Name: 조작된 섬유아세포 성장 인자 1에 의해 자극된 가속화된 치유를 통해서만 Descemet의 스트리핑의 인간 각막 배양 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-22T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 36 s
Description: 학습하세요 인간 각막 배양 모델을 이용한 Descemet's Stripping Only 방법으로, eFGF1을 활용하여 Fuchs Endothelial Corneal Dystrophy 환자의 각막 상피세포 재생 및 가속 치유를 연구하는 기술입니다.

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이 작업에 대한 기금은 Trefoil Therapeutics와 NIH NCATS TRND CRADA #2016-04에 의해 지원되었습니다. 저자는 조직 병리학 조언과 서비스에 대한 Tony Wong, 공초점 현미경을 사용한 UC San Diego의 Nikon Imaging Center, 수술 기술에 대한 조언에 대해 Natalie Afshari 박사와 Marian Macsai 박사에게 감사드립니다. 또한, 저자는 각막을 제공 한 눈의 기증자와 안구 은행에 감사를 표합니다.

이 작품은 피험자의 신원 확인없이 기존 표본을 사용했으며 45 CFR 46.101 (b) (4)에 따라 IRB 승인이 면제됩니다.
인간 기증자 각막은 미국 전역의 다양한 안구 은행으로부터 얻어졌다 ( 표 참조). 각막은 스펙큘러 평가시 guttae, pleomorphism, polymegathism 및 / 또는 낮은 ECD와 같은 결과를 기반으로 안구 은행에 의해 개별적으로 영양 장애 여부를 판단했습니다. 도 1 은 상처 생성 동안, 스트리핑 직후 및 배양 2주 후에 각막에서의 트리판 블루 염색을 제시한다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63482/63482fig01.jpg"> 도 1: 각막이 상처 생성 동안, 즉시 벗겨진 후, 및 배양 14일 후 트리판 블루에 의해 시각화된 바와 같이 나타내는 도이다. 이들 시점들 사이의 염색된 면적의 감소를 측정하여 치유의 수준을 결정하였다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63482/63482fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
1. 상처 생성
<ol><li>멸균 포셉을 사용하여 배지에서 각막을 제거하고 1x PBS로 헹구어 잔류 배지 및 세포 파편을 제거한다. 헹굼 후, 각막 내피 쪽을 페트리 접시의 뚜껑에 올려 놓습니다.</li>
	<li>트리판 블루 30 μL를 잘 익힌 접시에 피펫. Trypan Blue에 새로운 4mm 생검 펀치를 담그고 과잉을 탭하십시오.</li>
	<li>양손으로 펀치를 각막의 중심 위에 놓고 내피 표면에 똑바로 내려 최소한의 압력을 가합니다.</li>
	<li>각막의 위치나 압력을 변경하지 않고 펀치를 한 손으로 옮기고 새로 풀린 손으로 포셉에 닿으십시오. 포셉을 사용하여 각막을 제자리에 고정시키고 생검 펀치를 약 90° 앞뒤로 여러 번 부드럽게 비틀어 놓습니다.</li>
	<li>펀치를 각막에서 똑바로 들어 올리고 따로 보관하십시오.</li>
	<li>1x PBS로 1회 더 헹구어 과량의 트리판 블루를 제거하였다.</li>
</ol>2. 데세멧의 스트리핑
<ol><li>페트리 접시 뚜껑에 각막을 해부 범위로 옮깁니다. 참고: 각막을 5분 이상 건조시키지 마십시오. 과정을 완료하는 데 더 많은 시간이 필요한 경우, 내피를 재수화하기 위해 1x PBS에서 다시 헹구십시오.</li>
	<li>구부러진 포셉으로 각막을 제자리에 고정하고 생검 펀치가 남긴 Trypan Blue의 링을 따라 날카로운 30G 바늘의 끝을 가볍게 드래그하여 Descemet의 막을 채점하십시오. 기본 스트로마를 방해하지 않도록 최소한의 압력을 사용하십시오.</li>
	<li>Sinskey 후크를 사용하면 부드러운 스쿠핑 동작을 사용하여 상처 가장자리 주변의 Descemet의 막을 들어 올리고 벗겨 내고 병변의 중심을 향해 작업하십시오. 참고 : Descemet의 멤브레인은 거의 저항하지 않아야합니다. 어려움이 경험된다면, 스트로마를 끌어 올릴 가능성이 큽니다. 이런 일이 발생하면 상처 가장자리를 따라 새 지점에서 들어 올리면서 다시 시작하십시오.</li>
	<li>Descemet의 막의 대부분이 스트로마에서 분리되면 Gorovoy 포셉을 사용하여 멤브레인을 제거하고 따로 보관하십시오.</li>
	<li>벗겨진 부위에 남아있는 멤브레인 조각이 있는지 검사하고 Gorovoy 포셉으로 제거하십시오.</li>
</ol>3. 트리판 블루 염색
참고: Descemet의 스트리핑 후 각막을 트립판 블루로 염색하여 상처 부위를 시각화하십시오.
<ol><li>페트리 접시 뚜껑에 있는 각막을 생물안전 캐비닛으로 되돌리고 0.01%(w/v) CaCl2 및MgCl2 를 함유하는 1x PBS로 헹구어 세포 파편을 제거하고 손상되지 않은 Descemet의 막에 남아있는 CEC를 단단히 부착할 수 있도록 합니다.</li>
	<li>각막을 잘 만든 접시에 넣고 30 μL의 트리판 블루를 내피층에 30 초 동안 피펫을 놓습니다.<ol>
<li>포셉을 사용하여 각막을 부드럽게 흔들어 내피 표면 전체가 덮여 있는지 확인하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>과량의 트리판 블루를 0.01% (w/v) CaCl2 및MgCl2 로 1x PBS로 헹구고 제 0일 시점 동안 해부 현미경으로 염색된 각막을 이미지화하였다.<ol>
<li>각막이 균형을 이루어 빛이 고르게 전달되고 위치 지정이 시간대에 걸쳐 복제되도록 하십시오. 참고: 포셉은 필요한 경우 이미징하는 동안 각막을 제자리에 고정시키는 데 사용할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 문화 기간
<ol><li>OptiMEM으로 구성된 저혈청 배지를 함유하는 육웰 플레이트에서 각막 배양; 1x 인슐린, 트랜스페린 및 셀레늄; 1x 항생제 / 항균제; 0.02 mg/mLCaCl2; 0.2 mg/mL 아스코르브산; 및 0.8 % 열이 비활성화 된 태아 소 혈청. 왼쪽 각막을 저혈청 배지 8 mL 단독으로, 우측 각막을 100 ng/mL eFGF1 (NM141)로 보충된 8 mL의 저혈청 배지에서 배양하였다.<ol>
<li>매일 배지 변화와 함께 14일 동안 6%CO2 와 함께 37°C에서 인큐베이션한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>트리판 블루 염색 절차를 제3일, 6일, 9일, 제12일, 및 제14일에 반복하고, 염색 직후 각막을 이미지화하였다. 모든 시간대에서 카메라 설정을 일관되게 유지해야 합니다.</li>
	<li>12일째에, 대조군 및 eFGF1 (NM141)-보충된 배지 둘 다에 10 μM EdU를 첨가하고, 증식하는 세포를 표지하기 위해 48시간 동안 인큐베이션한다. EdU로 미디어를 갱신하는 것은 13 일째에 다시 추가되었습니다.</li>
	<li>14일째에, EdU, 트리판 염색 및 화상 각막을 첨가한 후 48시간 후, CaCl2 및 MgCl2를 사용한 1x PBS 대신에 칼슘이 Alizarin Red 염색과 상호작용하는 것을 방지하기 위해 헹굼을 위해 일반 1x PBS를 사용한다.</li>
</ol>5. 알리자린 레드 염색
<ol><li>14 일째에 0.9 % 식염수에 5 % Alizarin Red를 준비하십시오. 참고 : Alizarin Red는 식염수에 완전히 용해되지 않습니다. 결합시, 소용돌이 용액과 암석을 적어도 1 시간 동안 암석. 한 번 더 소용돌이 치우고 사용하기 전에 여과하여 용해되지 않은 입자를 제거하십시오.</li>
	<li>트리판 염색 및 이미징이 완료되면 각막을 잘 조여진 접시로 옮기고 각 각막의 내피 표면에 200μL Alizarin Red를 첨가합니다.<ol>
<li>2분 동안 얼룩을 제거한 다음, 각 각막을 1x PBS의 페트리 접시에서 헹구고 과량의 알리자린 레드를 제거한 후 8 mL의 1x PBS로 미리 채워진 6-웰 플레이트에 배치하기 전에 2개의 5분 동안 세척한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>두 번째 세척 후, 해부 현미경으로 각 각막의 벗겨진 부분을 이미지화하십시오. 참고: 트리판 이미징과 달리 각막은 1x PBS에 남아 Alizarin 염색을 이미지화하여 프로세스 중에 건조되지 않도록 할 수 있습니다.</li>
</ol>6. 고정 및 투과
<ol><li>일단 Alizarin 이미지가 캡처되면, 각막을 12-웰 플레이트로 옮기고, 0.05% Tween-20 (PBS-T)을 함유하는 4 mL의 1x PBS에서 30분 동안 세척하여 고정 전에 조직으로부터 임의의 입자를 제거하였다.</li>
	<li>각막을 실온에서 30분 동안 4% PFA 4mL에 고정시킵니다.</li>
	<li>세포를 1% 트리톤 X-100을 함유하는 1x PBS 4 mL에 5분 동안 투과시키고, 이어서 각각 30분 동안 4 mL의 일반 1x PBS로 3회 세척하였다.</li>
</ol>7. 면역조직화학
<ol><li>2% 소 혈청 알부민 및 2% 염소 혈청을 함유하는 4mL의 1x PBS에서 37°C에서 1시간 동안 각막을 차단한다.</li>
	<li>2.5 μg/mL 일차 항체 마우스 항-ZO-1을 함유하는 블로킹 용액 1 mL를 37°C에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 각각 30분 동안 1x PBS 4 mL에 3회 세척한다. 참고: 플레이트는 항체 염색 중에 기울어져 필요한 시약의 부피를 최소화할 수 있습니다. 각막 전체가 항체 용액에 완전히 잠겨 있는지 확인하십시오.</li>
	<li>0.88 mg/mL 아스코르브산, 0.26 mg/mL CuSO4 및 2.5 μM 알렉사 플루오르488 아지드를 함유하는 칵테일을 사용하여 EdU Click-iT 반응을 수행한다.<ol>
<li>반응 성분 준비<ol>
<li>500 μL의 1x PBS를 88 mg의 아스코르브산에 첨가하고 용해될 때까지 와류시킨다.</li>
			<li>44 mg의 CuSO4에 840 μL의 탈이온수를 첨가하고 용해 될 때까지 와류시킨다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>다음 시약 6 mL를 이 순서로 1x PBS에 첨가하여 칵테일을 준비하고, 각 첨가 후 혼합하도록 역관: 아스코르브산 용액 30 μL, CuSO4 용액 30 μL, 그 다음 알렉사 플루오르 488 15 μL의 참고: 일단 준비되면 이 솔루션은 빛에 민감합니다. 프로토콜의 나머지 부분에서는 각막을 가능한 한 빛으로부터 보호해야합니다.</li>
		<li>각 각막에 EdU 반응 칵테일 1 mL를 넣고 실온에서 1 시간 동안 반응시킨다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>각 각막에 10 μg/mL Hoechst 33342 4 mL를 첨가하고 실온에서 2분 동안 반응시킨 다음, 각각 30분 동안 1x PBS-T로 3회 세척한다.</li>
	<li>2 μg/mL 알렉사 플루오르 555 표지된 염소 항-마우스 IgG를 함유하는 블로킹 용액 1 mL를 37°C에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 각각 30분 동안 1x PBS-T로 3회 세척한다.</li>
	<li>미생물 성장을 방지하기 위해 4°C에서 1% 항/항, 0.1% 시프로플록사신 및 0.1% 암포테리신 B와 함께 1x PBS 4 mL에 각막을 보관하십시오.</li>
	<li>공초점 이미징을 수행할 때는 커버슬립을 탭하여 평평하게 하여 유리 슬라이드에 200μL의 장착 매체에 전체 각막을 장착합니다.</li>
</ol>8. 트리판 이미지 분석
<ol><li>NIH의 오픈 소스 소프트웨어 ImageJ를 사용하여 모든 이미지 분석을 수행합니다. 파일 &gt; 열기 를 사용하여 이미지를 열고 이미지를 클릭&gt; 색상 임계값 조정&gt;니다.</li>
	<li>"색조"슬라이더를 사용하여 파란색 범위 만 포함하고 위쪽의 "밝기"슬라이더를 왼쪽으로 조정하여 얼룩진 영역을 더 많이 포함시킵니다. 참고: 이 작업으로 인해 Trypan 염색되지 않은 이미지 부분이 포함되면 "밝기" 슬라이더가 원래 수준으로 되돌릴 수 있습니다.</li>
	<li>임계 값이 얼룩진 영역을 정확하게 윤곽을 그릴 때까지 위쪽 "채도"슬라이더를 천천히 조정하십시오. 참고: 이 과정에서 원본 이미지의 복사본을 열어 참조하는 것이 도움이 됩니다.</li>
	<li>색상 임계값 메뉴에서 선택 단추를 클릭한 다음 선택 브러쉬 도구를 사용하여 선택된 상처 외부의 영역을 선택 취소합니다.</li>
	<li>분석 &gt; 측정을 클릭하여 염색된 영역을 픽셀 단위로 보고합니다.</li>
	<li>&gt; 선택 편집 &gt; 없음 선택을 사용하여 모두 선택을 취소하고 타원형 선택 도구를 사용하여 팔다리에 최대한 가깝게 맞춘 다음 분석 &gt; 측정을 클릭하여 각막 영역을 픽셀 단위로 보고합니다. 참고: 이미지의 이 부분이 너무 어두울 경우 림푸스의 시각화를 돕기 위해 밝기를 일시적으로 설정할 수 있습니다.</li>
	<li>면적 값을 기록하고 염색 된 영역을 전체 각막의 영역으로 나눈 다음 100을 곱하여 염색 된 백분율을 계산하십시오.</li>
	<li>각 이미지에 대해 이 과정을 두 번 더 반복한 다음 세 측정값의 평균을 취합니다.</li>
</ol>9. 통계 분석
<ol><li>모든 이미지가 분석되면 14일째에 염색된 평균 퍼센트를 0일째에 염색된 퍼센트로 나누어 잔류 치유되지 않은 영역을 결정한다. 이 금액을 100 %에서 빼서 14 일 동안 치유 된 벗겨진 영역의 비율을 계산하십시오.</li>
	<li>쌍을 이룬 t-검정을 사용하여 대조군과 치료 그룹 간의 치유 백분율 값을 비교합니다.</li>
</ol>

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</ol>

DDE, SP, GD 및 JW는 Trefoil Therapeutics, Inc.의 지분을 보유하고 있으며 DDE는 eFGF1 (NM141)을 다루는 특허에 대한 발명가입니다.

많은 안과 의사들은 두 가지 주요 이유로 환자에게 DSO를 추천하는 것에 대해 우려하고 있습니다 : 1) 긴 치유 과정과 2) 데이터 부족 (DSO는 안과 수술 분야의 새로운 개념입니다). 우리가 제시 한 연구는 이러한 두 가지 우려를 완화시키는 데 큰 도움이 될 것입니다. 이 연구 및 다른 연구의 데이터를 바탕으로, FDA는 eFGF1 (NM141)이 DSO17을 겪고있는 환자에게 다양한 투약 일정으로 투여되는 2 상 임상 시험을 승인했습니다.
상기 기재된 방법은 Soh et al.에 의해 수행된 연구 후에 모델링되었고, 여기서 각막 내피 치유는 긁힌 상처 및 박리된 상처18 둘 다에서 ROCK 억제제 Y-27632의 유무에 관계없이 평가되었다. Y-27632는 Descemet의 막이 손상되지 않은 상태에서 내피 재생을 가속화 시켰지만 치료를하더라도 벗겨진 상처에서 실질적인 치유는 발견되지 않았습니다. eFGF1 (NM141)의 유무에 관계없이 유사한 스트리핑 기술을 사용하여 우리가 발견 한 관찰은 Soh 및 동료의 관찰과 일치하지 않았습니다. 14 일째에 많은 치료 된 각막에서 Trypan Blue 염색이 부재하고 개혁 된 내피층 내에 ZO-1 양성 단단한 접합부의 존재는 CEC의 자연 기능의 일부인 손상되지 않은 장벽이 정상 및 영양 장애 각막에서 회복되었다고 주장합니다. 이 연구에서 정량화되지는 않았지만, 벗겨진 부위 안팎의 EdU 양성 세포의 존재는 또한 치유 메커니즘으로서 증식을 시사하며, 우리가 이전에 확립 한 것은 손상된 각막16에서 eFGF1 (NM141)에 의해 자극 될 수 있습니다. 통계적 분석은 eFGF1 (NM141)을 사용한 치료가 DSO로부터 유의하게 더 큰 치유를 가져왔고, 14일 시점에서 대조군 각막보다 평균 두 배 이상 높았다. 치유율은 기증자 각막의 전형적인 특징 인 개인마다 적당히 다르지만 큰 표본 크기에 대한 결과의 재현성은 또한 매우 측정 가능한 방법을 입증합니다. 우리의 지식에 따르면, 문헌에는 생체 외 Descemet의 스트리핑 모델의 다른 예가 없습니다.
DSO를 연구하는 다른 연구자들에게 가치있는 프로토콜 자체의 핵심 구성 요소는 베어 스트로마를 감지하기 위해 Trypan Blue를 사용하고 염색 된 영역을 측정하는 데 사용되는 이미지 처리 기술입니다. Trypan Blue는 안과 수술에서 일반적으로 사용되며, 특히 Descemet의 막으로 작업하여 생존 할 수없는 세포를 감지하고 조직의 가시성을 돕습니다. 이 프로토콜에 포함된 염색 시점은 고농도19에서 CECs에 독성이 있는 것으로 나타났기 때문에 각막을 트리판 블루에 과다 노출시키지 않으면서 효과적인 반복 염색을 허용하였다. Alizarin Red 및 면역 조직 화학에 의해 이동 된 CEC의 결과로 확인 된 모든 각막에서 14 일 동안 염색 된 면적의 감소는 치유를 측정하는 간단하고 재현 가능한 방법을 보여줍니다. ImageJ의 색상 임계값 메뉴를 사용하여 여러 분석가가 표준 편차가 일관되게 1% 미만인 데이터를 수집했습니다(데이터는 표시되지 않음). 대체 프로그램이 유사하게 수행 될 수 있지만 ImageJ는 치유를 추적하기 위해 정확한 영역 측정을 생성 할 수있는 오픈 소스 소프트웨어입니다.
그러나 스트리핑 프로토콜의 한 측면은 상처 생성에 필요하지만 전반적인 치유 과정을 방해하는 것으로 나타났습니다. 날카로운 30G 바늘을 사용하여 생검 펀치가 남긴 마크를 따라 Descemet의 막을 스코어링하면 임상의가 더 빠른 치유를 지원하기 위해 주목하는 매끄럽고 원형 상처(10)를 만들 수 있습니다. 동시에, 이 단계는 기질 섬유에 눈물을 만들어 기질 세포 사멸을 일으키고, 상처 가장자리를 가로지르는 내피 세포의 이동을 방해하고, 결절의 형성을 유도하여 수술 후 부종(20)을 더욱 지속시킬 수 있기 때문에 각막에 손상을 입힌다. DSO를 수행하는 임상의는 전형적으로 역방향 Sinskey 후크를 사용하여 상처를 개시하지만, 안압이 각막을 유지시키지 않고, 이 도구는 생체외 모델에서 덜 효과적이다. 기본 스트로마를 손상시키지 않고 Descemet의 막을 찢을 수있는 대체 도구는 Macsai와 Shiloach10이 권장하는 관개 및 흡인 핸드피스와 같이 프로토콜을 개선 할 것입니다. 이 기술이 생체외 모델과 양립가능한지 여부를 결정하기 위해 추가적인 실험이 필요할 것이다.
생체외 모델에 내재적으로 나타나는 도전은 상처 말초 부위, 특히 영양 장애 각막에서 CEC 사망의 빈번한 발생이다. 이것은 때때로 상처 부위의 모호한 정량화인데, 이는 염색 된 영역이 곡률이 고르지 않은 광 분포를 초래하는 각막의 중심을 넘어 확장됨에 따라 색상 임계 값의 정확도가 더욱 제한되기 때문입니다. 그러나, 이러한 가변 측정은 주로 손상된 CEC가 제거되고 이웃 세포가 그들을 대체하기 위해 스트레칭, 이동 또는 증식됨에 따라 말초 염색이 점차 물러나기 전에 초기 시점에서 발생했다. 마지막 14 일 시점까지, 염색 된 영역은 각막의 중심으로 다시 국부화되었고, 모든 이미지는 측정 가능했다. 비슷한 관찰이 Soh et al.에 의해 비교 빈도로 이루어졌으며, 14 개의 정상 각막 중 다섯 개는 배양 기간18 초기에 '조기 배양 실패'(PCF)라고 불리는 것을 제시했습니다. 손상은 우리의 각막에서 시간이 지남에 따라 반전되었지만 영구적 이었지만 이것은 그들의 방법이 각막의 더 큰 영역을 상처 입힐 필요가 있다는 사실에 기인 할 수 있습니다. 영양 장애 각막에서 더 널리 퍼진 말초 트리판 염색의 관찰은 영양 장애 각막이 건강한 각막보다 내피 세포 사멸에 더 취약하다는 것을 나타낼 수 있습니다. 이 세포 사멸의 정확한 원인은 아직 밝혀지지 않았지만, 우리는이 문제가 생체 내에서 인간의 각막과 관련이 없을 것이라고 생각합니다. 말초 내피의 손상은 우리의 지식에 대한 DSO의 어떠한 임상 사례 연구에서도 보고되지 않았으며, 이는 이러한 현상이 공여체 각막 배양된 생체외 6,8,10,11,21에만 고유하다는 것을 시사한다. 대조군 각막만 염색된 두 가지 경우를 제외하고, 말초 염색의 모든 관찰이 쌍을 이루었기 때문에 그 원인이 eFGF1 (NM141)에 노출되었을 가능성은 거의 없다. 그러나, 이러한 경우에 치료가 그렇지 않으면 양쪽 각막에서 말초 염색을 유도했을 손상에 대한 보호 효과를 제공했을 수 있습니다. 이 가설에 대한 추가 조사가 필요합니다.
이 방법의 또 다른 한계는 DSO가 의도되는 FECD 표현형을 대표하는 공여체 각막을 소싱하는 것입니다. 모든 종류의 기증자 각막은 부족하므로 기증자 조직의 사용을 피하는 수술이 필요합니다. 우리의 목적을 위해, 이용 가능한 유일한 각막은 여러 가지 이유로 이식에서 거부 된 것들입니다. 안구 은행은 이러한 각막을 구태의 존재, 낮거나 측정 할 수없는 ECD 및 불규칙한 CEC 형태를 포함한 기준에 따라 정상 또는 영양 장애로 분류합니다. 대부분의 기증자의 병력에는 과거 안구 병력이 포함되어 있지 않으며 제공되는 유일한 정보는 ECD 값, 기술자의 메모 및 경우에 따라 대표적인 스페큘러 이미지이기 때문에 안구 은행에서 조직을 수락하기 전에 영양 장애 진단을 확인하는 것도 거의 불가능합니다. 이 연구를 위해 수득된 영양 이상성 각막은 배양 기간이 완료된 후에 수행된 공초점 현미경 검사시 합류성 중앙 구태를 나타내지 않았으며, 이는 이들이 FECD의 "초기" 단계를 나타낼 수 있음을 시사한다. 우리는 DSO의 목적이 구태의 합류 영역을 제거하여 건강한 말초 세포가 안쪽으로 이동할 수 있도록하는 것이므로 이것이 연구의 의미에 큰 영향을 미칠 것으로 기대하지 않습니다.
이 방법은 CEC 확산 및 마이그레이션에 영향을 줄 수 있는 에이전트를 평가할 수 있는 매우 적용 가능하고 재현 가능한 기술을 제공합니다. 이 모델은 인간 각막 조직 이식 편22,23,24에 시딩된 경우에도 배양된 CEC를 포함하는 시험관내 모델보다 생리학적으로 더 관련성이 높은 몇 가지 특징을 갖는다. 첫째, 자극 될 CEC는 환자의 눈에 존재하는 것과 정확히 같은 단층에 있으며, 임상 DSO 후와 마찬가지로 각막 기질을 가로 질러 이동하고 있습니다. 문제의 스트로마는 CEC와 동일한 환자에서 나온 것이므로 잠재적 인 FECD 관련 기질 차이를 제어합니다. 배양 과정에서 내피에서 중간엽으로의 전이 (EnMT)에 대한 관련 과제와 잠재력을 가진 CEC의 문화를 발굴, 해리 및 확장 할 필요가 없습니다. 기술된 프로토콜은 그 자체가 임상 DSO 절차와 매우 유사하다. 배양 및 확장 단계를 우회하는 반면, 이 방법은 상피층이 유지되지 않기 때문에 각막 부종에 의해 연구 기간이 제한된다는 한계를 갖는다. 이로 인해 제거 된 영역을 덮기 위해 마이그레이션 된 CEC의 형태를 조사하는 것을 방해하며,이 모델에서 결국 육각형 배열로 재배열 될지 여부는 불분명 해집니다. Garcin et al.은 전통적인 장기 배양에서 유지되는 각막보다 현저히 적은 부종으로 최대 3 개월 동안 각막을 배양하는 것으로 입증 된 장치 인 활성 저장 기계 (ASM)로 하나의 잠재적 인 솔루션을 개발했습니다25. 이러한 장치는이 작업을 복제하고 확장하는 데 도움이 될 수 있습니다.
이 모델은 다른 상처 치유 요법 (예 : ROCK 억제제)을 테스트하고, 수술 기술에 대한 변형을 평가하고, 다른 기증자 집단 또는 질병 단계에서 치유를 비교하는 데 잠재적 인 유용성을 가지고 있습니다. 우리는이 연구가 임상 시험 데이터와 함께 나오면서 임상의가 DSO를 자격을 갖춘 FECD 환자에게 가치있는 치료 옵션으로 고려하도록 장려하기를 바랍니다.

Fuchs 내피 각막 이영양증 (FECD)은 각막 내피 세포 (CECs)에서 펌프 기능 상실과 Descemet의 막 표면에 콜라겐 및 기타 세포 외 매트릭스 단백질의 과도한 축적을 특징으로하는 질병으로 각막 굿태1을 형성합니다. FECD에 대한 유일하게 알려진 치료법은 다양한 형태의 내피 각막 성형술이며, 이들 모두는 거부 및 내피 세포 손실의 위험이 있습니다2. 안과 수술의 발전으로 인해 이러한 절차가 시간이 지남에 따라 덜 침습적 일 수 있었지만 모든 형태의 이식에는 거부의 위험과 평생 스테로이드 사용의 가능성이 있으며, 이는 자체 수반되는 부작용이있는 치료법입니다. 더욱이, 전 세계 기증자 조직 부족은 도움이 필요한 70 명의 환자마다 단 하나의 기증자 각막 만 이용할 수 있습니다3. 이러한 도전을 감안할 때, 연구자와 임상의는 기증자 조직의 필요성을 완전히 피하는 수술 방법을 모색하고 있습니다. 이러한 실험 기술 중 하나는 Descemet의 Stripping Only (DSO) 또는 Descemetorhexis without Endothelial Keratoplasty (DWEK)이며, 각막의 중앙에 국한 된 guttae를 가진 FECD 환자는 이식편 배치없이 벗겨진 Descemet의 막의 중앙 4mm 원을 가지고 있습니다. guttae의 제거는 건강한 말초 세포가 안쪽으로 이동하고 내피 단층을 개혁하여 결국 기질 부종을 역전시키고 시력을 개선하도록 장려합니다. 이 개념은 원래 환자가 Descemet의 막의 분리로 인해 복잡한 수술을 받았지만 CEC 재 집단은 여전히 4,5,6,7 건에 달했습니다. 이 방법에는 많은 장점이 있지만, 일부 환자는 수술 후 몇 달 동안 치유가 보이지 않으면 구조 이식이 필요하기 때문에 치유 과정이 길고 일관성이 없습니다8. 이러한 이유로, CEC의 빠른 이동 및 증식을 자극하는 약물은 DSO를 겪은 FECD 환자의 회복 과정에 유익할 수 있다.
최근의 몇몇 연구들은 ROCK 억제제를 DSO를 받는 환자들을 위한 보충 치료제로 평가했으며, 치료받은 환자들이 DSO만9,10,11군에 있는 환자들보다 더 빨리 회복되고 더 높은 중심 내피 세포 밀도(ECD)를 가졌다는 것을 발견했다. 그러나, 작은 표본 크기와 투약 요법 사이의 차이로 인해, 이 설정에서 ROCK 억제제의 효능을 더 잘 이해하기 위해서는 더 많은 데이터가 필요하다.
섬유아세포 성장 인자는 또한 소 CECs를 사용한 시험관내 및 고양이 각막12,13의 생체내 둘 다의 각막 내피의 재생을 자극하는 것으로 나타났다. eFGF1 (NM141)은 훨씬 짧은 반감기 14,15를 갖는 천연 FGF-1과는 대조적으로 분자를 안정화시키기 위해 여러 아미노산 치환을 함유하는 FGF-1의 조작된 버전이다. 우리는 이전에 사분기형 인간 각막(16)에서 생체외에서 CECs의 증식을 자극하는 eFGF1(NM141)의 능력을 입증하였다. 이 연구는 eFGF1 (NM141)과 같은 보조 치료가 본 응용에서 치유를 가속화하는지 여부를 결정하기 위해 정상 및 영양 장애 각막 모두에서 DSO의 최초의 성공적인 생체외 모델을 확립함으로써 그 작업을 개선하고자 하였다.

<table><tbody><tr><td>0.2&마이크로; m 멸균 1000 mL 필터 유닛</td><td>VWR</td><td>10040-440</td><td></td></tr><tr><td>0.2&micro; m 멸균 250 mL 필터 유닛</td><td>VWR</td><td>10040-464</td><td></td></tr><tr><td>0.2&micro; m 멸균 500 mL 필터 유닛</td><td>VWR</td><td>10040-436</td><td></td></tr><tr><td>10mL 주사기 Luer-Lok Tip</td><td>Becton Dickinson</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>12 웰 조직 배양 처리 플레이트</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원뿔형 튜브</td><td>VWR</td><td>89039-668</td><td></td></tr><tr><td>16% 파라포름알데히드 (PFA)</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>2mL 흡인 피펫</td><td>VWR</td><td>414004-265</td><td></td></tr><tr><td>310 직접 열 CO2 인큐베이터</td><td>Forma Scientific</td><td>13-998-082</td><td>37°C로 설정; C, 6% CO2</sub</td></tr><tr><td>>50 mL 코니컬 튜브</td><td>VWR</td><td>89039-660</td><td></td></tr><tr><td>5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU)</td><td>Thermo Scientific</td><td>C10337</td><td></td></tr><tr><td>5mL, 10mL, 25mL 및 50mL 혈청학 피펫</td><td>VWR</td><td>89130-896, -898,&nbsp; -900, -902</td><td></td></tr><tr><td>6웰 조직 배양 처리 플레이트</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>70% 에탄올</td><td>BDH</td><td>BDH1164-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 azide</td><td>Thermo Scientific</td><td>A10266</td><td></td></tr><tr><td>Alizarin Red S</td><td>Sigma</td><td>A5533-25G</td><td></td></tr><tr><td>분석 저울</td><td>Sartorious</td><td>R200D</td><td></td></tr><tr><td>항생제 및 항진균제 100x (항)</td><td>Thermo Scientific</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>항자성 스테인리스강 집게</td><td>Excelta</td><td>7-SA</td><td></td></tr><tr><td>보틀 탑 디스펜서</td><td>Ward's Science</td><td>470134-946</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9700-100</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘(CaCl)</td><td>Amresco</td><td>1B1110-500G</td><td></td></tr><tr><td>Chex-all II 멸균 파우치</td><td>Propperman&nbsp;</td><td>24008</td><td></td></tr><tr><td>Cirpofloxacin hydrochloride</td><td>Alfa Aesar</td><td>J61970</td><td></td></tr><tr><td>구리(II) 황산염 5수화물(CuSO4)</td><td>Sigma</td><td>469130-50g</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Nikon</td><td>SMZ1270</td><td></td></tr><tr><td>건식 진공 펌프</td><td>Welch</td><td>2019B-01</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>A31606-01</td><td></td></tr><tr><td>젖빛 마이크로 슬라이드</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>갤럭시 미니스타 마이크로 원심분리기</td><td>VWR</td><td>C1413, VWR</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 IgG (H+L) 2차 항체, Alexa Fluor Plus 555</td><td>Thermo Scientific</td><td>A32727</td><td></td></tr><tr><td>염소 혈청</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Haemo-Sol 세제</td><td>Haemo-Sol International LLC</td><td>026-050</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342, 트리하이드로클로라이드, 트리하이드레이트</td><td>Thermo Scientific</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>핫 플레이트/교반기</td><td>Corning</td><td>PC-320</td><td></td></tr><tr><td>Human corneas</td><td>Lions Eye Institute for Transplant and Research, Advancing Sight Network, Eversight Eye Bank, Lions Vision Gift 및 Georgia Eye Bank</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid (HCl)</td><td>BDH</td><td>BDH7204</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>국립 보건원</td><td>버전 : 1.52a</td><td></td></tr><tr><td>인피니티 3s 현미경 카메라</td><td>Lumenera</td><td>1URCAP2</td><td></td></tr><tr><td>인피니티 분석 소프트웨어</td><td>Lumenera</td><td>버전 6.5.5</td><td></td></tr><tr><td>인슐린 트랜스페린 셀레늄 (ITS)</td> <td>Corning</td><td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>홍채 가위, 11cm</td><td>세계 정밀 기기</td><td>501264-G</td><td></td></tr><tr><td>L- 아스코르브 산</td><td>Sigma</td><td>A4544-25G</td><td></td></tr><tr><td>수동 단일 채널 피펫</td><td>Rainin</td><td>&nbsp; 17014-392, -391, -382</td><td></td></tr><tr><td>Needle PrecisionGlide 30G</td><td>Becton Dickinson</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>N-MET141 TTHX1114</td><td>바이오 의약품 개발 프로그램</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I + GlutaMAX-1 (Opti-MEM)</td><td>Thermo Scientific</td><td>51985-034</td><td></td></tr><tr><td>Orion Star A211 pH meter</td><td>Thermo Scientific</td><td>STARA211</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>VWR</td><td>89107-632</td><td></td></tr><tr><td>염화칼륨 (KCl)</td><td>BDH</td><td>BDH9258-500G</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨 일염기성 (KH2PO4)</td><td>VWR</td><td>0781-500G</td><td></td></tr><tr><td>파워펫 플러스 피펫 컨트롤러</td><td>VWR</td><td>75856-456</td><td></td></tr><tr><td>정밀 수조 188</td><td>Precision Scientific Incorporated</td><td>WB05</td><td>37°°로 설정; C</td></tr><tr><td>정수기 클래스 II 모델 생물안전 캐비닛</td><td>Labconco</td><td>36213043726</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock 튜브, 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22363212</td><td></td></tr><tr><td>메스 크기 22 스테인리스 스틸&nbsp;</td><td>Sklar</td><td>446479</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨 (NaCl)</td><td>VWR</td><td>2041-2.5K</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성 (Na2HPO4)</td><td>VWR</td><td>0404-1KG</td><td></td></tr><tr><td>표준 쉐이커</td><td>VWR</td><td>89032-092</td><td></td></tr><tr><td>표준 고체 냉장고</td><td>VWR</td><td>10820-402</td><td>4°C로 설정; C</td></tr><tr><td>멸균 오토 클레이브</td><td>시장 단조</td><td>STM-EL</td><td></td></tr><tr><td>주사기 필터</td><td>VWR</td><td>28145-477</td><td></td></tr><tr><td>시험관 로커</td><td>Thermo Scientific</td><td>M48725Q</td><td></td></tr><tr><td>Tru-Punch 일회용 생검 펀치, 4 mm</td><td>Sklar</td><td>96-1146</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Thermo Scientific</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P7949-100mL</td><td></td></tr><tr>DAPI <td>Vector Laboratories Inc.</td><td>의 Vibrance 페이드 방지 장착 매체</td><td>H-1800</td><td></td></tr><tr><td>VistaVision 커버 안경, no. 1</td><td>VWR</td><td>16004-098</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td><td>Fisher Scientific</td><td>G-560</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1 monoclonal 항체 (ZO1-1A12)</td><td>Thermo Scientific</td><td>33-9100</td><td></td></tr></tbody></table>

조작된 섬유아세포 성장 인자 1에 의해 자극된 가속화된 치유를 통해서만 descemet의 스트리핑의 인간 각막 배양 모델

A Human Corneal Organ Culture Model of Descemet's Stripping Only with Accelerated Healing Stimulated by Engineered Fibroblast Growth Factor 1

Fuchs 내피 각막 이영양증 (FECD)은 기능 장애 각막 내피 세포 (CECs)에서 발생하며 현재 전체 각막 또는 Descemet의 막의 이식에 의해 치료됩니다. 안구 수술의 최근 발전으로 인해 Descemet의 Stripping Only (DSO)은 CEC가 부드러운 스트로마로 이동하여 각막에 기능과 시력을 회복 할 수 있도록 구타 밀도가 높은 Descemet의 막의 중앙 원을 제거하는 수술 기술입니다. 이 잠재적 인 치료 옵션은 안과 연구 분야에서 높은 관심을 가지고 있지만, DSO의 성공적인 생체 외 모델은 확립되지 않았으며 임상 데이터는 제한적입니다. 이 작품은 인간 기증자 각막에서 DSO를 시뮬레이션하는 새로운 상처 치유 모델을 제시합니다. 인간 조작된 FGF1 (NM141)의 효능을 평가하기 위해 이 접근법을 사용하여, 우리는 치료가 CECs의 이동 및 증식의 자극을 통해 치유를 가속화한다는 것을 발견하였다. 이 발견은 DSO 절차의 표적 집단으로서 Fuchs' Dystrophy 환자에서 이러한 결과가 복제될 수 있다는 것을 확인하기 위해 안구 은행에 의해 보고된 이영양증의 징후를 갖는 11쌍의 인간 각막에서 확인되었다.

이 실험은 처음에는 10 쌍의 정상적인 연구 각막으로 수행되었으며, 가장 쉽게 구할 수 있습니다. 일단 상기 방법이 성공적인 것으로 밝혀지면, 연구는 FECD 환자 집단을 대표하는 각막에서 eFGF1 (NM141)의 효과를 연구하기 위해 스펙큘러 평가에 기초한 안구 은행에 의해 그와 같이 표지된 영양 장애 각막의 11 쌍에서 복제되었다. 더 큰 임상적 관련성을 위해, 본 연구에 포함된 수치는 달리 언급되지 않는 한 영양 장애 각막으로부터 수집된 데이터를 나타낸다.
DSO의 수술 결과를 시뮬레이션한 후, 트리판 블루 염색을 수행하고 14일 배양 기간에 걸쳐 반복하고, 양성 염색의 감소를 정량화하여 상처 치유를 평가하였다(도 2). Alizarin Red 염색은 또한 세포 경계를 묘사하기 위해 14일째에 수행되었다. 뚜렷한 패턴이 보이지 않는 짙은 적색 부위 (이하 음성 염색이라고 함)는 병변의 치유되지 않은 부분과 세포가 손상되거나 누락 된 것으로 추정되는 각막의 다른 부위에서 일관되게 나타났습니다. 14일째에 트리판 블루에 대해 양성으로 염색된 부위는 Alizarin Red의 음성 염색과 잘 일치했습니다(그림 2). eFGF1 (NM141)로 처리된 모든 영양 장애 각막은 처리되지 않은 메이트에 비해 14일째에 더 큰 치유를 보였다. 평균적으로, 처리된 각막은 대조군 각막에서 38%와 대조적으로 91% 치유를 입증하였고, 이러한 차이는 통계적으로 유의하였다(p&lt;0.001)(도 3A). 이는 20개의 정상 각막으로부터 수득된 결과와 필적하며, 여기서 대조군은 평균 32%의 치유를 보였고, 처리된 각막은 81%에 도달하였고, 이는 다시 통계적으로 유의하였다(p&lt;0.001)(보충 도표 1). 치유된 퍼센트는 동일한 분산을 가정하는 두 개의 샘플 t-검정을 사용하여 정상 및 영양 장애 각막 사이에서 비교되었고, 대조군 또는 치료 그룹 중 어느 하나에서도 유의한 차이가 나타나지 않았다(데이터는 나타내지 않음).
정상 및 영양 장애 각막 모두에 대해 안구 은행에서 제공하는 공여체 정보(표 1)를 분석하여 나이, 옵티졸에 저장된 일수, 사망 내지 수집 간격, 세포 밀도 및 성별을 포함하는 특성이 치유와 상관관계가 있는지를 확인하였다. 피어슨의 상관 계수 (r)는 성별을 제외한 모든 요인을 조사하는 데 사용되었으며, 남성과 여성 간의 치유를 비교하기 위해 짝을 이루지 않은 t- 테스트를 사용하여 평가되었습니다. r의 절대값은 모든 경우에 0.25 미만이었으며, 이는 치유와 나이, 옵티솔에 저장된 일수, 수집 간격에 대한 사망 또는 세포 밀도 사이의 임의의 상관관계가 무시할 수 있는 것으로 간주되었음을 나타낸다. 남성과 여성 사이의 치유의 차이는 통계적으로 유의하지 않았다 (p = 0.53).
정상 데이터 세트와 유사하게, 적어도 하나의 시점 (보통 제3일)에서 병변 내의 염색된 영역에 연결된 벗겨진 영역의 외부에서 주목할 만한 트리판 염색으로 제시된 22개의 영양 장애 각막 중 10개-말초 염색이라고 명명된 관찰을 (도 4A)라고 불렀다. 그 10 개 중 두 개만이 치료 된 각막이 동일한 효과를 나타내지 않은 대조군이었습니다. 나머지 여덟 명은 모두 짝을 이뤄 같은 개체의 각막 사이에 비슷한 중증도를 보였다. 염색 패턴은 정상 및 영양 장애 각막 사이에서 비교되었지만, 말초 염색의 빈도는 정상 그룹의 25 %에 비해 각막 양성의 45 %를 가진 영양 장애 데이터 세트에서 더 높았다. 도 4A는 병변 외부의 염색된 영역이 6일째 이미지에서 상처 가장자리를 만나고 점차 후퇴함에 따라 말초 염색에 대해 양성으로 간주되었던 쌍을 도시한다. 상응하는 Alizarin Red 이미지에서, 말초 Trypan 염색이 있는 영역의 세포는 벗겨진 영역으로 이동한 세포와 매우 유사하게 확대되고 비정상적으로 형성된 것으로 나타났으며, 음성 염색은 14일째에 트리판 블루가 존재했던 영역과 상관관계가 있었다. 배양 기간 내내 영향을 받은 각막의 많은 부분에도 불구하고, 염색된 주변부의 부분적 또는 완전한 제거는 모든 10개의 각막에서 발생하였다. 또한, 14일째에 치유된 최종 퍼센트는 각막 하나를 제외한 모든 것에 대해 치료 그룹에 따라 각각 정상 범위 내에 있었다. 이상치(0811L, 도 4A에 사진)는 제14일에 병변 영역에 여전히 연결되어 있는 말초 염색의 잔재로 인해 음의 퍼센트 치유 값을 반환하였다(도 3A 및 도 4A). 원거리 말초 염색으로 지칭되는 두 번째 염색 패턴은 도 4B로부터의 Alizarin Red 이미지에서 캡처되었지만, 많은 각막에서 배양 기간 전반에 걸쳐 트리판 블루 이미지에서도 명백하였다(도 4B). 이 관찰은 팔다리 주위의 어두운 염색의 고리가 특징이며, 손상된 내피를 나타냅니다. 이 용어에도 불구하고,이 패턴은 정상 및 영양 장애 각막 모두에서 매우 흔했기 때문에 말초 염색에 대해 양성으로 계산되지 않았습니다. 이들 이미지에서, 대조군 각막은 배양 기간 초기에 유사한 중증도 및 염색 패턴을 갖는 각막 둘 다에도 불구하고, 14일째에 더 생생하고 광범위한 염색을 나타냈다. 또한 처리 된 각막에서 겉으로보기에는 더 많은 수의 세포가 있었으며, 이는 대조군에 비해 더 작고 육각형으로 보였지만 이러한 관찰은 정량적으로 측정되지 않았습니다. 주변부의 곡률로 인해, 벗겨진 영역 내와 바로 주위를 둘러싸고 있는 트리판 염색만이 정량적 분석에 포함되었다. 퍼센트-염색된 값이 모든 영양 장애 각막에 걸쳐 평균화되었을 때, 말초 염색의 출현은 말초 염색이 덜 유행했던 정상 각막에서 보이는 꾸준한 감소와는 대조적으로, 0일째의 그것으로부터 초기 증가를 가져왔다(도 3B).
공초점 영상화에 의해 시각화된 면역조직화학은 CEC 타이트한 접합의 기능적 마커인 ZO-1의 반조직화된 발현을 병변 가장자리 안팎에서 드러낸다(도 5), 알리자린 레드 염색에 의해 유사하게 입증된 패턴이다(도 2 및 도 4). Pleomorphism 및 polymegathism은 대부분의 영양 장애 각막에서 ZO-1에 의해 볼 수 있습니다. 그러나이 관찰은 병든 상태에 기인 할 수 있으며 배양 전에 각막의 정밀 검사시 안구 은행에 의해 주목되었습니다. 무질서한 ZO-1 발현은 세포가 안쪽으로 이동한 처리된 각막의 병변 영역 내에서 관찰되며, 또한 Alizarin Red 패턴과 일치한다. EdU-혼입 세포는 대조군 및 처리된 각막에서 병변의 경계 주위 및 병변 부위의 내부를 볼 수 있다(도 5). 이동된 CEC의 패턴은 또한 Trypan Blue 결과를 반영하는데, 대조군 각막에서는 대부분의 세포가 병변 가장자리의 두 필드 내에서 발견되었으며, 처리된 각막의 CEC는 벗겨진 영역 전체에서 볼 수 있습니다(그림 2).
EdU 라벨링은 증식이 치유에 기여한다는 것을 확인하기 위해 본 연구에서 질적 척도로서 수행되었다. 그러나 EdU를 통합하는 세포의 정량화는 각막 팽창으로 인해 체계적으로 수행 할 수 없었기 때문에 일관되고 복제 가능한 이미지가 병변 안팎에서 캡처되는 것을 방지합니다. 대리자로서, DSO 모델을 확립하기 전에 수행된 연구에서 수행된 정량적 분석이 증식에 미치는 eFGF-1(NM141)의 효과를 입증하기 위해 포함되었다(도 6). 정상 인간 공여체 각막을 메스를 사용하여 사분기로 절단하고, 앞서 기술한 바와 같이 eFGF1 (NM141)의 유무에 관계없이 EdU의 존재 하에 48시간 동안 배양하였다 (Eveleth, 2020)16. Hoechst 33342 및 EdU 표지된 세포의 이미징 및 후속 분석은 각막이 절단된 곳으로부터 세 필드 내에서 분기의 방해받지 않은 중간 영역과 가장자리 영역에서 개별적으로 수행되었다. 중간 영역에서, EdU를 혼입하는 세포의 백분율은 분석된 10개의 각막에 걸쳐 낮고 매우 가변적이었다. 평균적으로, eFGF1 (NM141)로 처리된 쿼터는 대조군 (1.8% ± 2.9%)에 비해 중간 구역에서 EdU 혼입 수준이 더 높았으±(p = 0.239%), 이 차이는 통계적으로 유의하지 않았다(p = 0.239). 상처 가장자리에서, eFGF1 (NM141)로 자극된 처리된 사분기는 대조군 사분기에 비해 평균적일 때 EdU 혼입의 유의하게 더 높은 비율 (18.1% ± 11.5%)을 나타냈다 (10% ± 9.6%, p = 0.012).
표 1: 본 연구에 사용된 22개의 영양 장애 및 20개의 정상 각막에 대한 기증자 정보뿐만 아니라 이전에 EdU 정량화에 사용된 10개의 정상 각막에 대한 정보. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63482/Table%201_Donor%20info.zip" target="_blank">이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63482/63482fig02.jpg"> 그림 2: Descemet의 탈피 후 각막의 중요한 염료 염색. 영양 장애 인간 각막을 중앙 4 mm의 데세멧 막을 벗겨내고 eFGF1 (NM141) (100 ng/mL)과 함께 또는 사용하지 않고 14일 동안 인큐베이션하였다. 병변은 0, 3, 6, 9, 12, 및 14일에 트리판 블루 염색에 의해 시각화되었다. CEC 경계는 14일째에 Alizarin Red 염색에 의해 시각화되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63482/63482fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63482/63482fig03v2.jpg"> 도 3: 영양 장애 인간 각막은 eFGF1 (NM141)로 배양하였을 때 DSO로부터 유의하게 더 큰 치유를 보여준다. (A) 치유 퍼센트는 ImageJ를 사용하여 14일째에 염색된 면적을 측정하고 0일째에 염색된 퍼센트와 비교함으로써 결정되었다. (B) 시간에 따른 그래프화된 평균 염색 퍼센트는 말초 염색의 더 높은 유병률로 인해 영양 장애 각막에서 제3일에 정점을 찍는 동안 정상 각막의 일관된 감소를 나타낸다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63482/63482fig03largev2.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63482/63482fig04.jpg"> 그림 4: 말초 염색을 통한 영양 장애 각막의 바이탈 염료 염색. (A) 손상되지 않은 Descemet의 막의 트리판 염색은 중심을 향해 전진 한 다음 제어 및 처리 된 각막에서 시간이 지남에 따라 클리어링되는 것을 볼 수 있습니다. (B) 팔다리 주위의 Alizarin 패턴은 많은 기증자 각막에서 보이는 말초 손상 및 무질서한 내피의 재확립의 전형적인 관찰을 나타낸다-이 경우 영양 장애. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63482/63482fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63482/63482fig05.jpg"> 도 5: 탈피된 영양 장애 각막에서 eFGF1 (NM141)에 의한 CECs의 이동 및 증식의 자극. Descemet의 벗겨진 각막의 공초점 현미경 사진은 ZO-1 (빨간색), EdU (녹색) 및 Hoechst 33342 (파란색)로 염색되었습니다. 점선은 이미지의 왼쪽에 벗겨진 영역과 오른쪽에 손상되지 않은 Descemet의 막이있는 병변 가장자리를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63482/63482fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63482/63482fig06v2.jpg"> 도 6: 메스를 사용하여 분기된 정상 각막으로부터의 증식 세포의 정량화, eFGF-1 (NM141)이 있거나 없는 EdU를 함유하는 배지에서 48시간 동안 인큐베이션. 쿼터는 방해받지 않은 중간 영역과 절단 가장자리를 따라 삼중으로 이미지화되었으며, 카운트는 중간 및 가장자리 영역에서 EdU를 통합하는 세포의 비율을 결정하기 위해 평균화되었습니다. 허가와 함께 사용 된 안구 약리학 및 치료 저널 (Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics)에서 수정 된 그림16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63482/63482fig06largev2.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 1: 정상 인간 각막은 eFGF1 (NM141)로 배양할 때 DSO로부터 유의하게 더 큰 치유를 나타낸다. ImageJ는 염색된 부위를 측정하고 치유 %를 결정하기 위해 사용되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63482/Supplemental%20Figure%201.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Descemet's Stripping Only는 Fuchs 내피 각막 이영양증으로 인한 중앙 각막 굿태를 가진 환자가 말초 세포가 내피층을 재생시키기 위해 Descemet의 막을 벗겨내는 실험 절차입니다. 우리는 eFGF1 (NM141)에 의해 자극된 가속화된 치유와 함께 영양 장애 인간 각막 생체외 에서 DSO를 시뮬레이션하는 새로운 방법론을 제시한다.

조작된 섬유아세포 성장 인자 1에 의해 자극된 가속화된 치유를 통해서만 Descemet의 스트리핑의 인간 각막 배양 모델

Fuchs Endothelial Corneal Dystrophy (FECD) results from dysfunctional corneal endothelial cells (CECs) and is currently treated by transplantation of the ...

이 비디오의 목적은 조작 된 섬유 아세포 성장 인자 하나에 의해 자극 된 가속화 된 치유와 함께 Descemet의 Stripping Only의 인간 각막 장기 배양 모델을 설명하는 것입니다. Fuch의 내피 각막 이영양증 (Fecd 's Endothelial Corneal Dystrophy) 또는 FECD는 각막 내피 세포에서 펌프 기능이 손실되고 Descemet의 막 표면에 콜라겐 및 기타 세포 외 매트릭스 단백질이 과도하게 축적되어 각막 구태를 형성하는 것을 특징으로하는 질병입니다. FECD에 대한 유일하게 알려진 치료법은 다양한 형태의 내피 각막 성형술이며, 이들 모두는 거부 및 내피 세포 손실의 위험이 있습니다.안과 수술의 발전으로 인해 이러한 절차가 시간이 지남에 따라 덜 침습적 일 수 있었지만 모든 형태의 이식에는 거부의 위험과 평생 스테로이드 사용의 가능성이 있습니다. Descemet's Stripping Only, 또는 DSO는 각막의 중앙에 국한된 굿태를 가진 FECD 환자들이 이식편 교체 없이 제거된 데세멧 막의 중앙 네 밀리미터 원을 갖는 실험적 대안이다. guttae의 제거는 건강한 말초 세포가 안쪽으로 이동하고 내피 단층을 개혁하여 결국 기질 부종을 역전시키고 시력을 개선하도록 장려합니다.이 방법에는 많은 장점이 있지만 치유 과정은 길고 일관성이 없으며 일부 환자는 수술 다음 달에 치유가 보이지 않으면 구조 이식이 필요합니다. DSO에 이어 더 빠른 상처 치유를 자극하는 치료법은 FECD를 가진 환자에게 시술을 더 실현 가능한 옵션으로 만들 수 있습니다. 이 프로토콜은 DSO에 따른 상처 치유를 개선하기 위한 치료법을 테스트하는 것을 목표로 인간 기증자 각막을 사용하여 장기 배양 형식으로 임상 DSO 절차를 모델링하여 DSO를 FECD 환자에게 보다 실현 가능한 옵션으로 만듭니다.우리 연구실은이 모델을 사용하여 조작 된 섬유 아세포 성장 인자로 치료 된 각막의 상처 치유를 테스트하며,이 비디오 뒷부분에서 대표적인 결과를 보여줄 것입니다. 절차의이 부분에서는 생검 펀치를 사용하여 Descemet의 막이 벗겨 질 네 밀리미터의 상처 영역을 표시합니다. 멸균 포셉을 사용하여 배지에서 각막을 제거하고 1X PBS로 헹구어 잔류 배지 및 세포 파편을 제거한다.헹굼 후, 각막 내피 쪽을 페트리 접시의 뚜껑에 올려 놓습니다. 새로운 네 밀리미터 생검 펀치를 트리판 블루에 용접 접시에 담그고 과잉을 두드리십시오. 양손으로 펀치를 각막의 중심 위에 놓고 내피 표면에 똑바로 내려 최소한의 압력을 가합니다.각막의 위치나 압력을 변경하지 않고 펀치를 한 손으로 옮기고 새로 자유로운 손으로 포셉에 닿습니다. 포셉을 사용하여 각막을 제자리에 고정시키고 생검 펀치를 약 90도 앞뒤로 부드럽게 여러 번 비틀어줍니다. 생검 펀치를 각막에서 똑바로 들어 올리고 따로 보관하십시오.1X PBS로 한번 더 헹구어 과량의 트리판 블루를 제거하였다. 페트리 접시 뚜껑의 각막을 해부 범위로 옮깁니다. 구부러진 포셉으로 각막을 제자리에 고정하면 생검 펀치가 남긴 트리판 블루의 링을 따라 날카로운 30 게이지 바늘의 끝을 가볍게 드래그하여 Descemet의 막을 채점합니다.기본 스트로마를 방해하지 않도록 최소한의 압력을 사용하십시오. 신스키 후크를 사용하면 부드러운 스쿠핑 동작을 사용하여 상처 가장자리 주변의 Descemet의 멤브레인을 들어 올리고 벗겨냅니다. 병변의 중심을 향해 일합니다.Descemet의 막은 거의 저항하지 않아야합니다. 어려움을 겪고 있다면 스트로마를 끌어 올릴 가능성이 큽니다. 이런 일이 발생하면 상처 가장자리를 따라 새 지점에서 들어 올리면서 다시 시작하십시오.Descemet의 막의 대부분이 스트로마에서 분리되면 Gorovoy 포셉을 사용하여 멤브레인을 제거하고 따로 두십시오. 벗겨진 부위에 남아있는 멤브레인 조각이 있는지 검사하고 Gorovoy 포셉으로 제거하십시오. Descemet의 벗겨진 후 각막을 트리판 블루로 얼룩지게하여 상처 부위를 시각화합니다.각막을 0.01% 염화칼슘 및 염화마그네슘을 함유하는 1X PBS로 헹구어 트리판 블루와 상호작용할 수 있는 세포 파편을 제거하고 손상되지 않은 데세멧의 막에 대한 나머지 CECs의 긴밀한 부착을 촉진한다. 각막을 용접 접시에 넣고 30 마이크로 리터의 트리판 블루를 피펫에 넣고 30 초 동안 내피 층에 놓습니다. 포셉을 사용하여 각막을 부드럽게 흔들어 내피 표면 전체가 덮여 있는지 확인하십시오.칼슘과 마그네슘으로 PDS에서 과량의 트리판 블루를 헹구고, 염색된 각막을 하루 영점 동안 해부 현미경으로 이미지화한다. 이 절차가 완료된 후, 각막을 다음의 열거된 성분들로 구성된 저혈청 배지를 함유하는 여섯 웰 플레이트에서 배양한다. 왼쪽 각막을 저혈청 배지 단독의 여덟 밀에서 배양하고, 우측 각막을 조작된 FGF-1 또는 다른 바람직한 시험 치료법으로 보충된 저혈청 배지에서 배양한다.매일 미디어 변화로 14 일 동안 6 % CO2로 섭씨 37도에서 각막을 배양하십시오. 트리판 염색 과정을 일, 셋, 여섯, 아홉, 12 및 14일에 반복하고, 염색 직후 각 각막을 이미지화한다. 모든 시간대에서 카메라 설정을 일관되게 유지해야 합니다.배양 기간 이후에 추가적인 얼룩은 연구 관심사, 특히 실험에 기초하여 각막에 대해 수행될 수 있다. 우리 실험실의 연구 관심사와 관련된 추가 염색에는 Alizarin 염색뿐만 아니라 EDU 혼입 및 ZO-1 단단한 접합 단백질에 대한 형광 염색이 포함됩니다. Alizarin 염색은 트립판 염색 결과를 확인하고 치유 된 부위의 세포 형태를 시각화하기 위해 세포 경계를 시각화하기 위해 수행됩니다.ZO-1 면역형광 염색은 치유된 부위 안팎에서 특히 관심이 있는 CEC 사이의 타이트한 접합 형성의 가시화를 가능하게 한다. EdU 표지는 증식이 치유에 기여한다는 것을 확인하기위한 질적 척도로 수행되며 일부 상황에서 증식하는 세포를 정량화하는 데에도 사용될 수 있습니다. 이러한 특정 염색 절차를 수행하는 방법에 대한 자세한 지침은이 비디오에 해당하는 기사에 포함되어 있습니다.다음은 14일의 기간에 걸쳐 조작된 FGF-1의 유무에 관계없이 인큐베이션된 Eye-Bank에 의해 영양 이상성으로 판단된 한 쌍의 각막의 대표적인 이미지이다. 이미지에서 볼 수 있듯이, 조작된 FGF-1 처리된 각막은 처리되지 않은 대조군 각막에 비해 치유가 가속화되었음을 입증했습니다. 배양 기간의 말기에 추가적인 Alizarin 염색은, 세포 경계를 묘사하고 이들 발견으로 확인하는데 기여하였다.이 관찰은 임상 DSO 절차와 가장 관련이있는 각막의 샘플에서 모델을 검증하기 위해 영양 장애 각막의 11 쌍에 걸쳐 복제되었습니다. ImageJ와 같은 이미지 처리 소프트웨어는 여기에서 볼 수 있듯이 상처 치유 진행을 정량화하기 위해 이러한 이미지에서 염색 된 영역을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 조작된 FGF-1로 처리된 모든 영양 장애 각막은 14일째에 더 큰 치유를 보였으며, 처리되지 않은 짝에 비해 대조군 각막에서 38%와 대조적으로 평균 91%의 치유를 초래하였다.그리고이 차이는 통계적으로 유의했습니다. 공초점 영상에 의해 가시화된 추가적인 면역조직화학은 이전의 Alizarin 염색 패턴을 반영하여 ZO-1 타이트한 접합 단백질의 반조직화된 발현을 밝혀냈다. EDU 표지는 상처 부위 내 및 주변에서 증식하는 세포의 존재를 확인하였고, 처리되지 않은 대조군에 비해 처리된 각막에서 더 높은 수준으로 보였다.일부 각막쌍에서, CEC 사멸은 상처 부위, 특히 영양 장애 각막에서 보이는 주변부일 수 있다. 다음은 실질적인 말초 세포 사멸을 나타내는 트리판 염색된 각막의 예시적인 이미지이다. 이미지에서 볼 수 있듯이, 말초 세포 사멸은 주로 초기 시점에서 발생하고 배양 기간에 걸쳐 점차적으로 역전된다.이러한 말초 염색은 상처 부위 가장자리의 위치를 확인하는 것이 어려울 수 있으므로 상처에 연결할 때 상처 부위의 정량을 복잡하게 만들 수 있습니다. 그러나, 모든 경우에, 말초 트리판 염색은 최종 14일 시점에서 측정 가능한 이미지를 생성하기에 충분히 제거되었다. 우리는이 현상이 전 생체 내에서 배양 된 각막 기증자에게 독특하며 생체 내에서 인간의 각막과 관련이 없다고 생각합니다.말초 내피의 손상은 DSO의 임상 사례 연구에서보고되지 않았기 때문에 우리의 지식에. 원거리 주변 염색으로 지칭되는 두 번째 염색 패턴이 Alizarin Red 이미지에서 포착되었지만, 배양 기간 전반에 걸쳐 트리판 블루 이미지에서도 명백하였다. 이 관찰은 손상된 내피를 나타내는 사지 주위의 어두운 염색의 고리를 특징으로합니다.이 용어에도 불구하고,이 패턴은 정상 및 영양 장애 각막 모두에서 매우 흔했기 때문에 말초 염색에 대해 양성으로 계산되지 않았습니다. 이 프로토콜을 통해 우리는 Descemet의 스트리핑 후 조작 된 FGF-1로 처리 된 배양 각막에서 향상된 치유 결과를 입증 할 수있었습니다. 또한,이 스트리핑 프로토콜은 DSO를 연구하는 다른 연구자들에게 유용한 방법으로 사용되며 다른 상처 치유 요법 테스트, 수술 기술에 대한 수정 평가, 다양한 기증자 집단 또는 질병 단계에서 치유 비교를 포함한 다양한 응용 분야에 활용 될 수 있습니다.우리는이 연구 및이 프로토콜을 사용하는 다른 연구가 임상의가 미래에 자격을 갖춘 FECD 환자에게 가치있는 치료 옵션으로 DSO를 고려하도록 장려하기를 바랍니다.

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전직에 대 한 프로토콜 vivo 막 기관 문화 모델 부상 치료 연구는 설명 하는 유용한. 이 모델 시스템 재생 치유를 촉진 하는 에이전트 또는 조직된 3D 다세포 환경에서 약물 독성의 효과 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다.

Ex Vivo 막 기관 문화 모델에 대 한 상처 치유 연구

여기서, 돼지 분할 각막 버튼의 제조 및 재배를 위한 단계별 프로토콜이 제시된다. 이 오르가노-전형적으로 재배된 장기 배양 모델은 인간 기증자 각막에 필적하는 15일 이내에 세포 사망률을 나타내므로, 독성 덱젠을 첨가하지 않고 비인간 각막의 장기 재배를 허용하는 첫 번째 모델을 나타낸다.

분할 각막 단추를 사용하여 돼지 각막 내피 내피 기관 문화 모형

여기에서, 우리는 네오디뮴을 사용하여 Descemet의 막 (DM)에서 각막 내피 세포 (CEC)를 분리하는 프로토콜을 제시합니다:YAG (Nd:YAG) 레이저는 bullous 각화증 (BK)를 위한 전 생체 내병 모형으로.

각막 내피 세포 손실의 비 침습적, 레이저 보조 실험 모델의 개발

이 프로토콜은 인간 또는 양 조직의 이식에서 각막 내피 세포 배양을 확립하고 성장하는 데 필요한 중요한 단계를 설명합니다. 각막 내피 세포를 membranous 생체 재료에 소양성하는 방법도 제시된다.

생체 재료 멤브레인에 인간과 양 각막 내피 세포 층의 성장

토끼의 각막 기질 상처 수리를 위한 현장 블루라이트-가교 젤라틴-리보플라빈 하이드로겔의 제조, 농축 및 적용을 위한 재현 가능한 프로토콜이 제시되었으며, 수술 처리, 부분 족근경 및 수술 후 관리를 위한 절차적 단계를 포함합니다.

토끼의 각막 상처 수리를 위한 강화 광가교 젤라틴-리보플라빈 하이드로겔의 제작 및 외과적 적용

학습하세요 인간 각막 배양 모델을 이용한 Descemet's Stripping Only 방법으로, eFGF1을 활용하여 Fuchs Endothelial Corneal Dystrophy 환자의 각막 상피세포 재생 및 가속 치유를 연구하는 기술입니다.

조작된 섬유아세포 성장 인자 1에 의해 자극된 가속화된 치유를 통해서만 Descemet의 스트리핑의 인간 각막 배양 모델

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