Name: 직렬 섹션 전자 현미경을 사용하여 간세포에서 소기관 간 접촉 부위의 입체 특성화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: 학습하세요 직렬 섹션 전자 현미경을 사용하여 간세포에서 소기관 간 막 접촉 부위의 3D 입체 구조를 재구성하는 방법을. 이 기법은 세포 소기관 상호작용과 형태학 연구에 활용됩니다.

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전문적인 기술 지원을 위해 Joanna Hanley, Rebecca Fiadeiro 및 Ania Straatman-Iwanowska에게 감사드립니다. 또한 Stefan 연구실 멤버들과 Ian J. White에게 도움이 되는 토론에 감사드립니다. J.J.B.는 UCL의 MRC 분자 세포 생물학 연구소에 MRC 기금을 지원하여 코드 MC_U12266B을 수여합니다. C.J.S.는 UCL의 분자 세포 생물학 대학 단위의 MRC 실험실에 MRC 기금으로 지원되며, 코드 MC_UU_00012/6을 수여합니다. P.G.는 유럽 연구위원회 (European Research Council)의 보조금 코드 ERC-2013-StG-337057이 자금을 지원합니다.

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

소기관 구조 및 상호작용을 3D로 시각화하기 위한 접근 가능한 vEM 기술이 이 프로토콜에 설명되어 있습니다. 간세포에서 소기관 간 접촉의 형태학은 여기에서 사례 연구로 제시됩니다. 그러나, 이러한 접근법은 또한 말초 신경에서의 슈완 세포-내피 상호작용(45), 내피 세포에서의 바이벨 팔레이드 바디 생물발생(46), 신장 세포에서의 화물 분비(47), 및 해마 뉴런(48)에서의 시냅스 형태학을 포함하는 다양한 다른 샘플 및 연구 영역을 조사하기 위해 적용되었다. . 간 생물학을 더 잘 이해하기 위해, 이 접근법은 2D 세포 배양물, 3D 간 오가노이드 모델 시스템(49) 및 간 조직에서 간세포 형태학을 조사하는데 사용될 수 있다. 이 견고하고 유연한 접근 방식은 기존의 120kV 투과 전자 현미경 및 초미세 경합금에 ...

1930 년대에 발명 된 이래로 전자 현미경을 통해 연구자들은 세포와 조직의 구조적 구성 요소 1,2를 시각화 할 수있었습니다. 대부분의 조사는 3D 모델을 구축하기 위해 힘든 직렬 섹션 수집, 수동 사진, 네거티브 처리, 수동 추적 및 유리, 플라스틱 또는 스티로폼 3,4 시트에서 3D 모델의 생성 및 조립이 필요하기 때문에 2D 정보를 제공했습니다. 거의 70년이 지난 지금, 현미경 성능, 직렬 섹션 수집, 자동화된 디지털 이미징, 3D 재구성, 시각화 및 분석을 위한 정교한 소프트웨어 및 하드웨어에서부터 현재 총칭되는 볼륨 EM(vEM)에 대한 대안적인 접근법에 이르기까지 프로세스의 다양한 측면에서 상당한 발전이 있었습니다. 이러한 vEM 기술은 일반적으로 미크론 스케일에 걸쳐 나노미터 해상도에서 3D 초구조 정보를 제공하는 것으로 간주되며 투과 전자 현미경 (TEM) 및 새로운 주사 전자 현미경 (SEM) 기술을 포함합니다. 리뷰 5,6,7,8 참조.
예를 들어, 집속 이온 빔 SEM (FIB-SEM)은 SEM 내부에 집중된 이온 빔을 사용하여 블록 표면의 순차적 SEM 이미징 스캔 사이에서 블록 표면을 밀링하여 샘플의 반복적인 자동 밀링 / 이미징을 허용하고재구성 9,10을위한 3D 데이터 세트를 구축 할 수 있습니다. 대조적으로, 직렬 블록 페이스 SEM(SBF-SEM)은 이미징(11,12) 이전에 블록 페이스로부터 재료를 제거하기 위해 SEM 내부의 초미세톰을 사용하는 반면, 어레이 단층 촬영은 3D 데이터 세트(13)를 생성하기 위해 SEM의 순차적 섹션에 관심 영역을 이미징하는 자동화된 워크플로우를 설정하기 전에 커버슬립, 웨이퍼 또는 테이프 상으로 직렬 섹션을 수집해야 하는 비파괴 프로세스이다. . 어레이 단층 촬영과 마찬가지로 직렬 섹션 TEM (ssTEM)은 이미징 전에 물리적 섹션을 수집해야합니다. 그러나 이러한 섹션은 TEM 그리드에서 수집되고 TEM14,15,16으로 이미지화됩니다. ssTEM은 틸트 단층 촬영17,18,19를 수행함으로써 확장될 수 있다. 직렬 틸트 단층 촬영은 x, y 및 z에서 최상의 해상도를 제공하며, 전체 셀(20)을 재구성하는 데 사용되었지만, 이는 합리적으로 도전적이다. 이 프로토콜은 현재 특수 단면화 또는 vEM 계측기에 액세스할 수 없지만 3D vEM 데이터 생성의 이점을 누릴 수 있는 많은 EM 실험실에서 사용할 수 있는 가장 접근하기 쉬운 vEM 기술로서 ssTEM의 실용적인 측면에 초점을 맞춥니다.
3D 재구성을위한 직렬 초미세 절제술은 이전에 도전적인 것으로 간주되었습니다. 짝수 단면 두께의 직선 리본을 절단하는 것이 어려웠고, 정확한 순서로, 정확한 크기의 리본을 충분한 지지를 받는 격자 상에 배열하고 픽업할 수 있어야 했지만, 관심 영역을 가리는 격자 막대가 없고, 가장 중요한 것은, 단면을 잃지 않고, 불완전한 시리즈가 완전한 3D 재구성(21)을 방지할 수 있기 때문이다. 그러나 상업용 초미세 토메, 다이아몬드 절단 및 트리밍 나이프 22,23, 그리드21,24의 전자 광택 지지 필름, 섹션 접착 및 리본 보존 보조 접착제 13,21에 대한 개선은 수년 동안 많은 실험실에서 기술을 더욱 일상적으로 만든 점진적 발전 중 일부에 지나지 않습니다. 직렬 섹션이 수집되면 TEM의 직렬 이미징이 간단하며 x 및 y의 서브나노미터 px 크기의 EM 이미지를 제공할 수 있으므로 많은 연구 질문에 대한 잠재적 요구 사항인 하위 세포 구조의 고해상도 심문이 가능합니다. 여기에 제시된 사례 연구는 ER - 소기관 접촉이 처음 관찰 된 간 간세포에서 소포체 (ER) - 소기관 접촉 연구에서 ssTEM 및 3D 재구성의 사용을 보여줍니다25,26.
핵 외피와 인접하는 동안, ER은 또한 리소좀, 미토콘드리아, 지질 방울, 및 원형질막(27)을 포함하는 수많은 다른 세포 소기관과 밀접한 접촉을 한다. ER-소기관 접촉은 지질 대사28, 포스포이노시타이드 및 칼슘 신호전달(29), 자가포식 조절, 및 스트레스 반응30,31에 연루되어 있다. ER-소기관 접촉 및 기타 소기관 간 접촉은 세포 대사 요구와 세포외 단서에 반응하는 매우 역동적인 구조이다. 그들은 크기와 모양, 그리고 소기관막 사이의 거리(32,33)에서 형태학적으로 변하는 것으로 나타났다. 이러한 초구조적 차이는 그들의 상이한 단백질/지질 조성 및 기능(34,35)을 반영할 가능성이 높다고 생각된다. 그러나, 소기관 간 접촉을 정의하고 이들을 분석하는 것은 여전히 어려운 과제이다(36). 따라서 추가 조사를 위해 소기관 간 접촉을 검사하고 특성화하기위한 신뢰할 수 있지만 간단한 프로토콜이 필요합니다.
ER-소기관 접촉은 멤브레인 대 멤브레인 분리에서 10 내지 30 nm의 범위를 가질 수 있기 때문에, 식별을 위한 황금 표준은 역사적으로 TEM이었다. 얇은 절편 TEM은 별개의 막 접촉부(37)에서 상주 ER 단백질에 대한 특이적 하위도메인 국재화를 밝혀냈다. 전통적으로 이것은 nm 분해능을 가진 ER - 소기관 접촉을 밝혀 냈지만 종종 이러한 상호 작용에 대한 2D 뷰 만 제시했습니다. 그러나 vEM 접근법은 이러한 접촉 부위의 초구조적 표현 및 컨텍스트를 3D로 밝혀 접점을 완전히 재구성하고 접점의 더 정확한 분류 (점 대 관형 대 수흉골 유사) 및 정량화38,39를 가능하게합니다. ER-소기관 접촉이 관찰된 최초의 세포 유형인 것 외에도(25,26), 간세포는 그들의 건축과 생리학 28,40에서 중요한 역할을 하는 다른 소기관 간 접촉의 광범위한 시스템을 가지고 있다. 그러나, 간세포에서의 ER-소기관 및 다른 소기관 간 접촉의 철저한 형태학적 특성화는 여전히 부족하다. 따라서, 재생 및 복구 동안 소기관 간 접촉이 형성되고 리모델링되는 방식은 간세포 생물학 및 간 기능과 특히 관련이 있습니다.

<table><tbody><tr><td>0.22 & 마이크로; m 주사기 필터</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 트레이</td><td>Agar Scientific</td><td>AGG3912</td><td></td></tr><tr><td>Amira v6</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>https://www.thermofisher.com</td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>피셔</td><td>C/4960/PB08</td><td></td></tr><tr><td>DDSA/Dodecenyl 숙신산 무수물</td><td>TAAB</td><td>T027</td><td>Epon 성분</td></tr><tr><td>다이아몬드 나이프</td><td>DiaTOME</td><td>울트라 45도;</td><td></td></tr><tr><td>DMP-30 / 2,4,6- 트라이 (디메틸 아미노 메틸) 페놀</td><td>TAAB</td><td>D032</td><td>Epon 성분</td></tr><tr><td>Dumont 핀셋 N5</td><td>Agar Scientific</td><td>AGT5293</td><td></td></tr><tr><td>피지</td><td></td><td></td><td>https://imagej.net/</td></tr> <tr><td>Fiji TrakEM2 플러그인</td><td></td><td></td><td>https://imagej.net/</td></tr> <tr><td>포름 알데히드 36 % 용액</td><td>TAAB</td><td>F003</td><td></td></tr><tr><td>Formvar 코팅된 슬롯 그리드</td><td>수제</td><td></td><td>대체품: EMS 디아섬(FF2010-Cu)</td></tr><tr><td>어플리케이터 로드가 있는 유리병</td><td>Medisca</td><td>6258</td><td></td></tr><tr><td>유리 바이알</td><td>Fisher Scientific</td><td>15364769</td><td></td></tr><tr><td>글루테알데히드 25% 용액</td><td>TAAB</td><td>G011</td><td></td></tr><tr><td>MNA/메틸 나딕 무수물</td><td>TAAB</td><td>M011</td><td>Epon 성분</td></tr><tr><td>오스뮴 테트록사이드 2% 용액</td><td>: TAAB</td><td>O005</td><td></td></tr> : <tr><td>페리시안화 칼</td>륨, <td>시그마 - 알드리치</td><td>P-8131</td><td></td></tr><tr><td>프로필렌 옥사이드</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>: E / 0050 / PB08</td><td></td></tr><tr><td>재사용 가능한 접착제</td><td>블루 택</td><td></td><td></td></tr><tr><td>레이놀즈 리드 시트레이트</td><td>TAAB</td><td>L037</td><td>단면 염색</td></tr><tr><td>: 카코딜 산 나트륨</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>C-0250</td><td> 0.1 M Caco 완충기</td></tr><tr><td>최고 접착제</td><td>RS 분대</td><td>918-6872</td><td>Cyanoacrylate 접착제, 단계 1.3</td></tr><tr><td>TAAB 812 수지</td><td>TAAB</td><td>T023</td><td>Epon 성분</td></tr><tr><td>Tannic 산</td><td>TAAB</td><td>T046</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>2액형 에폭시 수지</td><td>RS 분대</td><td>132-605</td><td>대안 : Step 2.13</td></tr><tr><td>초박절편기</td><td>Leica</td><td>UC7</td><td></td></tr><tr><td>진동 초소형 절편기</td><td>Leica</td><td></td><td>100 &micro; m 두께의 슬라이스, 1mm 진폭에서 0.16mm/s 절단.</td></tr><tr><td>Weldwood 원래 접촉 시멘트</td><td>DAP</td><td>107</td><td>접촉 접착제 : 단계 3.1.4</td></tr></tbody></table>

직렬 섹션 전자 현미경을 사용하여 간세포에서 소기관 간 접촉 부위의 입체 특성화

Three-dimensional Characterization of Interorganelle Contact Sites in Hepatocytes using Serial Section Electron Microscopy

투과 전자 현미경 검사는 오랫동안 세포 초 구조의 시각화를위한 황금 표준으로 간주되어 왔습니다. 그러나 분석은 종종 두 차원으로 제한되어 3차원(3D) 초구조와 소기관 간의 기능적 관계를 완전히 설명하는 능력을 방해합니다. 부피 전자 현미경 (vEM)은 메조 스케일, 마이크로 스케일 및 나노 스케일 해상도에서 3D로 세포 초 구조의 심문을 가능하게하는 기술 모음을 설명합니다. 
이 프로토콜은 TEM(직렬 섹션 전송 EM)을 사용하여 vEM 데이터를 획득할 수 있는 액세스 가능하고 강력한 방법을 제공하며 샘플 처리부터 디지털 3D 재구성에 이르는 기술적 측면을 하나의 간단한 워크플로우에서 다룹니다. 이 기술의 유용성을 입증하기 위해, 소포체와 미토콘드리아와 간 간세포에서의 접촉 부위 사이의 3D 초구조적 관계가 제시된다. 소기관 간 접촉은 소기관 사이의 이온, 지질, 영양소 및 기타 소분자의 전달에 중요한 역할을합니다. 그러나 간세포에서의 초기 발견에도 불구하고 물리적 특징, 역학 및 기능에 대해 배울 것이 여전히 많습니다. 
소기관 간 접촉은 두 소기관의 서로 근접성 (일반적으로 ~ 10-30nm)과 접촉 부위의 범위 (펑크 접촉에서 더 큰 3D cisternal-like 접촉에 이르기까지)에 따라 다양한 형태를 표시 할 수 있습니다. 밀접한 접촉을 검사하려면 고해상도 이미징이 필요하며 직렬 섹션 TEM은 간세포 분화 중 소기관 간 접촉의 3D 초구조뿐만 아니라 대사성 질환과 관련된 간세포 구조의 변화를 시각화하는 데 매우 적합합니다.

이 기술의 경우, 관심 영역은 생물학적 연구 목표에 따라 선택되고 포매된 조직의 트리밍 및 절편화 전에 확인된다. 유사하게, 블록 얼굴의 크기는 연구 질문에 의해 결정될 수 있다; 이 경우, 샘플은 대략 0.3 mm x 0.15 mm의 블록 면을 남기도록 트리밍되었다(도 4A). 이를 통해 그리드 당 9 개의 직렬 섹션으로 구성된 두 개의 그리드를 허용하여 18 개의 직렬 섹션을 제공하고 약 62 μm3 (316 μm x 150 μm x 1.3 μm)의 부피의 간 조직 부피를 통합했습니다. 이 부피는 간 조직에서 개별 미토콘드리아의 완전한 3D 재구성을 허용하기에 충분했다.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63496/63496fig04.jpg"> <str...

간세포의 소기관 또는 다른 조직의 세포 사이의 막 접촉 부위의 입체 세부 사항을 획득하는 간단하고 포괄적 인 프로토콜.

Transmission electron microscopy has been long considered to be the gold standard for the visualization of cellular ultrastructure. However, analysis is ...

이 프로토콜은 간단하고 견고한 방식으로 소기관을 3D 재구성 할 수 있으며 현재 전문 체적 전자 현미경이없는 실험실에서 액세스 할 수 있습니다. 이 기술은 매우 유연하여 뛰어난 X/Y 해상도를 제공하는 동시에 필요한 경우 샘플을 다시 이미지화할 수 있습니다. 또한 매우 높은 Z 해상도가 필요한 경우 틸트 단층 촬영과 호환됩니다.이 기술은 소기관 간 맥락에서 소기관 형태학의 심문을 허용합니다. 따라서 소기관 결함이있는 병리학 적 상태를 검사하도록 확장 될 수 있습니다. 이 접근법은 소기관 상호 작용 및 세포 밀매 사건에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.이 방법은 간세포 이외에 다른 조직, 오가노이드 모델 및 세포 배양 시스템에도 적용될 수 있다. 처음 사용하는 사용자는 직렬 단면화를 발견하고 손실없이 도전 할 수 있습니다. 이 프로토콜을 귀중한 샘플에 적용하기 전에 정기적 인 초박형 단면화에 능숙하는 것이 좋습니다.먼저 트리밍 어댑터에 잠긴 샘플로 면도날을 사용하여 수지 매립 조직을 조심스럽게 트리밍합니다. 척 및 샘플과 함께 표본 방주를 마이크로톰의 표본 암으로 옮기고 표본 방주를 배치하여 방주의 이동 범위가 위에서 아래로 흐르도록 합니다. 다이아몬드 나이프를 나이프 홀더에 넣고 잠그고 칼의 절단 각도가 적절하게 설정되었는지 확인하십시오.나이프 홀더를 스테이지에 안전하게 잠급니다. 무대 다운 라이팅을 끄고 무대 업라이트를 켜고 조심스럽게 칼을 시편쪽으로 옮기고 블록 면이 나이프의 가장자리에 정렬 될 때까지 관련 손잡이를 조정하여 나이프의 측면 각도, 시편 기울기 및 시편 회전을 지속적으로 조정합니다. 시편 팔의 절단 창의 상단과 하단을 설정하고 시편을 나이프 가장자리 바로 아래에 두십시오.칼 보트를 깨끗하고 이중 증류수로 채우고 물 표면이 칼의 가장자리와 약간 오목하게 맞는지 확인하십시오. 그런 다음 단면 절단을 시작하십시오. 샘플이 칼의 가장자리를 통과 한 직후에 절단을 중지하십시오.빈 슬롯 격자를 사용하여 각 그리드에서 수집할 섹션 수를 추정합니다. 각 손의 속눈썹을 사용하여 리본을 슬롯 그리드의 길이에 맞을 수있는 작은 리본으로 부드럽게 나눕니다. 샘플 내에서 상대적 위치를 정신적으로 기록하십시오.유리 어플리케이터 막대를 사용하여 클로로포름 한 방울을 섹션 위로 가져와 평평하게하십시오. 첫 번째 번호가 매겨진 포셉으로 첫 번째 빈 슬롯 그리드를 집어 들고 Triton X-100에 부드럽게 담근 다음 증류수에 두 번 담그십시오. 여과지를 사용하여 집게의 가장자리에서 과도한 물을 제거하십시오.포셉을 사용하여 포름바 코팅 슬롯 그리드의 약 2/3을 칼 보트의 물에 부드럽게 내립니다. formvar 측면이 아래를 향하고 슬롯의 긴 오른쪽 가장자리가 물 표면에 있고 물 가장자리와 평행한지 확인하십시오. 물 속의 그리드를 리본 쪽으로 부드럽게 흔들어서 복귀 스트로크 시 섹션이 그리드 쪽으로 드리프트되도록 합니다.리본의 오른쪽 가장자리가 슬롯의 오른쪽 가장자리와 정렬될 때까지 더 작고 작은 wafts에서 이 작업을 계속합니다. 그런 다음 마지막 waft를 사용하여 그리드를 부드럽게 위로 가져 와서 섹션을 슬롯 그리드로 가져옵니다. 이산화탄소가없는 환경을 제공하기 위해 페트리 접시 뚜껑 아래에 수산화 나트륨 몇 알갱이를 놓습니다.그런 다음 조심스럽게 레이놀드의 납 시트레이트를 파라 필름에 40 마이크로 리터 떨어 뜨리고 각 그리드마다 한 방울씩 떨어 뜨립니다. 각 그리드를 리드 시트레이트 드롭에 반전시키고 7 ~ 10 분 동안 페트리 접시 뚜껑으로 보호하십시오. 그리드가 염색되는 동안 파라 필름 위의 각 그리드에 대해 약 300 마이크로 리터의 증류수 방울 다섯 개를 놓습니다.납 시트레이트 인큐베이션이 끝나면 각 그리드를 증류수 방울로 옮겨 그리드에서 직접 호흡하지 않고 1 분 동안 세척하십시오. 이것을 네 번 더 반복하십시오. 번호가 매겨진 크로스오버 포셉을 사용하여 첫 번째 격자를 선택합니다.그리드의 가장자리를 터치하여 종이를 여과하여 대부분의 물을 윅 제거하고 포셉에서 적어도 20 분 동안 건조시킵니다. 각 격자선에 대해 이 작업을 반복합니다. 낮은 배율에서 직렬 단면의 순서, 위치 및 위치를 관찰하십시오.그리드에서 계열의 중간 섹션으로 이동합니다. 샘플을 찾아보고 관심 지역을 식별합니다. 이어서, 샘플을 원하는 배율로 관찰한다.단면이 완벽하게 정렬되지 않는 경우가 많으며 나중에 이미지를 잘라야 할 수 있으므로 시리즈를 약간 낮은 배율로 수집하는 것이 좋습니다. 다음으로, 더 낮은 배율로 참조 이미지를 촬영합니다. 이것은 관심 지역의 맥락을 이해하는 데 도움이 될 것이며, 섹션 경계와 관련하여 다른 배율에서의 거친 위치 및 샘플 내의 랜드 마크 특징입니다.이를 사용하여 다른 섹션의 관심 영역을 푯말하십시오. 화면 참조의 경우 재사용 가능한 접착제 퍼티, 스티커 또는 화면에 테이프로 붙인 오버헤드 프로젝터 용지를 사용하여 화면에 임시 마커를 배치합니다. 이렇게 하면 데이터 집합 전체에서 이미지 중앙에 있는 관심 영역의 동일한 기능을 일상적으로 다시 상상할 수 있습니다.이미지 스택을 열고 복셀 측정을 지정한 다음 세그멘테이션 탭을 선택하여 세그멘테이션을 시작합니다. 세그멘테이션 편집기 패널에서 새로 만들기를 클릭하여 재료 목록에서 새 객체를 정의합니다. 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 개체의 색상을 변경하고 두 번 클릭하여 개체의 이름을 바꿉니다.수동 세분화의 경우 재료 목록 아래의 세그멘테이션 도구를 선택하고 기본 브러시 도구를 선택하여 픽셀을 강조 표시합니다. 두 개의 대향하는 간세포의 전자 현미경 이미지가 여기에 표시됩니다. 더 높은 배율 이미징은 나노 미터 해상도로 다른 소기관의 형태 학적 세부 사항을 관찰 할 수있게합니다.대표적인 이미지는 동일한 단층 촬영의 분절 된 버전, 소포체의 흔적, 미토콘드리아, 및 다른 공간의 ER과 미토콘드리아 사이의 막간 접촉을 보여줍니다. 대표적인 이미지는 세분화 흔적과 전체 미토콘드리온 내의 상대적 위치로 겹쳐진 기울어진 오르토 슬라이스를 보여줍니다. 다른 각도에서 분절된 소기관과 소포체-미토콘드리아 접촉의 3D 재구성이 여기에 도시되어 있다.이 프로토콜은 매우 높은 Z 분해능이 필요할 때 틸트 단층 촬영과 호환되므로 작거나 복잡한 구조를 해결하는 데 도움이됩니다. 이 기술은 상이한 소기관 사이의 공간적 관계의 초기 평가에 완벽하며, 따라서, 막 항상성에서의 막 접촉의 진행 분야에서 특히 유용하다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

간 sinusoidal 내피 세포 (초)의 연구는 더 셀 라인이 존재하지 않는 등 동물에서 얻은 기본 세포로 수행되어야합니다. 이 방법은 이후 culturing 및 실험에 대한 SEC의 정화를 위해 간 소화 및 차등 원심 분리에 의존하고 있습니다.

간 재관류에 의한 간 세포의 정화를 얹는 생체내 간 Endocytosis에서

이 프로토콜 이미징 나노 해상도 스캐닝 전자 현미경 (SEM)을 사용 하 여 조직에서 특정 셀을 대상. 가벼운 현미경 목표를 식별 하 고는 SEM.에서 계층적 방식으로 다 수 생물학 물자 수 지 포함에서 직렬 섹션의 처음 몇...

큰 볼륨 내에서 특정 세포 목표를 찾아내기를 위한 직렬 섹션의 복합 계층적 이미징

우리는 아스코르바테 과산화수역 2 및 고추냉이 과산화증 염색을 포함하는 상관경 및 부피 전자 현미경을 사용하여 유전자 변형 후 전체 세포에서 미토콘드리아 및 호반 망상염식의 분포를 연구하는 프로토콜을 제시하고, 동일한 섹션에 있는 표적 유전자의 유무에 관계없이 세포의 직렬 단면도, 및 전자 현미경 검사법을 통해 직렬 화상 진찰.

미토콘드리아 및 코피포지티컬 라이트 및 부피 전자 현미경에 의한 산후성 망상 이미징

여기서 제시된 것은 변형된 콜라게나아제 관류 기술을 사용하여 성인 마우스 간으로부터 마우스 간세포의 분리를 위한 프로토콜이다. 또한 3D 콜라겐 샌드위치 설정에서 간세포의 장기 배양뿐만 아니라 담즙 카나리아 형성 및 치료에 대한 반응을 연구하기 위한 세포골격 성분의 면역 라벨링이 기술된다.

체외에서 담즙 관내 형성에서 세포골격의 역할을 연구하기 위해 1 차 마우스 간세포의 격리 및 3D 콜라겐 샌드위치 문화

여기에서는, 우리는 포르말린 고정된 파라핀 내장된 종양 조직 단면도에 있는 면역 세포를 구상하고, 정량화하고, 매핑하기 위한 간단하고 접근가능한 전략을 기술합니다. 이 방법론은 기존의 이미징 및 디지털 분석 기법과 이미징 분석의 다중 분석 기능 및 다중 매개 변수 분석을 확장하는 목적으로 결합합니다.

종양 미세 환경에서 면역 세포 집단의 시각화, 정량화 및 매핑

막 접촉 부위(MCS)를 연구하기 위한 새로운 접근법의 필요성은 이러한 세포 구조와 그 구성 요소 연구에 대한 관심이 증가함에 따라 증가했습니다. 여기에서는 MCS에 상주하는 세포 소기관 내 및 세포 기관 간 단백질 복합체를 식별하고 정량화하기 위해 이전에 사용 가능한 현미경 기술을 통합하는 프로토콜을 제시합니다.

근접 결찰 분석에 의한 ER-미토콘드리아 접촉 부위에서 내인성 세포 기관 내 단백질 상호 작용의 시각화 및 정량화

이 프로토콜은 빠르고 재현 가능한 내배엽 간 오가노이드(eHEPO)의 생성을 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하면 eHEPO를 2주 이내에 생산할 수 있으며 차별화와 기능을 잃지 않고 장기(1년 이상)로 확장할 수 있습니다.

기능성 내배엽 간 오가노이드(endodermal hepatic organoids)의 생성

Cryo-STEM 단층촬영은 임베딩, 절편 또는 기타 침습적 제제 없이 손상되지 않은 세포의 세포 소기관을 시각화하는 수단을 제공합니다. 얻어진 3D 해상도는 현재 수 나노미터 범위이며, 시야는 수 마이크로미터이고 접근 가능한 두께는 1μm 정도입니다.

Cryo-STEM 단층촬영에 의한 세포 소기관 In Situ 의 시각화

여기서는 세포 초미세 구조와 관련된 희귀 단백질의 국소화를 조사하기 위한 도구로서 내인성 형광 표지를 기반으로 하는 최적화된 절편 상관 광전자 현미경을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 접근법의 힘은 바필로마이신 처리 없이 굶주린 세포에서 내인성 LC3의 초구조적 국소화에 의해 입증되었습니다.

On-Section Correlative Light-Electron Microscopy를 통한 내인성 LC3의 초구조적 국소화

이 프로토콜은 미토콘드리아 크리스타를 재구성하여 높은 정확도, 고해상도 및 높은 처리량으로 3D 이미징을 달성하는 방법을 설명합니다.

췌장암 세포의 미토콘드리아 미세구조적 변화를 시각화하기 위한 3차원 기법

이 프로토콜은 간별 세포 형태를 온전한 간 조직에서 시각화하고 모델링하기 위한 포괄적인 영상 파이프라인을 제공합니다. 이 접근법은 마우스 유전학을 이용한 형광 표 지, 현장 간 관류 기반 조직 준비, 그리고 광학 투명성을 달성하기 위한 수정된 iDISCO 조직 클리어링 방법을 결합합니다.

간 섬유증 마우스 모델에서 간 별형 세포 형태 매핑

학습하세요 직렬 섹션 전자 현미경을 사용하여 간세포에서 소기관 간 막 접촉 부위의 3D 입체 구조를 재구성하는 방법을. 이 기법은 세포 소기관 상호작용과 형태학 연구에 활용됩니다.

직렬 섹션 전자 현미경을 사용하여 간세포에서 소기관 간 접촉 부위의 입체 특성화

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