Name: 살아있는 제브라 피쉬 유충의 눈 제거는 시각 시스템의 신경 의존적 인 성장과 발달을 조사합니다. (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: 학습하세요 제브라 피쉬 유충의 단측 눈 제거 기술로 시각 시스템의 신경 의존적 성장과 발달을 연구하는 방법을. 이 프로토콜은 동일 개체 내 신경 분포와 탈신경 시상 뇌엽을 비교 분석하여 신경 발생, 재생 및 퇴행 메커니즘을 규명합니다.

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이 작업에 대한 기금은 주로 Reed College에서 KLC에 이르는 창업 기금, Helen Stafford Research Fellowship 기금에서 OLH로, Reed College Science Research Fellowship에서 YK에 지원되었습니다. 이 프로젝트는 Steve Wilson의 실험실에서 Wellcome Trust Studentship (2009-2014)의 지원을 받은 HR과의 협력으로 시작되었습니다. 이 프로젝트에 대한 초기 토론을 위해 Máté Varga, Steve Wilson 및 Wilson 연구소의 다른 구성원들에게 감사 드리며, 특히 KLC에 아가로스에 배아를 장착하고 제브라 피쉬 뇌 해부를 수행하는 방법을 처음으로 가르친 Florencia Cavodeassi와 Kate Edwards에게 감사드립니다. 우리는 또한 Greta Glover와 Jay Ewing에게 텅스텐 바늘 연마 장치를 조립하는 데 도움을 주신 것에 감사드립니다.

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저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

이 논문에 설명 된 기술은 제브라 피쉬에서 척추 동물 시각 시스템 개발을 연구하기위한 많은 접근법 중 하나를 보여줍니다. 다른 연구자들은 배아 망막을 해부하고 유전자 발현 분석19 를 수행하거나 광학 텍텀30에서 신경 활동을 시각화하는 방법을 발표했습니다. 이 논문은 차등 망막 입력이 광학 텍텀의 세포 행동에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 탐구하기위한 접근법을 제공합니다.
수술 후 성공적인 눈 소멸과 애벌레 생존을 보장하기 위해서는 유충이 건강하고 적절하게 마취되며 1 % 아가로스에 고정되어있는 것이 중요합니다. 포셉과 텅스텐 바늘이 매우 날카 롭고 깨끗한 것도 중요합니다. 유충은 수술 전후에 24 시간을 먹이지 않을 때 가장 잘 생존하며, 항생제가 보충 된 MMR에서 유충을 기르면 치유 과정이 빨라집니다. 중요하게도, MMR의 더 높은 이온 강도 및 특히 칼슘의 더 높은 농도는 치유를 촉진한다...

이 방법의 목표는 망막 입력이 제브라 피쉬 뇌의 시각 처리 센터 인 광학 텍텀의 성장과 발달에 어떻게 영향을 미치는지 조사하는 것입니다. 한쪽 눈을 제거한 다음 광학 텍텀의 양면을 비교함으로써 동일한 시편 내의 텍탈 변화를 관찰하고 표준화하여 여러 표본에서 비교할 수 있습니다. 이 기술과 결합 된 현대 분자 접근법은 시각적 시스템 성장 및 개발뿐만 아니라 축삭 변성 및 재생의 기초가되는 메커니즘에 대한 통찰력을 얻을 것입니다.
시각, 청각 및 신체 감각 - 감각 시스템은 외부 기관으로부터 정보를 수집하고 그 정보를 중추 신경계로 전달하여 중뇌 1,2에 걸쳐 외부 세계의 "지도"를 생성합니다. 시력은 많은 물고기를 포함한 거의 모든 척추 동물에게 지배적 인 감각 양식입니다. 눈의 신경 조직인 망막은 주로 광수용체, 양극성 세포, 망막의 돌출부 뉴런인 망막 신경절 세포(RGCs)로 구성된 뉴런 회로로 정보를 수집합니다. RGC는 망막의 내부 표면을 가로 질러 시신경 머리로가는 길을 찾는 긴 축삭을 가지고 있으며, 뇌를 통해 매혹되고 함께 여행하며 궁극적으로 등쪽 중뇌의 시각 처리 센터에서 끝납니다. 이 구조는 물고기 및 다른 비 포유류 척추 동물에서 광학 텍텀이라고하며 포유류3에서 우수한 콜리큘러스와 상동성입니다.
광학 텍텀은 등쪽 중뇌의 양측 대칭 다층 구조입니다. 제브라피쉬와 대부분의 다른 물고기에서, 시신경의 각 엽은 대측 눈으로부터 시각 입력만을 수신하여 좌측 시신경이 우측 지골로브에서 종결되고 우측 시신경이 좌측 지골엽(4)에서 종결된다(그림 1). 포유류와 마찬가지로 우수한 콜리큘러스인 광학 텍텀은 오디션과 소마토센세이션을 포함한 다른 감각 입력과 시각 정보를 통합하여 사케이드 1,5,6과 같은 시각적 관심과 안구 움직임의 변화를 제어합니다. 그러나, 포유류의 우수한 콜리큘러스와는 달리, 광학 텍텀은 텍탈 증식 구역7이라고 불리는 텍탈 로브의 내측 및 꼬리 가장자리 근처의 특수 줄기 세포 틈새 시장에서 지속적으로 새로운 뉴런과 글리아교를 생성합니다. 시신경 텍텀 및 중추 신경계의 다른 영역에서 증식성 전구 인자의 유지는 부분적으로 제브라피쉬8에 문서화 된 놀라운 재생 능력에 기여합니다.
맹인 또는 한쪽 눈의 물고기의 두뇌를 조사한 이전 연구에 따르면 광학 텍텀 크기는9,10,11을받는 망막 신경의 양에 직접적으로 비례한다는 것이 밝혀졌습니다. 초기 배아 발생시 눈이 퇴화하는 성인 동굴 물고기에서 광학 텍텀은 밀접하게 관련된, 관찰 된 표면 물고기의 그것보다 눈에 띄게 작습니다9. 동굴 물고기 눈 변성은 배아 발생 동안 내인성 렌즈를 표면 물고기의 렌즈로 대체함으로써 차단 될 수 있습니다. 이 한쪽 눈의 동굴 물고기가 성인기까지 자랄 때, 신경 과민 지체 엽은 비 신경 수축 엽9보다 약 10 % 더 많은 세포를 포함합니다. 마찬가지로, 동일한 개체 내에서 다른 크기의 눈을 생성하기 위해 화학 처리와 함께 배양 된 애벌레 킬리 피쉬에서, 더 많은 신경을 가진 텍텀의 측면은 더 크고 더 많은 뉴런(10)을 포함했다. 성인 금붕어에서 시신경 분쇄 실험의 증거는 신경이 증식을 촉진한다는 것을 나타내며, 신경이 파괴되었을 때 지각 세포 증식이 감소합니다11.
이러한 고전적 연구를 확인하고 확장하면서, 최근의 몇몇 보고서는 신경과민에 대한 반응의 증식이 BDNF-TrkB 경로12,13에 의해 적어도 부분적으로 조절된다는 것을 암시하는 데이터를 제공한다. 발달하는 감각 시스템이 손상과 축삭 변성에 어떻게 대처하는지, 세포 및 분자 신호가 망막 입력을 가능하게 하여 광학 텍텀 성장을 조절할 수 있는지, 이러한 메커니즘이 활성화될 때, 신경 연결된 증식 및 분화가 망막과 표적 조직이 성장 속도를 조정하고 정확한 망막 토픽 매핑을 보장할 수 있는지 여부 등 광학 텍텀의 성장과 발달에 관한 많은 열린 질문이 남아 있습니다. 또한, 아래에 설명 된 것과 같은 외과 적 접근법으로 제브라 피쉬 시각 시스템을 심문함으로써 해결할 수있는 활동 의존적 발달에 관한 훨씬 더 큰 질문이 있습니다.
신경 활동, 특히 시각적 입력으로부터 세포 생존 및 증식을 변화시키는 세포 및 분자 메커니즘을 조사하기 위해 설명 된 접근법은 개별 제브라 피쉬 유충 내의 신경 및 탈질 된 텍탈 엽 (그림 1)을 직접 비교합니다. 이 방법은 광학 구조체에서 RGC 축삭 변성에 대한 문서화와 유사분열 세포의 수가 신경과민과 상관관계가 있음을 확인할 수 있게 한다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63509/63509fig01.jpg"> 그림 1 : 일방적 인 눈 제거 전후의 제브라 피쉬 유충의 스케치. (A) 해부 현미경으로 볼 때 5 dpf 유충의 그림. 각 유충은 저융점 아가로스에 내장되어 있으며 날카로운 후크 팁이있는 텅스텐 바늘 앞에 옆으로 향하게되어 눈을 위로 향하게합니다 (이 예에서는 왼쪽 눈). (B) A에 묘사 된 수술로 인한 9 dpf 유충의 등쪽 뷰의 그림. 오른쪽 눈에서 고도로 개략화 된 RGC 축삭 돌기는 왼쪽 지체 엽의 뉴런과 수축하고 연결하는 것으로 나타났습니다. 약어 : dpf = 수정 후 일; dps = 수술 후 일수; RGC = 망막 신경절 세포. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63509/63509fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>장비 및 용품:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Breeding boxes</td><td>Aquaneering</td><td>ZHCT100</td><td></td></tr><tr><td>Dow Corning 고진공 그리스</td><td>Sigma 또는 이와 동등한 공급업체</td><td>Z273554</td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyer 플라스크(125mL)</td><td></td><td></td><td>수술 후 배양을 위한 항생제가 함유된 Marc's Modified Ringers(MMR) 제조용.</td></tr><tr><td>파인 펜치 - Dumont #5</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>유리 파스퇴르 피펫</td><td>DWK Lifescience</td><td>63A53 & 63A53WT</td><td>배아 및 유충 피펫팅용.</td></tr><tr><td>현미경 검사용 유리 슬라이드</td>, <td>VWR 또는 동급 공급업체</td><td>: 48311-703</td><td>표준 유리 현미경 슬라이드는 다양한 실험실 공급업체에서 주문할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>눈금이 매겨진 병과 눈금이 매겨진 실린더</td><td></td><td></td>를 포함한 유리 제품 <td>용액을 만들고 보관하기 위해.</td></tr><tr><td>2액형 에폭시 수지</td><td>ACE 하드웨어 또는 Gorilla Glue 또는 이에 상응하는 기타 공급업체</td>, <td>0.85oz 주사기</td><td>https://www.acehardware.com/departments/paint-and-supplies/tape-glues-and-adhesives/glues-and-epoxy/1590793</td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브(1.7mL),</td> <td>VWR 또는 동급의 공급업체</td>, <td>22234-046</td><td></td></tr>, <tr><td>니켈 도금 핀 홀더(길이 17cm)</td><td>Fine Science Tools(FST)</td><td>26018-17</td><td>수술 / 해부를 연마하고 수행하는 동안 텅스텐 와이어를 고정합니다.</td></tr><tr><td>나일론 메쉬 차 여과기 또는 이에 상</td><td>응하는 Ali Express 또는 동급</td><td></td>의 <td>산란 후 제브라 피쉬 알을 수확하기 위해;https://www.aliexpress.com/item/1005002219569756.html</td></tr><tr><td>종이 클립</td><td></td><td></td><td>텅스텐 바늘 숫돌 장치용.</td></tr><tr><td>페트리 접시 100mm</td><td>Fischer Scientific 또는 동급 공급업체</td><td>50-190-0267</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시 35mm</td><td>Fischer Scientific 또는 동급 공급업체</td><td>08-757-100A</td><td></td></tr><tr><td>피펫 펌프</td><td>SP Bel-Art 또는 동급</td><td>F37898-0000</td><td></td></tr><tr><td>수산화칼륨(KOH)</td><td>시그마</td><td>909122</td><td>텅스텐 바늘 날카롭게하는 장치. 탈이온수에 펠릿을 추가해서 두건에 있는 KOH의 10% w/v 해결책을 만드십시오.</td></tr><tr><td>전원 공급 장치 (가변 전압)</td><td></td><td></td> <td>텅스텐 바늘 샤프닝 장치 용. 가변 전압의 모든 전원 공급 장치가 작동합니다(겔 전기영동에 사용되는 전원 공급 장치도 해당).</td></tr><tr><td>Sylgard 184 엘라스토머 키트</td><td>다우 코닝</td><td>3097358</td><td></td></tr><tr><td>텅스텐 와이어 (직경 0.125mm)</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>TGW0515</td><td>눈을 제거하고 유충을 해부하기 위해 날카롭</td></tr>게합니다.<tr><td>가변 온도 열 블록</td><td>Lab Depot 또는 이에 상응하는 공급업체</td><td>BSH1001 또는 BSH1002</td><td>40-42°로 설정합니다. C는 실험보다 앞서 있습니다.</td></tr><tr><td>뚜껑이 있는 입이 넓은 유리 항아리(예: 깨끗한 잼 또는 살사 항아리)</td><td></td><td></td><td>텅스텐 바늘 숫돌 장치용.</td></tr><tr><td>앨리게이터 클립 리드</td><td></td><td></td>가 있는 전선 <td>텅스텐 바늘 샤프닝 장치용.</td></tr><tr><td>microscopes: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td></td><td></td><td>모든 유형이 작동하지만 미러 베이스에 조정 가능한 투과광이 있는 것이 선호됩니다.</td></tr><tr><td>레이저 스캐닝 컨포칼 현미경</td><td></td><td></td><td>높은 개구수, 20-25x 수침 대물 렌즈를 권장합니다. 현미경 제어 및 이미지 캡처 소프트웨어(Nikon의 NIS-Elements)가 사용되지만 모든 컨포칼 현미경이 작동합니다.</td></tr><tr><td> 수술 및 해부용 시약:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td>Marc's Modified Ringers(MMR) 및 배아 배지(E3)용.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H7006</td><td>Marc의 개조 된 벨소리 (MMR).</td></tr><tr><td>저융점 아가로스</td><td>Invitrogen</td><td>16520-050</td>은 <td>배아 배지(E3) 또는 Marc's Modified Ringers(MMR)에서 1%를 만듭니다.</td></tr><tr><td>염화마그네슘 육수화물</td><td>시그마</td><td>1374248</td><td>배아 배지(E3)용.</td></tr><tr><td>황산 마그네슘</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td>Marc의 수정 링거 (MMR) 용.</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>전자 현미경 Sciences</td><td>19210</td><td>8%(w/v) 스톡을 2x 농축 PBS(10x PBS 스톡에서 희석)로 희석합니다.</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>시그마</td><td>P4333-20ML</td><td>Marc의 변형 링거에서 1:100을 희석합니다.</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS) 정제</td><td>Diagnostic BioSystems</td><td>DMR E404-01</td><td>탈이온수에 10배 재고를 만들고 오토클레이브하여 실온에서 보관하십시오. 작업 농도의 1배로 희석합니다.</td></tr><tr><td>염화칼륨</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td>Marc's Modified Ringers(MMR) 및 배아 배지(E3)용.</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td>Marc's Modified Ringers(MMR) 및 배아 배지(E3)용.</td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>시그마</td><td>S5881</td><td>10m를 만들고 MMR의 pH를 7.4로 조정하는 데 사용합니다.</td></tr><tr><td>설탕</td><td>시그마</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>트리카인-</td><td>S 펜테어</td><td>100G</td><td>#TRS1 레시피:</td></tr> <tr><td>https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE면역조직화학용 시약:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexafluor 568 태그가 지정된 토끼 IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-11011</td>을 검출하기 위한 2차 항체 <td>wholemount를 위해 1:500 희석에서 사용 면역조직화학.</td></tr><tr><td>DAPI 또는 ToPro3</td><td>Invitrogen</td><td>1306 또는 T3605</td>는 <td>DMSO에서 1 mg/mL 용액을 구성합니다. 대조염색을 위한 1:5,000 희석.</td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드(DMSO)</td><td>시그마</td><td>D8418</td><td>면역블록 완충액의 구성 요소.</td></tr><tr><td>메탄올 (MeOH)</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td>MeOH를 PBST와 같은 수용액과 혼합하는 것은 발열입니다. MeOH/PBST 용액은 최소 몇 시간 전에 만들거나 사용하기 전에 얼음으로 식히십시오.</td></tr><tr><td>일반 염소 혈청</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50-062Z</td><td>면역차단 완충액의 성분. 1-10 mL 용량으로 분주할 수 있으며 -20 °C에서 보관할 수 있습니다.</td></tr><tr>포스포히스톤 H3 <td>Millipore</td><td>06-570</td><td>을 검출하기 위한 1차 항체</td><td>wholemount immunohistochemistry를 위해 1:300 희석에서 사용합니다.</td></tr><tr><td>적색 형광 단백질을 검출하기 위한 기본 항체(RFP, dsRed 유도체 검출)</td><td>MBL International</td><td>PM005</td><td>wholemount immunohistochemistry를 위해 1:500 희석에서 사용합니다.</td></tr><tr><td>Proteinase K (PK)</td><td>Sigma</td><td>P2308-10MG</td><td>PBS에서 10 mg/mL 원액을 구성하고 10 &마이크로에서 사용합니다. g/mL입니다.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>PBS에서 20%(v/v) 스톡 솔루션을 만드는 데 유용합니다.</td></tr><tr><td>데이터 분석용 소프트웨어</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ (피지)</td><td></td><td></td><td>이미지 분석용 프리웨어; https://imagej.net/software/fiji/</td></tr> <tr><td>RStudio</td><td></td><td></td><td>통계 분석 및 데이터 시각화용 프리웨어; https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/</td></tr> <tr><td>Adobe Photoshop 또는 GIMP</td><td></td><td></td><td>독점적인 이미지 처리 소프트웨어(Adobe Photoshop 및 Illustrator)는 종종 그림을 구성하는 데 사용됩니다. 프리웨어 대안은 Gnu Image Manipulation Program (GIMP; https://www.gimp.org/)</td></tr><tr><td>Zebrafish strains.</strong입니다> 이 연구는 AB, TU, Tg[atoh7:RFP] 균주를 사용했습니다.</td><td></td><td></td><td>다음에서 사용 가능&nbsp; 미국(https://zebrafish.org/home/guide.php) 또는 유럽(https://www.ezrc.kit.edu/)에 있는 제브라피시 국제 리소스 센터. 아직 리소스 센터에 기탁되지 않은 특수 형질전환 균주는 발표 후 개별 실험실에 요청할 수 있습니다.</td></tr></tbody></table>

살아있는 제브라 피쉬 유충의 눈 제거는 시각 시스템의 신경 의존적 인 성장과 발달을 조사합니다.

Eye Removal in Living Zebrafish Larvae to Examine Innervation-dependent Growth and Development of the Visual System

제브라피쉬는 놀라운 평생 성장과 재생 능력을 발휘합니다. 예를 들어, 배아 발생 중에 확립 된 특수 줄기 세포 틈새 시장은 눈과 뇌 모두에서 전체 시각 시스템의 지속적인 성장을 지원합니다. 망막과 광학 텍텀 사이의 조정 된 성장은 눈과 뇌에 새로운 뉴런이 추가됨에 따라 정확한 망막 토픽 매핑을 보장합니다. 망막 축삭이 생존, 증식 및/또는 분화와 같은 지각 줄기 및 전구 세포 행동을 조절하는 데 중요한 정보를 제공하는지 여부를 해결하기 위해서는 동일한 동물 내의 신경질과 탈핵된 지체 엽을 비교할 수 있어야 합니다. 
살아있는 애벌레 제브라 피쉬에서 한쪽 눈을 외과 적으로 제거한 다음 광학 텍텀을 관찰하면이 목표를 달성합니다. 첨부 된 비디오는 애벌레를 마취하고, 전해로 텅스텐 바늘을 날카롭게하고, 한쪽 눈을 제거하는 데 사용하는 방법을 보여줍니다. 다음으로 고정 된 제브라 피쉬 애벌레에서 뇌를 해부하는 방법을 보여줍니다. 마지막으로, 비디오는 면역 조직 화학을위한 프로토콜에 대한 개요와 현미경 검사를 위해 저융점 아가로스에 염색 된 배아를 장착하는 방법에 대한 데모를 제공합니다.

눈 제거가 완료되었는지 여부를 확인하고 시신경 텍텀이 어떻게 변하는지를 평가하기 위해, 모든 RGC를 막 표적 RFP로 라벨링하는 Tg[atoh7:RFP] 균주에서 수술을 수행했으며, 따라서 망막으로부터 투사되어 시신경을 형성하는 모든 축삭기(24)를 형성한다. 이 균주를 사용하는 것이 절대적으로 필요한 것은 아니지만, 시신경 텍텀 뉴로필에서 시신경 테르미니를 직접 관찰하고 시각화 할 수 있습니다. 친유성 DiI 또는 DiO 염료25,26을 사용한 축삭 추적 또는 brainbow 27을 사용한 다중 스펙트럼 표지와 같은 시신경을 표지하기 위한 다른 접근법도 또한 가능할 것이다.
도 2에 나타난 바와 같이, 시신경텍텀 뉴로필...

이 기사는 망막 입력이 광학 텍텀의 성장과 발달에 어떻게 영향을 미치는지 조사하기위한 첫 번째 단계로 살아있는 제브라 피쉬 유충에서 눈을 외과 적으로 제거하는 방법을 설명합니다. 또한이 기사는 애벌레 마취, 고정 및 뇌 해부에 대한 정보를 제공하고 면역 조직 화학 및 공초점 이미징을 제공합니다.

Zebrafish exhibit remarkable life-long growth and regenerative abilities. For example, specialized stem cell niches established during embryogenesis ...

그래서 제 연구실은 눈과 뇌가 어떻게 함께 성장하는지 이해하는 데 관심이 있습니다. 이 기술을 통해 망막 입력이 뇌 성장과 발달에 어떻게 영향을 미치는지 연구 할 수 있습니다. 살아있는 애벌레 제브라 피쉬에서 한쪽 눈을 외과 적으로 제거한 다음 광학 텍텀을 관찰하면 동일한 동물과 동물 전체에서 신경질과 탈질 된 지체 엽을 비교할 수 있습니다.이 기술을 현대 분자 접근법과 결합하면 신경 발달, 재생 및 퇴행의 기초가되는 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 얻을 수 있습니다. 시작하려면 음극과 양극 전선을 전원 공급 장치에 연결하십시오. 음극선 끝의 악어 클립을 부분적으로 곧게 펴는 종이 클립에 부착하고 종이 클립을 수산화 칼륨 용액에 삽입하여 항아리 측면에 부착하십시오.양극 와이어의 악어 클립을 바늘 홀더의 목에 부착하십시오. 전원을 약 20V로 돌리고 텅스텐 와이어를 수산화 칼륨 용액에 담그고 와이어를 용액에서 비스듬히 당겨 와이어를 미세한 팁으로 전해로 날카롭게하십시오. 해부 현미경으로 바늘 끝을 확인하여 충분히 날카로운지 확인하십시오.곡선 바늘 팁은 날카로운 바늘이 페트리 접시에 부드럽게 닿아 구부러질 때 발생합니다. 수술 당일에는 넓은 보어 유리 목초지 피펫을 사용하여 10 ~ 15 마리의 유충을 신선한 E3로 채워진 35 밀리미터 페트리 접시로 옮깁니다. 애벌레에 마취제 세 다섯 방울을 넣으십시오. 유충이 적절하게 마취되었는지 확인하려면 접촉 반응이 부족한지 확인하십시오.유충이 세 분 후에도 여전히 만지기에 반응하고 재평가되는 경우 마취제를 두 세 방울 더 넣으십시오. 수술을 위해 유충을 고정시키려면 유충 한 마리를 소량의 E3만으로 좁은 보어 유리 목초지 피펫으로 가져 가십시오. 다음으로, 약 200 마이크로리터의 용융된 1%저융점 또는 LMP 아가로스 유충을 함유하는 피펫에 넣고 혼합하여 유충이 LMP 아가로스 내에 현탁되도록 한다. 해부 현미경 아래에 35 밀리미터 페트리 접시의 뚜껑을 올려 놓은 다음 유충과 아가로스를 거꾸로 된 페트리 접시 뚜껑에 쏟아 붓습니다.애벌레가 방울의 중심에 있도록 아가로스를 퍼뜨립니다. 둔한 텅스텐 바늘을 사용하여 유충을 빠르고 부드럽게 조종하여 한쪽 눈이 위쪽을 향하게하여 측면이되도록하십시오. 아가로스가 설정될 때까지 몇 분 정도 기다립니다.눈 궤도의 가장자리를 따라 미세하게 전해로 날카롭게 된 텅스텐 바늘의 끝을 사용하여 눈 주위의 피부를 관통하십시오. 그런 다음 눈의 측두엽 - 복부 쪽에서 눈 밑의 바늘 가장자리를 밀어 넣습니다. 제어된 압력을 사용하여 소켓에서 눈을 떼어냅니다.바늘 옆으로 눈을 등쪽과 앞쪽으로 계속 누르고 결국 시신경을 통해 슬라이스하고 눈을 풀어줍니다. 또는 매우 미세한 수술 포셉을 사용하여 시신경을 꼬집고 눈을 내측에서 옆으로 밀어 눈을 제거 할 수 있습니다. 성공적인 눈 제거 후, MMR 용액으로 아가로스를 덮고, 텅스텐 바늘을 머리 주위와 몸 주위를 부드럽게 닦아서 각 유충을 해방시키고 포셉으로 페트리 접시 뚜껑을 안정화시킵니다.수술 후 다음 날까지 항생제가 보충 된 MMR 용액에 유충을 넣은 다음 유충을 E3로 돌려 보내고 실험이 끝날 때까지 되돌립니다. 유충이 말기 마취 된 후 4 % 파라 포름 알데히드로 고정하십시오. 해부 현미경으로 밀봉 가드 플레이트 상의 PBS 액적에 고정된 유충을 현탁시킨다.노토코드를 통해 두 개의 텅스텐 핀을 AGM 영역을 덮고 다른 핀을 AGM 영역을 덮는 착색 된 영역에 후방으로 배치하고 다른 핀을 노른자 연장의 끝과 일치시켜 측면으로 고정하십시오. 날카로운 텅스텐 바늘과 미세한 포셉으로 눈을 제거하십시오. 때로는 바늘을 턱을 통해 반대쪽으로 찌르고 다른 쪽 눈을 제거 할 수 있습니다.텅스텐 바늘을 사용하여 귀의 측두엽에서 복부 쪽으로 긁으십시오. 움직이는 것과 같은 동작으로 바늘 후방을 턱으로 가져 와서 귀와 턱이 제거 될 때까지 부드럽게 앞쪽으로 당깁니다. 턱을 통해 바늘을 찌르고 다른 눈과 귀를 제거하십시오.포셉을 사용하여 복부 장기와 남아있는 노른자를 꺼냅니다. 마지막으로, 뒷 뇌와 척수 사이의 교차점 근처의 등쪽 두개골 피부에 얕은 절개를하십시오. 포셉으로 피부를 들어 올리고 전방과 텔렌스팔론 주위를 당깁니다.포셉으로 남아있는 조직을 제거하십시오. 유충을 핀을 풀고 PBS로 옮겨 1.5 밀리리터 마이크로원심분리 튜브로 옮긴다. 챔버 슬라이드를 진공 그리스로 100mm 페트리 접시의 뚜껑에 고정시킵니다.면역 염색되고 가공 된 유충을 우물 플레이트 또는 우울증 슬라이드로 옮겨 해부 현미경으로 봅니다. 유충을 1 % LMP 아가 로즈 컬럼의 챔버 슬라이드에 장착하십시오. 피펫을 지나 유리를 사용하여 챔버 슬라이드에 유충 한 마리를 올려 놓고 가능한 한 적은 PBS를 증착하십시오.동일한 피펫을 사용하여 녹이고 따뜻한 1 % LMP 아가로오스로 유충을 덮으십시오. LMP 아가로스를 컬럼에 피펫 한 다음 유충을 등쪽 표면이 보이는 가능한 한 대칭으로 배치합니다. 눈 제거 후, 망막 축색돌기의 진행성 변성이 광학 텍텀 뉴로필에서 관찰되었다.수술 후 이틀 후, RFP 라벨이 붙은 축삭은 블래빙과 분열과 같은 빠른 Wallerian 변성의 특징을 나타 냈습니다. RFP 양성 누자는 화살표로 표시된 바와 같이 텍텀의 오른쪽에있는 뉴로필 내외에서 모두 기록되었습니다. 수술 후 나흘 후, 우측 지각 엽에서 파편화된 축삭돌기와 RFP 라벨이 붙은 축삭 파편이 상당히 감소하여 죽어가는 축삭돌기의 비교적 빠른 제거를 나타냅니다.뇌는 피부와 결합 조직의 눈, 턱, 귀 및 두개골 뚜껑을 해부하여 노출되었습니다. 이상적으로, 뇌는이 과정에서 손상되지 않은 상태로 남아 있습니다. 그러나 앞뇌의 일부, 특히 후각 전구는 피부 또는 턱의 두개골 뚜껑이 제거되었을 때 손상되거나 완전히 제거되었을 가능성이 큽니다.또한, 때로는 텍텀의 측면 선반이 피부를 관통하거나 꼬집어 뇌에서 떼어 낼 때 슬라이스됩니다. 두 샘플이 동일하지 않습니다. 따라서 필요에 따라 눈 제거와 뇌 해부를 통해 미묘한 적응을 할 수 있어야합니다.환자와 날카로운 도구는 성공을 위해 필수적입니다. 이 기술은 생체 내 살아있는 세포 이미징 또는 RNA 시퀀싱과 같은 세포 및 분자 접근법을 따라 광학 텍텀 성장 및 개발의 분자 및 세포 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 얻을 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 비디오에서는, 우리는 공촛점 현미경으로 단세포 해상도 라이브 zebrafish의 배아에서 개발 척추 두뇌를 분석하는 방법을 보여줍니다. 이것은 우리가 단일 셀 zebrafish 배아를 주입하고 이후 개발 두뇌를 마운트와 이미지하는 방법을 포함합니다.

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렌즈 개발은 다른 조직과 상호 작용을 포함한다. 여러 zebrafish 아이 돌연변이 비정상적으로 작은 렌즈의 크기가 특징입니다. 여기 우리는이 표현형은 본질적 원인이나 렌즈를 둘러싸고있는 조직과 결함이 상호 작용에 의한 있는지 여부를 확인하기 위해 렌즈 이식 실험을 보여줍니다.

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VisioTracker는 안구 운동의 기록을 바탕으로 애벌레의 작은 성인 물고기의 시각적 성능의 정량 분석​​을위한 자동화 된 시스템입니다. 이 같은 시각 시스템 개발 및 기능, 약리학, 신경 회로 연구와 sensorimotor 통합 등의 분야에서 높은 처리량 연구를 활성화, 시각 자극 속성과 실시간 분석에 대한 모든 권한을 제공합니다.

VisioTracker, 눈 돌림 분석에 대한 혁신적인 자동화 된 접근

출처: Schramm, P. et al. 두개골 및 피부 제거에 의한 깨어 있는 제브라피시 유충 및 청소년의 완전 활성 뇌 조직의 생체 내 이미징. J. Vis. Exp. (2021)이 비디오는 Purkinje 뉴런에서 형광 단백질을 발현하는 형질전환 제브라피시 유충의 소뇌 뉴런의 생체 내 이미징을 보여줍니다. 이 과정에는 유충을 마취하고, 아가로스로 고정시키고, 착색된 피부를 조심스럽게 제거하여 빛 투과와 형광 강도를 향상시키는 것이 포함됩니다. 마지막으로, 준비된 표본을 컨포칼 현미경으로 이미지화하여 표지된 뉴런을 명확하게 시각화합니다.

소뇌 뉴런 시각화를 위한 제브라피시 애벌레 뇌의 생체 내 이미징

우리는 미세 조작 및 전기 망막검사 기술을 사용하여 제브라피시 유충의 전기망막검사(ERG) 분석 방법을 제시합니다. 이것은 생체 내에서 제브라피시 유충의 시각 기능을 분석하는 간단하고 간단한 방법입니다.

Zebrafish의 애벌레에서 비주얼 응답의 전위도 분석

광시트 형광 현미경은 배아 발달을 이미징하기 위한 훌륭한 도구입니다. 이를 통해 생리학적 조건에 가까운 살아있는 배아의 장시간 타임랩스 동영상을 녹화할 수 있습니다. 우리는 넓은 시공간 규모에 걸쳐 제브라피시 눈 발달을 이미징하기 위한 응용 프로그램을 시연하고 다중 보기 데이터 세트의 융합 및 디콘볼루션을 위한 파이프라인을 제시합니다.

이미지 Zebrafish의 눈 개발에 가벼운 시트 형광 현미경을 사용하여

레이저 스캐닝 현미경 검사 법 긴 파장 다중 광자 형광 여기의 고급 광학 기술의 조합 안내 (sox10:EGFP)에 안내 (foxd3:GFP) zebrafish 태아 신경 크레스트 마이그레이션의 고해상도, 3 차원, 실시간 영상 캡처 구현 되었습니다.

실시간으로 개발을 시각화 하기 위해 다중 광자 시간 경과 영상: 마이그레이션 Zebrafish 태아 신경 크레스트 셀의 시각화

여기, 선물이 애벌레 zebrafish에서 빛 갖는 electroretinogram 응답의 측정을 간소화 하는 프로토콜. 소설 원뿔 모양의 스폰지 팁 전극에 electroretinogram를 사용 하 여 신뢰할 수 있는 결과 낮은 비용으로 달성 하기 쉽게 하는 애벌레 zebrafish에 시각적 개발의 연구를 만들기 위해 도울 수 있다.

스폰지 팁 전극 A 소설 원추형을 사용 하 여 애벌레 Zebrafish에 기록 하는 Electroretinogram

이 프로토콜은 제브라피시의 토토 라벨링 및 다차원 이미징의 접근 방식을 초기 눈 발달에 설명합니다. 당사는 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 이용한 라벨링, 임베딩 및 4차원(4D) 이미징을 설명하고, 광학컵 형태발생의 해부 메커니즘을 위한 데이터 집합의 획득을 최적화하기 위한 고려 사항을 설명합니다.

제브라피쉬 광학컵 모르포발생4차원 이미징

여기서 우리는 생체 내 최대 애벌레와 청소년 단계에서 제브라피시 배아 뇌를 이미지화하는 방법을 제시합니다. 전기 생리학적 접근법에서 채택된 이 미세침습 절차는 성숙한 뉴런의 세포 및 세포 세포 이하 세부 사항에 대한 액세스를 제공하며 뇌 기능 및 약물 개입을 특성화하기 위한 광유전학 및 신경 약리학과 결합될 수 있습니다.

두개골과 피부 제거에 의해 깨어 얼룩말 물고기 애벌레와 청소년에서 완전히 활성 뇌 조직의 생체 내 이미징

여기서, 결과 데이터를 분석하기 위해 상용화된 라이트시트 현미경 및 이미지 프로세싱 워크스테이션을 이용한 안구 형태형성의 타임랩스 이미징을 위한 프로토콜이 제공된다. 이 프로토콜은 배아 마취, 낮은 용융 온도 아가로스에 매립, 이미징 챔버에 서스펜션, 이미징 매개 변수 설정, 마지막으로 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 이미징 데이터를 분석하는 절차를 자세히 설명합니다.

rx3:GFP 형질전환 제브라피쉬를 이용한 라이트시트 현미경으로 안구 형태생성 시각화

학습하세요 제브라 피쉬 유충의 단측 눈 제거 기술로 시각 시스템의 신경 의존적 성장과 발달을 연구하는 방법을. 이 프로토콜은 동일 개체 내 신경 분포와 탈신경 시상 뇌엽을 비교 분석하여 신경 발생, 재생 및 퇴행 메커니즘을 규명합니다.

살아있는 제브라 피쉬 유충의 눈 제거는 시각 시스템의 신경 의존적 인 성장과 발달을 조사합니다.

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