Name: 쥐 성상 세포와 미세 아교 세포의 1 차 배양과 근 위축성 측삭 경화증 연구에서의 사용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: 학습하세요 쥐 성상 세포와 미세 아교 세포의 1차 배양 방법을 통해 근위축성 측삭 경화증 연구에서 세포 내 칼슘 신호를 분석하는 기술입니다. 이 프로토콜은 신경염증 질환의 생물물리학적 특성을 연구하는 데 활용됩니다.

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이 작업은 세르비아 공화국 교육 과학 기술 개발부 계약 번호 451-03-9/2021-14/ 200178, FENS - NENS 교육 및 훈련 클러스터 프로젝트 "신경염증의 신경교세포에 대한 삼자 과정" 및 EC H2020 MSCA RISE 보조금 #778405의 지원을 받았습니다. 면역조직화학 이미지를 제공해 주신 Marija Adžić와 Mina Perić, 논문 작성에 도움을 주신 Danijela Bataveljić에게 감사드립니다.

모든 실험은 과학적 목적을위한 동물 보호에 관한 EU 지침과 베오그라드 대학교 생물학 학부 윤리위원회 (승인 번호 EK-BF-2016 / 08)의 허가를 받아 수행되었습니다. 환자 물질 (IgGs에 대한 혈청)에 관해서는 인간을 대상으로 한 실험을 위해 세계 의학 협회 윤리 강령 (헬싱키 선언)에 따라 정보에 입각 한 환자의 동의하에 일상적인 임상 검사를 위해 수집되었습니다. 이 프로토콜은 세르비아 임상 센터의 윤리위원회에서 승인되었습니다 (No. 850/6).
1. 1차 세포 배양 제제
<ol><li>뇌 조직 분리 알림: 얼음처럼 차가운 용액을 사용하여 얼음 위에서 격리를 수행해야 합니다.<ol><li>1차 신생아 세포 배양을 위해 1-3일령의 신생아 새끼를 사용하십시오33. 참고: 여기에 제시된 연구를 위해, Sprague Dawley hSOD1G93A 및 비-형질전환 쥐가 사용되었다. 유전형 분석을 위해, 쥐 꼬리는 나중에 DNA 추출 및 PCR에 사용되었다.</li>
		<li>강아지의 머리에 70 % 에탄올을 뿌리고 즉시 가위를 사용하여 빠르게 참수하십시오.</li>
		<li>두개골을 노출시키기 위해 작은 각도의 가위로 피부를 자릅니다. 구멍 매그넘 에서 궤도쪽으로 절단하여 두개골을 엽니 다. 다음으로 수직 정중선 절단을하십시오. 두개골에서 뇌를 제거하고 인산염 완충 식염수 (PBS)가 들어있는 페트리 접시에 넣으십시오. 알림: 형질 전환 새끼와 비 형질 전환 강아지 사이의 교차 오염을 방지하기 위해 강아지 사이의 도구를 청소하십시오. 뇌의 나머지 부분에서 피질을 분리하는 것은 실체 현미경으로 수행해야합니다.</li>
		<li>집게의 끝을 사용하여 두 반구 사이의 연결을 찢습니다. 그런 다음 반구를 중앙에서 옆으로 부드럽게 밀어 구부러진 집게로 반구를 분리합니다.</li>
		<li>수막을 직선 및 곡선 집게로 조심스럽게 찢어 제거하십시오.</li>
		<li>구부러진 집게로 꼬집어 해마를 제거하십시오. 해마를 폐기하거나 다른 세포 배양 준비에 사용하십시오. 알림: 멸균 상태를 보장하기 위해 층류 후드 아래에서 추가 단계를 수행해야 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>조직 균질화 및 해리<ol><li>하나의 피질을 3mL의 차가운 PBS로 채워진 15mL 튜브로 옮깁니다. 1mL 팁으로 현탁액을 위아래로 피펫팅하여 현탁액이 균질해질 때까지 10-15회 스트로크를 완료합니다. 알림: 이 과정에서 기포가 발생하지 않도록 매우 주의하십시오.</li>
		<li>500 ×g에서 5 분 동안 원 심 분리합니다. 상청액을 제거하고 1mL 팁으로 위아래로 피펫팅하여 3mL의 차가운 PBS에 펠릿을 재현탁합니다. 원심분리 단계를 반복합니다. 알림: 이 시점에서 사용된 모든 용액은 37°C로 예열해야 합니다.</li>
		<li>상청액을 버리고 10% 소 태아 혈청(FBS)과 항생제(페니실린 및 스트렙토마이신)가 보충된 완전한 Dulbecco의 변형 독수리 배지(DMEM) 2mL에 펠릿을 재현탁합니다. 균질액을 2mL 튜브로 옮깁니다.</li>
		<li>균질 액을 21G 및 23G 바늘 (각각 3 회)에 통과시켜 단일 세포의 현탁액을 만듭니다. 알림: 이 과정에서 기포가 발생하지 않도록 매우 주의하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>하나의 피질에서 준비된 세포 현탁액을 60mL의 완전한 DMEM이 들어있는 직경 3mm의 페트리 접시 또는 T25 플라스크 (부착 세포의 성장을 위해 폴리펩티드 코팅으로 전처리 된 표면)에 붓습니다. 현탁액이 균일하게 분포되도록 페트리 접시를 가볍게 흔든다.</li>
	<li>37°C에서 5%CO2/95% 공기의 가습된 분위기에서 배양기에서 세포를 성장시킨다.</li>
	<li>분리 후 48시간 후에 배지를 교체하고 3일마다 배지를 교체하십시오.</li>
	<li>성상 세포 성장을 촉진하려면 세포가 70 % -80 % 컨플루언시에 도달하면 예열 된 PBS로 씻어 느슨하게 부착 된 신경교 세포와 배지에서 FBS의 흔적을 제거합니다.<ol><li>예열 된 트립신 용액 1mL (0.25 % 트립신, PBS에서 0.02 % EDTA, 멸균 여과)를 추가하여 성상 세포의 밑에있는 층을 트립신 화합니다.</li>
		<li>접시를 37 ° C의 인큐베이터에 2-5 분 동안 놓습니다.</li>
		<li>현미경으로 세포를 확인하십시오. 분리되기 시작하면 4mL의 완전한 DMEM을 추가합니다.</li>
		<li>세포 현탁액을 수집하여 15mL 튜브로 옮깁니다. 500 ×g에서 5 분 동안 원 심 분리합니다.</li>
		<li>상청액을 버리고 펠릿을 완전한 배지 1mL에 재현탁합니다. 혈구계를 사용하여 세포를 세십시오.</li>
		<li>세포를 5mL의 새로운 완전한 DMEM에서 104 cells/cm2 의 밀도로 재플레이트합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>3 일마다 매체를 교체하십시오. 다른 신경교 세포 유형의 존재를 최소화하려면 성상 세포가 50 % 합류에 도달 한 후 각 배지를 교체하기 전에 완전한 DMEM으로 세포를 세척하십시오.<ol><li>1mL 피펫으로 상청액 배지를 흡인하고 세포 층에 여러 번 부드럽게 분배합니다. 이 세척 단계에서 세포층의 전체 표면이 덮여 있는지 확인하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>세포가 80 % 합류 (보통 14 일 후)에 도달하면 1.6 단계에서 설명한대로 트립신 화 및 성상 세포 수집을 반복합니다.</li>
	<li>폴리 -L- 라이신 (50 μg / mL)으로 코팅 된 7mm 원형 유리 커버 슬립에 성상 세포 5 × 103 을 시드합니다. 48 시간 후에 실험에 사용하십시오.</li>
	<li>미세아교세포를 촉진시키기 위해, 단계 1.7 후에, 신경교세포가 합류층(34)에 도달하도록 한다. 소교 세포가 성상 세포 층 위에 나타날 때 (10-15 일 후, 더 작고 타원형의 몸체와 더 짧은 과정으로 인식됨) 궤도 셰이커에서 페트리 접시를 220rpm에서 2 시간 동안 흔 듭니다.</li>
	<li>소교세포 분산 및 파종<ol><li>1mL 피펫 팁으로 상층액을 흡인하여 분리되고 느슨하게 부착된 세포를 가볍게 씻고 세포층에 여러 번 부드럽게 분주합니다. 이 세척 단계에서 세포층의 전체 표면을 덮고 분리된 세포로 배지를 수집하여 15mL 튜브로 옮깁니다.</li>
		<li>500 ×g에서 5 분 동안 원 심 분리합니다. 상청액을 버리고 펠릿을 1mL의 배지에 재현탁합니다.</li>
		<li>세포 현탁액을 21 G 바늘에 통과시켜 단일 세포 현탁액을 수득한다. 참고: 대부분의 발표된 방법은 트립신 또는 파파인을 사용하여 조직을 해리합니다. 그러나 21G 바늘은 세포의 과소화를 방지하여 더 부드러운 해리를 허용하는 장점이 있습니다.</li>
		<li>혈구계를 사용하여 세포를 세십시오. poly-L-라이신(50μg/mL)으로 코팅된 7mm 원형 유리 커버슬립에 5 × 103 개의 소교세포를 시드합니다. 48 시간 후에 실험에 사용하십시오. 참고: 희소돌기아교세포 전구체 세포와 성상세포가 실험자의 경험에 따라 여전히 다양한 수로 존재할 수 있기 때문에 흔들어서 순수한 미세아교세포 배양을 얻는 것은 어렵습니다. 신경교 배양물에서 상이한 세포 집단의 존재를 추정하기 위해 사용된 면역세포화학 프로토콜은 다른 곳에서 기술되었다35.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 면역세포화학
<ol><li>커버슬립에 도말된 셀을 PBS로 2 x 1분 동안 헹굽니다.</li>
	<li>실온(RT)에서 20분 동안 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정합니다.</li>
	<li>PBS에서 3 x 5 분 동안 세척하십시오.</li>
	<li>RT에서 10 분 동안 10 % 정상 당나귀 혈청 (NDS) / 1 % 소 혈청 알부민 (BSA) / 0.1 % Triton X-100을 함유 한 차단 용액에서 45 분 동안 배양하십시오.<ol><li>10mm 직경의 커버슬립당 50μL의 블로킹 용액을 추가합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>1차 항체를 1% NDS/1% BSA/0.1% TritonX-100으로 다음 희석하여 준비합니다: 마우스 항-GFAP 1:300, 염소 항-Iba1 1:500. 세포를 1차 항체와 함께 +4°C에서 밤새 배양합니다.</li>
	<li>PBS로 3 x 10분 동안 헹굽니다.</li>
	<li>형광단과 접합된 2차 항체와 함께 인큐베이션한다: 당나귀 항-마우스 (여기 488 nm[1:200)) 또는 당나귀 항-염소 (647 nm[1:200)에서 여기). 어둠 속에서 RT에서 2 시간 동안 세포를 배양하십시오.</li>
	<li>PBS에서 7 x 5 분 동안 세척하십시오.</li>
	<li>세포를 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI, 1:4,000)과 함께 RT에서 10분 동안 배양합니다.</li>
	<li>PBS에서 5 x 5 분 동안 세척하십시오.</li>
	<li>장착 솔루션을 사용하여 현미경 슬라이드에 커버 슬립을 장착합니다. 커버 슬립 당 한 방울을 사용하십시오. 참고: 항체 희석액은 생산자에 따라 다를 수 있습니다. 사용자는 실험을 위한 최적의 희석액을 결정해야 합니다.</li>
</ol>3. 타임랩스 비디오 이미징
알림: 형광 염료가 포함 된 용액은 직사광선으로부터 보호해야합니다. 이미징 실험을 시작하기 전에 관류를 켤 때 유리 커버 슬립이 움직이지 않는지 확인하십시오.
<ol><li>용액 및 세포의 준비<ol><li>이미징을 위한 세포외 용액(ECS)을 준비합니다: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCal2, 2 mMMgCl2, 10 mM D-글루코스, 및 10 mM 헤페스. pH를 7.4로 조정하십시오. 삼투압이 280-300 mOsm / kg인지 확인하고 Ca없이 ECS를 준비하십시오 2+ : 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 10 mM D- 포도당, 10 mM hepes 및 0.1 mM EGTA.</li>
		<li>시험 용액을 준비하십시오 : ECS에 용해 된 100 μM ATP, Ca가없는 ECS에서 1 μM Thg 2+, ECS8에서 0.1 mg / mL ALS IgG.</li>
		<li>커버슬립 하나를 ECS가 있는 접시에 옮겨 전체 DMEM을 씻어냅니다. 1 mM Fluo-4 AM 원액을 ECS로 희석하여 최종 농도인 5 μM Fluo-4AM이 되도록 염료 로딩 용액을 제조한다.<ol><li>어두운 곳에서 RT에서 30분 동안 염료 로딩 용액에 셀이 있는 커버슬립을 놓습니다. ECS에서 세포를 20 분 동안 씻으십시오.</li>
		</ol></li>
		<li>세포가 적절하게 로딩되지 않은 경우(즉, 기본 형광 수준이 노출 시간이 400ms 이상인 카메라 다이내믹 레인지의 5%<너무 낮은 경우) 로딩 시간을 37°C에서 최대 45분에서 1시간으로 늘립니다. 또는 ECS에서 희석하기 전에 DMSO에서 동일한 부피의 20%(w/v) 세제(플루로닉)와 Fluo-4 AM 스톡 용액을 혼합하여 최종 플루로닉 농도를 ~0.02%로 만듭니다. 참고: 본 연구의 실험예는 앞서 기술한바와 같이 ALS 환자의 혈청으로부터 분리된 인간 IgG 4,5,11로 수행하였다. 각 실험은 단일 환자의 IgG 샘플로 수행되었습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>비디오 이미징 참고: 이 프로토콜에서 비디오 이미징 시스템은 크세논 쇼트 아크 램프, 폴리크로메이터 시스템 및 물, 글리세린 및 오일 이멀젼 대물렌즈가 장착된 도립 에피형광 현미경과 결합되었습니다. 타임랩스 이미징은 디지털 카메라 시스템을 사용하여 수행되었습니다.<ol><li>시스템이 작동 온도에 도달할 수 있도록 실험 15분 전에 이미징 설정의 구성 요소를 켭니다.</li>
		<li>커버슬립을 1mL의 작업 용액(ECS 또는 Ca2+가 없는 ECS)과 함께 기록실에 놓습니다.</li>
		<li>올바른 이미징 프로토콜을 선택하려면 이미징 소프트웨어를 열고 수집 패널에서 여기 파장이 480nm, 다이크로익 미러가 505nm, 방출 파장이 535nm인 Fluo4-AM의 필터 쌍을 선택합니다.</li>
		<li>실험 전반에 걸쳐 일관된 수의 세포를 갖도록 주의하면서 시야를 선택합니다. 신호가 포화되지 않도록 노출 시간과 감지기 게인을 적절하게 조정하십시오. 획득을 위한 의사 색상 모드를 선택합니다. 자세한 지침은 제조업체에서 제공한 설명서를 참조하십시오.</li>
		<li>샘플링 속도를 1Hz(초당 1프레임)로 조정합니다.</li>
		<li>기준선 결정을 위해 3-5분 동안 기저 수준의 형광을 획득함으로써 이미징을 시작한다(F0). 작업 솔루션의 일정한 흐름을 보장하십시오.</li>
		<li>작업 용액의 흐름을 중지하고 원하는 시간 동안 테스트 용액으로 전환하십시오 (그림 2 및 그림 3의 예에서 시간 막대 참조). 각 시험 용액 사이에서 3-5 분 동안 작업 용액의 일정한 흐름으로 세포를 씻으십시오.</li>
		<li>용액 상단에서 일정한 흡입을 배열하여 기록 챔버의 용액 부피를 ~1mL로 유지합니다( 그림 2E 참조). 참고: 이미징된 세포에 직접 처리를 적용하기 위해 유리 피펫(내경 0.8mm)으로 만든 맞춤형 전달 시스템을 핀치 밸브 및 전자 밸브 컨트롤러가 포함된 용액 교환 시스템과 결합된 45° 각도로 ~350μm 떨어진 ~1mm 떨어진 곳에 배치했습니다( 그림 2E 참조).</li>
	</ol></li>
</ol>4. 데이터 분석
<ol><li>개별 셀에 해당하는 관심 영역(ROI)을 정의합니다.<ol><li>신호 강도가 가장 높은 프레임을 선택하고(즉, ATP 적용에서) 응용 프로그램 다각형 도구를 사용하여 하나의 셀을 둘러쌉니다. 획득한 필드의 모든 셀에 대해 반복합니다. 서클 도구를 사용하여 백그라운드에서 5개의 ROI를 선택합니다.</li>
		<li>단일 셀의 평균 신호 강도와 각 시간 프레임의 배경을 측정하려면 모든 ROI를 선택하고 ImageJ의 ROI Manager에서 다중 측정 명령을 사용하거나 상용 소프트웨어에서 동등한 명령을 사용합니다(재료 표 참조).</li>
	</ol></li>
	<li>ROI의 평균 신호 강도 값을 스프레드시트로 내보냅니다.</li>
	<li>5개의 배경 ROI를 평균하고 동시에 획득한 프레임의 평균 ROI 강도에서 각 프레임의 평균 배경을 뺍니다.</li>
	<li>획득된 데이터를 기준선 신호로 정규화하려면 방정식 (1)을 사용하십시오. ΔF / F 0 = (F- F 0) / F0 (1) 여기서, F는 배경 감산 후의 각 시간 프레임의 신호 강도이고,F0 는 기준선 Fluo-4 형광이다. 참고: 이 연구에서는 맞춤형 코드가 사용되었습니다.</li>
	<li>칼슘 활성을 분석하려면 칼슘 피크의 진폭 (ΔF / F 0), 칼슘 과도 (ΔF / F 0 × s)의 통합 변화 (시간 적분, 반응 기록 아래 표면), 자극 시작에서 최대 칼슘 과도 (s)까지의 피크 경과 시간, 자극 시작에서 ΔF / F 0 값까지 경과 된 상승 시간 최대 진폭 (S)의 50 % -80 %, 절반 최대 진폭 (S)에서 과도 현상의 절반 너비 전체 너비, 반복적 인 경우 응답 주파수 (Hz)에 도달합니다.</li>
</ol>

저자는 선언 할 이해 상충이 없습니다.

이 논문은 쥐 hSOD1G93A 모델에서 ALS와 같은 세포(patho)생리학의 다양한 측면을 연구하기 위한 빠르고 "예산에 맞는" 도구로서 일차 세포 배양 방법을 제시합니다. 따라서이 기술은 더 높은 수준의 조직 (즉, 조직 조각 또는 살아있는 동물)에서 외삽되고 추가로 조사 될 수있는 단일 세포 수준의 연구에 적합합니다. 그러나 기술로서의 세포 배양에는 몇 가지 주의 사항이 있습니다. 얼음 위에서 뇌 조직 분리 및 세포 해리를 수행하고 가능한 한 최단 시간에 이러한 단계와 후속 분리 및 준비 단계를 수행하는 것이 가장 중요합니다. 오염은 잘 멸균된 장비를 사용하고 층류 후드(37)에서 조직 해리를 수행하는데 특히 주의를 기울임으로써 극복될 수 있는 항상 존재하는 장애물이다. 세포의 정확한 밀도를 심는 것도 중요합니다. 파종된 세포의 수가 원하는 수보다 적으면 접시에서 세포 성장 및 번식을 지원하지 않습니다. 그러나 세포가 너무 조밀하면 성장 배지의 영양소에 대한 ...

세포 배양 기술은 건강 및 질병 분야의 다양한 세포 신경 생리학 분야에서 수많은 발전을 가져 왔습니다. 특히, 실험실 동물의 신경 조직에서 갓 분리 된 1 차 세포 배양을 통해 실험자는 다양한 생화학 적 배지 및 생리 학적 설정에서 다양한 세포의 행동을 면밀히 연구 할 수 있습니다. Ca2+ 민감성 염료와 같은 다양한 형광 생리학적 지표를 타임랩스 비디오 현미경과 함께 사용하면 실시간으로 세포 생물물리학 및 생화학적 과정에 대한 더 나은 통찰력을 얻을 수 있습니다.
ALS는 상부 및 하부 운동 뉴런에 영향을 미치는 치명적인 신경 퇴행성 질환입니다1. 이 질병은 가족 유형의 복잡한 발병 기전을 가지고 있지만 대부분 산발적 인 형태 (사례의 90 %)2. 비세포 자율 메커니즘이 ALS 병태생리학에 기여한다는 것은 잘 알려져 있으며, 이는 주로 신경교 세포의 필수적인 역할 때문입니다3. ALS는 또한 염증의 체액 성 및 세포 성 요인의 침범과 함께 신경 염증성 질환으로 잘 특성화됩니다.
면역 글로불린 G는 ALS 및 기타 신경 퇴행성 질환에서 분자 마커로 널리 사용됩니다. 이 마커의 혈청 수준을 연구하면 질병 4,5,6에서 신경 염증의 존재와 단계를 나타낼 수 있지만 뇌척수액에 존재하면 혈액 뇌 장벽7의 위반을 나타낼 수 있습니다. IgGs는 또한 ALS 환자7의 척수 운동 뉴런에서 침착 된 것으로 확인되었습니다. 그럼에도 불구하고,이 접근법은 IgGs 수준과 질병의 단계 및 특성의 상관 관계에서 약간의 불일치를 보여 주었다6.
ALS 환자의 혈청에서 분리 된 IgG (ALS IgG)는 나이브 성상 세포8에서 칼슘 반응을 유도하고 뉴런에서 글루타메이트 방출을 유도 할 수 있으며, 이는 ALS 병리학9의 특징 인 흥분 독성 효과를 가리킨다. 그러나, hSOD1G93A ALS 래트 모델 (인간 SOD1 돌연변이 10의 다중 카피 함유)에 대한 연구는 배양된 신경교세포 11, 조직 12,13,14, 또는 살아있는 동물13에서 산화 스트레스의 다수의 마커를 보여주었다. ALS 래트 모델로부터 배양된 성상교세포가 비-형질전환 동료로부터의 성상아교세포보다 과산화물에 의해 유도된 산화 스트레스에 더 취약하다는 것은 주목할 만하다1.
배양 물의 소교 세포는 덜 명백한 방식으로 ALS IgG의 영향을받습니다. 즉, BV-2 소교세포 세포주는 단지 4/11 ALS IgG 환자 샘플15의 적용에 반응하여 산화 스트레스의 형광 마커로부터의 신호의 상승을 나타냈다. 미세아교세포는 많은 신경염증성 병리에 참여하여 ALS16,17의 비세포 자율 메커니즘에서 산화 스트레스와 후기 진행 단계를 추가하는 것으로 잘 알려져 있습니다. 그럼에도 불구하고, ALS IgGs를 사용한 데이터는 이들 세포가 ALS 염증의 이러한 체액성 인자에 대해 성상세포만큼 반응적이지 않을 수 있음을 나타내었다. ALS 쥐 모델의 1 차 성상 세포에 대한 여러 연구가 새끼뿐만 아니라 증상이있는 동물, 뇌 또는 척수18,19,20,21에서 수행되었습니다. 이것은 소교 세포 1 차 배양에도 해당되지만, 성상 세포보다 적고 대부분 배아 단계22,23,24의 뇌 영역에서 발생합니다.
우리는 주로 흥분 독성의 생리적 마커로서이 이온의 세포 내 과도 현상을 따르는 수단으로 배양 된 세포에 대한Ca2+의 타임 랩스 비디오 이미징을 사용합니다. 따라서 이러한 과도 현상 (진폭, 과도 상태에서의 영역, 상승 시간, 주파수)의 생물 물리학 적 특성화를 통해 연구원은 신경 퇴행의 다양한 세포 모델에서 실험적 진단 매개 변수를 얻을 수 있습니다. 따라서이 기술은 질병 바이오 마커로서 IgGs의 정량적 생리 학적 평가의 이점을 제공합니다. ALS의 유도에서 IgGs 및Ca2+의 역할에 관한 많은 문헌이 있다. 이들 연구의 대부분은 환자 IgG를 실험 동물25,26,27,28,29에 주입하여 ALS를 유도함으로써 수행되었으며, 이어서 세포 내Ca2+ 상승 및 IgG 침착을 나타내었다. 일련의 연구는 시험관 내 운동 시냅스에 대한 ALS IgG의 효과를 조사했습니다. 30,31,32. 위의 맥락에서 여기에 제시된 기술은 ALS의 비 세포 자율 메커니즘에서 중요한 역할을하는 신경교 세포에 초점을 맞추고 신경 염증의 체액 성 요인으로서 IgG에 대한 잠재적 인 흥분 독성 반응을 정량화합니다. 이 접근법은 다른 세포 배양 시스템 및 일반적인 염증의 세포 모델에서 전체 혈청, CSF 또는 사이토 카인과 같은 다른 체액 성 인자를 테스트하는 데 더 광범위하게 적용될 수 있습니다.
이 논문은 Sprague Dawley 쥐의 피질에서 신경교 세포, 성상 세포 및 미세 아교 세포의 1 차 배양을 준비하는 방법과 이러한 세포를 추가로 사용하여 환자 혈청 유래 IgG로 ALS 병태 생리학을 연구하는 방법을 설명합니다. 프로토콜은 배양된 세포의 염료 로딩(그림 1) 및 타임랩스 비디오 이미징 실험에서 Ca2+ 변화의 기록에 대해 자세히 설명되어 있습니다. 비디오 녹화의 예는 신경교 세포가 ATP와 비교하여 ALS IgG에 어떻게 반응하는지 보여줄 것이며, 후자는 퓨린성 막 수용체를 활성화합니다. hSOD1G93A ALS 래트 뇌로부터 분리된 성상세포가 비-형질전환 대조군과 비교하여 ALS IgG에 대해 더 뚜렷한Ca 2 + 반응과 어떻게 반응하는지, 그리고 이 과정을Ca2+ 저장 작업의 차이와 연관시키는 방법에 대한 예가 처음으로 도시되었다. 또한 ALS IgG로 심각하게 도전받는 소교 세포에서 칼슘 이미징의 예가 나와 있으며 세포 내 칼슘의 반응은 미미합니다.

<table><tbody><tr><td>15mL 튜브</td><td>Sarstedt, 독일</td><td>62 554 502</td><td></td></tr><tr><td>2mL 튜브</td><td>Sarstedt, 독일</td><td>72.691</td><td></td></tr><tr><td>21G 바늘</td><td>Nipro, 일본</td><td>HN-2138-ET</td><td></td></tr><tr><td>23G 바늘</td><td>Nipro, 일본</td><td>HN-2338-ET</td><td></td></tr><tr><td>5mL 주사기</td><td>Nipro, 일본</td><td>SY3-5SC-EC</td><td></td></tr><tr><td>6mm 원형 유리 커버 슬립</td><td>Menzel Glasser, 독일</td><td>630-2113</td><td></td></tr><tr><td>60mm 페트리 접시</td><td>ThermoFisher Sientific, 미국</td><td>130181</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich, 독일</td><td>A9062</td><td></td></tr><tr><td>AxioObserver A1</td><td>Carl Zeiss, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Sigma-Aldrich, 독일</td><td>B6917</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>Sigma-Aldrich, 독일</td><td>2110</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Eppendorf, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich, 독일</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma-Aldrich, 독일</td><td>158968</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich, 독일</td><td>D5648</td><td></td></tr><tr><td>당나귀-안티 염소 AlexaFluor 647 IgG 항체</td><td>Invitrogen, 미국</td><td>A-21447</td><td></td></tr><tr><td>당나귀-안티 마우스 AlexaFluor 488 IgG 항체</td><td>Invitrogen, 미국</td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich, 독일</td><td>EDS-100G</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich, 독일</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>" evolve"-EM 512 디지털 카메라 시스템</td><td>광량, 미국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청(FBS)</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific, 미국</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Fiji ImageJ Software</td><td>GNU General Public License</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FITC 필터 세트에</td> 따른 오픈 소스 <td>Chroma Technology Inc., 미국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Molecular Probes, 미국</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 IBA1</td><td>Fujifilm Wako Chemicals, 미국</td><td>011-27991</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Biowest, 프랑스</td><td>P5455</td><td></td></tr><tr><td>고속 솔루션 교환 시스템</td><td>ALA Scientific Instruments, 미국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>Memmert GmbH + Co. KG, 독일</td><td></td><td></td></tr> 염화 <tr><td>마그네슘</td><td>Sigma-Aldrich, 독일</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Matlab 소프트웨어</td><td>Math Works, 미국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마우스 anti-GFAP</td><td>Merck Millipore, 미국</td><td>MAB360</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 40-88</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>324590</td><td></td></tr><tr><td>Normal 당나귀 혈청</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin and 스트렙토마이신</td><td>ThermoFisher Sientific, 미국</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>폴리-L-라이신</td><td>Sigma-Aldrich, 독일</td><td>P5899</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>Sigma-Aldrich, 독일</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>인산이수소</td>칼륨 <td>Carlo Erba 시약, 스페인</td><td>471686</td><td></td></tr><tr><td>Shaker DELFIA PlateShake</td><td>PerkinElmer Life Sciencies, 미국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>Sigma-Aldrich, 독일</td><td>S3817</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Sigma-Aldrich, 독일</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성 헵타하이드레이트</td><td>Carl ROTH GmbH</td><td>X987.2</td><td></td></tr><tr><td>피루브산나트륨</td><td>Sigma-Aldrich, 독일</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>Thapsigargine</td><td>Tocris Bioscience, UK</td><td>1138</td><td></td></tr><tr><td>Triton X - 100</td><td>Sigma-Aldrich, 독일</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma-Aldrich, 독일</td><td>T4799</td><td></td></tr><tr><td>Vapro 증기압 삼투압계 5520</td><td>Wescor, ELITechGroup Inc., 미국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ViiFluor 이미징 시스템</td><td>Visitron System Gmbh, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VisiChrome Polychromator 시스템</td><td>Visitron System Gmbh, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VisiView 고성능 설정</td><td>Visitron System Gmbh, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xenon Short Arc lamp</td><td>Ushio, 일본</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

쥐 성상 세포와 미세 아교 세포의 1 차 배양과 근 위축성 측삭 경화증 연구에서의 사용

Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis

이 프로토콜은 Sprague Dawley 쥐의 피질에서 신경교 세포, 성상 세포 및 미세 아교 세포의 1 차 배양을 준비하는 방법과 쥐 hSOD1G93A 모델에서 근 위축성 측삭 경화증 (ALS)의 병태 생리학을 연구 할 목적으로 이러한 세포를 사용하는 방법을 보여줍니다. 먼저, 프로토콜은 출생 후 쥐 피질에서 성상 세포와 미세 아교 세포를 분리 및 배양하는 방법을 보여 주며, 성상 세포의 신경교 섬유 산성 단백질 (GFAP) 마커와 이온화 칼슘 결합 어댑터 분자 1 (Iba1) 소교 세포 마커를 사용하여 면역 세포 화학에 의해 이러한 배양의 순도를 특성화하고 테스트하는 방법을 보여줍니다. 다음 단계에서는 배양 된 세포의 염료 로딩 (칼슘 민감성 Fluo 4-AM) 및 살아있는 세포에 대한 비디오 이미징 실험에서 Ca2+ 변화의 기록에 대한 방법을 설명합니다.
비디오 녹화의 예는 다음으로 구성됩니다 : (1) ALS 환자로부터 분리 된 면역 글로불린 G (IgG)에 급성으로 노출 된 배양 된 성상 세포의Ca 2+ 이미징 사례는 동일한 실험에서 입증 된 바와 같이 ATP에 대한 반응과 비교하여 특징적이고 특이적인 반응을 나타낸다. 예는 또한 비 형질 전환 대조군과 비교하여 hSOD1G93A 성상 세포에서 ALS IgG에 의해 유발되는 세포 내 칼슘 농도의 더 뚜렷한 일시적인 상승을 보여줍니다. (2) 소포체Ca2+ ATPase의 비경쟁적 억제제인 타프시가르긴(Thg)에 의한 칼슘 저장고갈 동안 배양된 성상세포의Ca2+ 이미징, 이어서 기록 용액에 칼슘을 첨가하여 유도된 저장 작동식 칼슘 진입, 이는 hSOD1G93A 및 비-형질전환 성상세포에서의Ca 2+ 저장 작업 간의 차이를 입증함; (3) 배양된 미세아교세포의 Ca2+ 영상화는 주로 ALS IgG에 대한 반응의 결여를 나타내는 반면, ATP 적용은Ca2+ 변화를 유도하였다. 이 논문은 또한 Ca2+ 염료 및 염료 로딩 기술의 올바른 농도를 선택하여 중요한 세포 밀도 및 배양 순도와 관련하여 가능한 주의 사항 및 주의 사항을 강조합니다.

배양에서 다양한 신경교 세포 유형의 특성 분석 실험을 위해 성상 세포를 생산하는 데 보통 15-21 일이 걸리는 반면, 소교 세포는 자라는 데 10-15 일이 걸립니다. 배양물의 세포 순도를 평가하기 위해 면역염색을 수행하였다. 도 1 은 각각의 배양물에서 성상세포 마커 GFAP 및 미세아교세포 마커 Iba1의 이중 표지의 발현을 나타낸 것이다.
칼슘 영상은 건강한 성상 세포와 병든 성상 세포의 세포 생리학의 차이를 드러내는 것으로 알려져 있습니다. 이전에 야생형 성상 세포에서 ALS IgG가 세포 내 및 세포 외 풀을 세포질8로 동원하여 세포 Ca에 영향을 미친다는 것을 입증했습니다 2+. 다음 프로토콜은 hSOD1G93A의 칼슘 과도 상태와 환자의 ALS IgG 샘플에 급성으로 노출 된 비 형질 전환 배양 ...

우리는 hSOD1G93A 쥐 모델에서 근 위축성 측삭 경화증의 병태 생리학에 대한 연구를 위해 세포 내Ca 2+의 타임 랩스 비디오 이미징을 위해 쥐 피질에서 신경교 세포, 성상 세포 및 미세 아교 세포의 1 차 배양을 준비하는 방법에 대한 프로토콜을 제시합니다.

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to ...

이 프로토콜을 사용하면 질병뿐만 아니라 건강에서도 각 세포 유형 반응을 특징 짓는 세포 간 칼슘 신호 패턴을 밝힐 수 있습니다. 이 기술은 복잡한 세포 행동의 빠르고 상세한 생물 물리학 적 특성을 가능하게합니다. 우리는 이 IgG 유도 칼슘 신호 전달을 신경염증 질환의 개인화된 의학을 위한 지문으로 사용할 계획입니다.실제 환경에서는 모든 과정과 사건, 특히 현미경으로 일어나는 사건을보고 따라가는 것이 쉽지 않습니다. 따라서 시각적 데이터가 중요합니다. 생후 1-3 일 된 새끼를 참수 한 후 작은 각진 가위로 피부를 잘라 두개골을 노출시킵니다.그런 다음 궤도를 향해 구멍 매그넘을 절단하여 두개골을 열고 수직 정중선 절단을합니다. 두개골에서 뇌를 제거하고 PBS가 들어있는 페트리 접시에 넣으십시오. 집게의 끝을 사용하여 두 반구 사이의 연결을 찢고 반구를 중앙에서 옆으로 부드럽게 밀어 구부러진 집게로 반구를 분리합니다.직선 및 곡선 집게를 사용하여 수막을 조심스럽게 찢어 제거합니다. 그런 다음 구부러진 집게로 꼬집어 해마를 제거하고 버리거나 다른 세포 배양 준비에 사용하십시오. 다음으로, 피질을 3 밀리리터의 차가운 PBS가 들어있는 15 밀리리터 튜브로 옮기고 1 밀리리터 팁으로 10-15 회 위아래로 피펫팅하여 조직을 균질화합니다.세포를 500g에서 5 분 동안 원심 분리합니다. 상청액을 버리고 1밀리리터 팁으로 피펫팅하여 3밀리리터의 차가운 PBS에 펠릿을 재현탁합니다. 다시 한 번 원심분리하고 10%FBS와 항생제가 보충된 완전한 DMEM 2ml에 펠릿을 재현탁합니다.균질 액을 2 밀리리터 튜브로 옮긴 후, 균질 액을 21 및 23 게이지 바늘에 통과시켜 단일 세포의 현탁액을 만듭니다. 하나의 피질에서 준비된 세포 현탁액을 3 밀리리터의 완전한 DMEM이 들어있는 60 밀리미터의 페트리 접시에 붓고 페트리 접시를 가볍게 흔들어 현탁액이 균일하게 분포되도록합니다. 섭씨 37도에서 5 % 이산화탄소와 95 % 공기가있는 가습 인큐베이터에서 세포를 배양합니다.성상 세포 성장을 촉진하려면 오래된 배지를 제거하고 예열 된 PBS로 세포를 세척하여 느슨하게 부착 된 신경교 세포와 FBS의 흔적을 제거하면 70-80 % confluency에 도달합니다. 그런 다음 예열 된 트립신 용액 1 밀리리터를 추가하여 성상 세포의 밑에있는 층을 트립신 화하고 섭씨 37도에서 2-5 분 동안 배양합니다. 현미경을 사용하여 세포가 분리되기 시작하는지 확인하고 4밀리리터의 완전한 DMEM을 추가합니다.세포 현탁액을 모아서 15 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 튜브를 500g에서 5 분 동안 원심 분리하십시오. 상청액을 버리고 펠릿을 완전한 배지 1ml에 재현탁합니다.혈구계를 사용하여 세포를 세십시오. 다음으로, 배양 접시를 준비하고 배양 배지를 첨가한다. 세포를 5밀리리터의 새로운 완전한 DMEM에서 평방 센티미터당 10 내지 제4 세포의 밀도로 재플레이트하고, 각각의 배지 교체 전에 완전한 DMEM으로 세포를 세척한다.70 내지 80% confluency에 도달한 후, 트립신 화를 반복하고, 7 밀리미터의 폴리-L-라이신-코팅된 원형 유리 커버 슬립에 제3 성상세포를 10회 5회 시드한다. 10분 동안 부착하고 완전한 DMEM을 추가합니다. 48 시간 후에 실험에 사용하십시오.소교세포 배양을 준비한 후 미세아교세포를 촉진하기 위해 신경교세포가 합류하도록 하고 10-15일 후에 미세아교세포가 성상교세포 층 위에 나타납니다. 오비탈 셰이커에서 페트리 접시를 220RPM에서 2시간 동안 흔듭니다. 이제 1 밀리리터 피펫 팁으로 상청액을 흡인하여 분리되고 느슨하게 부착 된 세포를 가볍게 씻으십시오.상청액을 세포 층에 여러 번 부드럽게 분배하여 이 세척 단계 동안 전체 세포층 표면을 덮도록 합니다. 분리 된 세포가있는 배지를 수집하여 15 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 원심분리하고, 재현탁하고, 앞에서 설명한 대로 세포를 계수합니다.3차 미세아교세포에 10번 5번 시드하여 7-밀리미터의 폴리L-라이신이 코팅된 원형 유리 커버 슬립. 10분 동안 부착하고 완전한 DMEM을 추가합니다. 48 시간 후에 실험에 사용하십시오.전체 DMEM을 씻어 내려면 하나의 커버 슬립을 세포 외 용액이 담긴 접시에 옮깁니다. 5 마이크로 몰의 최종 농도를 달성하기 위해 1 밀리몰 Fluo-4 AM을 세포 외 용액으로 희석하여 염료 로딩 용액을 준비하십시오. 세포와 함께 커버 슬립을 어두운 곳에서 실온에서 30분 동안 염색 로딩 용액에 넣고, 세포를 세포외 용액으로 20분 동안 세척한다.커버 슬립을 1 밀리리터의 작업 용액으로 기록실에 놓습니다. 실험 전체에서 일관된 수의 셀을 갖는 시야를 선택합니다. 이미징을 시작하고 3-5분 동안 형광의 기본 수준을 획득하여 기준선을 결정합니다.그런 다음 작업 용액의 흐름을 중지하고 원하는 시간 동안 테스트 용액으로 전환하십시오. 각 시험 용액 사이에서 3 분에서 5 분 동안 일정한 작업 용액의 흐름으로 세포를 씻으십시오. 용액 상단에서 일정한 흡입을 배열하여 기록 챔버의 용액 부피를 1 밀리리터로 유지하십시오.신호 강도가 가장 높은 프레임을 선택하고 Polygonal 도구 응용 프로그램을 사용하여 하나의 셀을 둘러쌉니다. 획득한 필드의 모든 셀을 둘러싼 후 원 도구를 사용하여 배경에서 관심 영역 5개를 선택합니다. 그런 다음 단일 셀의 평균 신호 강도와 각 시간대의 배경을 측정합니다.관심 있는 모든 영역을 선택하고 ImageJ의 ROI 관리자에서 다중 측정 명령을 사용하거나 상용 소프트웨어에서 이와 동등한 명령을 사용합니다. MATLAB 소프트웨어에서 데이터를 가져온 후 5개의 배경 ROI를 평균하고 동시에 획득한 프레임의 평균 ROI 강도에서 각 프레임의 평균 배경을 뺍니다. 나중에 칼슘 피크의 진폭, 과도 칼슘의 통합 변화, 피크까지의 시간, 상승 시간, 반폭 및 주파수를 결정하여 칼슘 활성을 분석합니다.GFAP는 성상 세포를 시각화하고 Iba1을 시각화하여 미세 아교 세포를 시각화하는 데 사용됩니다. hSOD1G93A 성상 세포는 ALS 면역 글로불린 G에 반응하여 칼슘 과도 현상의 진폭이 더 크고, 전체적으로 더 상당한 통합 변화가 있으며, 비 형질 전환 성상 세포보다 피크까지의 시간이 짧습니다. ALS 면역 글로불린 G에 대한 반응은 ATP에 대한 반응과 구별 될 수 있습니다.hSOD1G93A 성상 세포는 저장 고갈에 의해 밝혀진 바와 같이 저장소에서 더 높은 수준의 칼슘 이온을 가졌으며,이 이온의 과부하를 나타냅니다. 미세아교세포를 배양하고, 시간 경과에 따른 평균 형광 강도를 추출하였다. 3 개의 세포의 칼슘 흔적은 하나의 세포 만이 ALS 면역 글로불린 G에 반응하는 반면 모든 세포는 ATP에 반응한다는 것을 나타 냈습니다.의사 컬러 이미지는 ALS, IgG 및 ATP에 대한 반응의 형광 강도 및 기준선을 나타냅니다. 세포는 적절하게 로드되어야 하고 이미징 시스템의 매개변수는 실험 중에 신호가 분리되지 않도록 적절하게 조정되어야 합니다. 칼슘 방출과 함께 패치 클램핑을 수행할 수 있습니다.따라서, 상이한 막 이온 전류와 칼슘 방출 사이의 상관 관계에 대한보다 완전한 그림이 얻어 질 수있다. 세포 내 칼슘 항상성에 대한 이해는 스트레스가 많은 외부 자극뿐만 아니라 자연적 자극에 대한 여러 반응을 탐구하는 데 필수적입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

여기서 우리는 glial 피더 층의 존재에 culturing 쥐 대뇌 피질의 뉴런에 대한 프로토콜을 제공합니다. 교양 뉴런은 극성을 설정하고 시냅스를 만들고, 이러한 전기 생리학, 칼슘 이미징, 세포 생존 assays, immunocytochemistry, 그리고 RNA / DNA / 단백질 분리 등 다양한 어플 리케이션에 사용하기 위해 glia에서 분리 수 있습니다.

차 쥐 두피 뉴런과 Glia의 Bilaminar의 공동 문화

두뇌의 세포 이질에서 기본 microglia를 분리하는 것은 생리적 및 병리 학적 조건에 모두 자신의 역할을 조사하는 것이 필수적이다. 이 프로토콜은 기계적인 고립과 높은 수율과 높은 순도를 제공 혼합 세포 배양 기술에 대한 실용적 기본 microglial 세포에 대해...

신생아 쥐 뇌 조직의 혼합 Glial 세포 배양의 기본 Microglia 격리

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쥐 새끼 뇌에서 성상세포의 1차 배양 생성

이 비디오는 쥐의 뇌에서 미세아교세포를 분리하고 배양하는 방법을 보여줍니다. 그것은 미세아교세포에 특이적인 단클론 항체로 코팅된 플레이트를 사용하여 다른 신경 세포와 비신경 세포에서 미세아교세포를 분리하는 것을 수반합니다.

Isolation and Culture of Microglia from Rat Brains using Serum-Free 배지를 이용한 쥐 뇌로부터의 미세아교세포(Microglia)

Astrocytes 정상 뇌 개발 및 기능, 및 중앙 신경계 수리를 위해 필수적인 기초 생물학적 과정에 참여하는 다양한 세포로 인정되었습니다. 여기 중추 신경계 세포의 주요 클래스의 생물학을 연구하는 순수 마우스 astrocyte 문화를 얻기 위해 빠른 절차를 제시한다.

마우스 두피 Astrocytes의 분리와 문화

플록스, 조건부 발암성 대립유전자로 조작되고 바이러스 Cre 매개 재조합을 통해 형질전환된 마우스에서 채취한 표현형 야생형 성상세포와 신경 줄기세포는 syngeneic, immune-competent littermate의 뇌에 형질전환된 세포의 orthotopic 주입에 의해 in vitro 및 in vivo에서 성상세포종 발병기전을 모델링하는 데 사용할 수 있습니다.

모델링 성상 세포종 병인 체외와 생체 대뇌 피질의 성상이나 조건, 유전자 조작 쥐에서 신경 줄기 세포를 사용하여

신경 병성 통증의 개발 척수 신경교 세포의 병리학 적 변화를 수반한다. 시험관 내에서 이들 세포를 공부 성인 척수 조직으로부터 유래 설계된 신뢰성 신경교 배양 시스템이 부족하다. 따라서, 우리는 성인 마우스 척수 조직에서 차 혼합 된 아교 문화를 설정하는 방법을 여기에 표시됩니다.

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여기에 설명 된 AWESAM 프로토콜은 빠르고, 단순 하 고 저렴 한 방식으로 다른 뇌 세포 분리에서 murine 이다 경작에 최적입니다. AWESAM 이다 자발적인 캘리포니아2 + 신호, 형태학, 및 유전자 식 프로필 이다에서 vivo에서유사한 전시.

Vivo에서경작-Murine 이다 빠르고, 간단 하 고 저렴 한 AWESAM 프로토콜을 사용 하 여 같은

세부 사항에 microglial 함수를 이해 하는 노력 microglia 성숙한 vivo에서 속성 정리 microglial 문화 모델의 부족에 의해 방해 되어 있다. 이 프로토콜 정의 매체 조건 하에서 높은 없는 성숙한 쥐 microglia의 강력한 생존을 유지 하기 위해 설계 된 절연과 문화 접근을 설명 합니다.

절연 및 동적 홍보 설치류 Microglia의 문화 Ramified 혈 청 자유로운 매체에 있는 외관

우리는 척수 인간 유도 만능 유래 성상 세포와 뉴런을 구별하는 방법과 전기 생리 학적 기록을위한 이들의 공동 배양을 설명합니다.

지역별 인간 만능줄기세포 유래 성상세포 및 뉴런을 이용한 ALS 모델링을 위한 전기생리학적 플랫폼 구축

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Isolation of Pure Astrocytes and Microglia from the Adult Mouse Spinal Cord For In Vitro Assays and Transcriptomic Studies( 체외 분석 및 전사체 연구를 위한 성인 마우스 척수에서 순수 성상교세포 및 미세아교세포의 분리)

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쥐 성상 세포와 미세 아교 세포의 1 차 배양과 근 위축성 측삭 경화증 연구에서의 사용

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