 세포밖 소포의 분리 및 특성화는 외막에 카로티노이드가 포함되어 있음을 보여주었으며, 이는 초원심분리를 통해 직접 펠릿화하여 수집된 소포 샘플에 특징적인 오렌지색 착색을 부여한다. 재현탁된 베시클 펠릿은 우라닐 아세테이트로 샘플을 음으로 염색하거나 초박형 절편을 관찰하여 투과 전자 현미경으로 검사하였다.베시클 크기 분포 및 농도는 동적 광산란 및 나노입자 추적 분석을 사용하여 평가하였다. 정제된 시네코시스티스 sp. PCC6803 소포를 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 상에서 분리하고, 리포폴리사카라이드에 대해 염색하였다.샘플은 농축 된 소포 샘플 전후에 채취하여 접선 유동 여과가 작동하고 소포가 농축되고 있는지 확인해야합니다. 그런 다음 나노 입자 추적 분석을 사용하여 두 샘플을 모두 측정해야합니다. 배양 및 환경 샘플에서 작은 입자의 차별 및 분리를 개선하기 위해 크기-배제 크로마토그래피 또는 비대칭 전계-유동 분별과 같은 다른 접근법과 이 방법을 병합하기 위한 미래의 노력이 요구된다.이 기술은 시아 노 박테리아 소포와 시아 노 박테리아 생물학에서 이러한 소포의 특정 기능적 역할을 연구하는 데 도움이됩니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

출처: Biller, SJ, et al. 시아노박테리아 세포외 소포의 분리 및 특성화. J. Vis. 경험. (2022년)이 비디오는 음성 염색을 통해 투과 전자 현미경을 위한 시아노박테리아 세포외 소포를 준비하여 구조 및 비교 분석을 위해 소포 형태, 크기 및 순도를 고해상도로 시각화하는 방법을 보여줍니다.

투과전자현미경을 이용한 시아노박테리아 세포외소포의 시각화

출처: 왓슨, DC, et.al. 대장균 및 기타 박테리아로부터 세포외 소포의 확장 가능한 분리 및 정제. J. Vis. 경험. (2021년)이 비디오는 유전자 조작 박테리아의 외막에서 파생된 세포외 소포(EV)의 분리 및 농축을 보여줍니다. 이 과정에는 박테리아를 배양하여 EV를 방출한 다음 세포와 잔해물을 제거하기 위한 순차적 원심분리 및 여과 단계가 포함됩니다. 마지막으로, 한외여과는 다운스트림 분석을 위해 EV를 농축하는 데 사용됩니다.

박테리아로부터 외막 유래 세포외 소포의 분리 및 농축

출처: Watson, DC, et al. 대장균 및 기타 박테리아로부터 세포외 소포의 확장 가능한 분리 및 정제. J. Vis. 경험. (2021년)이 비디오는 박테리아 배양 여과액에서 박테리아 세포외 소포(EV)를 분리하기 위해 다공성 수지 비드를 사용한 크기 배제 크로마토그래피를 사용하는 방법을 보여줍니다. 더 큰 EV는 수지 기공을 우회하여 조기에 용리되는 반면, 더 작은 단백질은 기공으로 들어가 나중에 용리됩니다.

크기배제 크로마토그래피를 이용한 박테리아 세포외 소포의 분리 

이 동영상은 결핵균(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)의 배양 여과액에서 박테리아 세포외 소포체(EV)를 정제하기 위한 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 기술을 보여줍니다. 이 기술은 다공성 수지 충전 컬럼을 사용하여 EV의 정제된 분획을 얻습니다. 다공성 입자는 더 작은 단백질이 기공으로 들어가도록 선택적으로 허용하여 용리 속도를 늦춥니다. 동시에 EV는 크기가 크기 때문에 모공으로 들어가는 것이 배제되고 먼저 용출됩니다.

Mycobacterial Extracellular Vesicles를 정제하기 위한 크기 배제 크로마토그래피 기술

여기서, 시안박테리아 방출 된 탄수화물 중합체의 분리 및 그들의 엑소프로테옴의 격리에 대한 프로토콜이 설명된다. 두 절차 모두 추가 분석 또는 응용 분야에 사용할 수 있는 고순도의 중합체 또는 단백질을 얻기 위한 주요 단계를 구현합니다. 또한 특정 사용자 요구에 따라 쉽게 조정할 수 있습니다.

바깥쪽을 바라보며: 시안박테리아 방출 탄수화물 고분자 및 단백질 의 분리

본 보고서는 마이크로글리아 또는 혈액 대식세포로부터 세포외 소포(EV) 격리에 대한 연대순 요구 사항을 강조합니다. Microglia-파생된 EV는 혈액 대식세포 유래 EV가 시험관내 분석에서 C6 신경교종 세포 침입의 대조군에서 연구된 동안 신경이대 발생의 조절자로 평가되었다. 목표는 특정 미세 환경에서 면역 중재자로서 이러한 EV 기능을 더 잘 이해하는 것입니다.

면역 세포 유래 세포 외 소포의 특성화 및 세포 환경에 대한 기능적 영향 연구

세균성 소포는 병인에 중요한 역할을 하고 유망한 생명 공학 응용 프로그램이 있습니다. 소포의 이질성은 분석과 사용을 복잡하게 합니다. 따라서 다양한 크기의 소포를 분리하는 간단하고 재현 가능한 방법이 필요합니다. 여기에서, 우리는 Aggregatibacter actinomycetemcomitans에의해 생성된 이기종 소포를 분리하기 위하여 크기 배제 크로마토그래피의 사용을 보여줍니다.

크기 배제 크로마토그래피는 세균 외부 막 소포 이질성을 분석

박테리아는 생리 활성 생물학적 분자를 운반하는 나노 미터 크기의 세포 외 소포 (EV)를 분비합니다. EV 연구는 생물 발생, 미생물-미생물 및 숙주-미생물 상호 작용 및 질병에서의 역할, 잠재적 인 치료 응용 프로그램을 이해하는 데 중점을 둡니다. EV 연구의 표준화를 촉진하기 위해 다양한 박테리아로부터 EV를 확장 가능한 분리를 위한 워크플로우가 제시됩니다.

대장균 및 다른 박테리아로부터의 세포외 소포의 확장 가능한 분리 및 정제

현재 프로토콜은 불연속 자당 밀도 그라데이션을 통해 원심분리에 의한 시아노박테리아로부터의 피코빌리좀의 분리를 자세히 설명합니다. 그대로 피코빌리좀의 분획은 77K 형광 스펙트럼 및 SDS-PAGE 분석에 의해 확인된다. 결과 물리경분획은 TEM 및 질량 분광법 분석의 음수 염색에 적합합니다.

시아노박테리아의 피코빌리좀의 격리 및 특성화

최신 세대의 EV 특성화 도구는 여러 파라미터에 대한 단일 EV 분석이 동시에 가능합니다. 나노유세포분석은 표지 없이 45nm보다 큰 모든 생물학적 입자를 측정하고 다양한 형광 표지 기술로 아집단의 특정 특성을 식별합니다.

나노유세포분석을 통한 단일 세포외 소포 막횡단 단백질 특성 분석

여기에서는 인간 피험자의 눈물 및 타액과 같은 생물학적 액체에서 수집된 세포외 소포체(EV)의 특성화 방법을 보여줍니다. 이 방법에 사용된 스캐너는 샘플의 1μL에서 EV의 표현형, 크기 및 총 입자 수를 감지할 수 있습니다.

Characterizing Extracellular Vesicles from Biological Fluids(생물학적 유체로부터 세포외 소포체 특성화)

배우세요 시아노박테리아 세포 밖 소포 분리 및 특성 분석 방법을. 초여과와 밀도 구배 원심분리를 활용하여 Synechocystis sp. PCC6803의 소포를 정제하고 투과전자현미경으로 관찰합니다.

시아 노 박테리아 세포 밖 소포의 분리 및 특성 분석

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