살아있는 제브라 피쉬 유충의 눈 제거는 시각 시스템의 신경 의존적 인 성장과 발달을 조사합니다.

그래서 제 연구실은 눈과 뇌가 어떻게 함께 성장하는지 이해하는 데 관심이 있습니다. 이 기술을 통해 망막 입력이 뇌 성장과 발달에 어떻게 영향을 미치는지 연구 할 수 있습니다. 살아있는 애벌레 제브라 피쉬에서 한쪽 눈을 외과 적으로 제거한 다음 광학 텍텀을 관찰하면 동일한 동물과 동물 전체에서 신경질과 탈질 된 지체 엽을 비교할 수 있습니다.

이 기술을 현대 분자 접근법과 결합하면 신경 발달, 재생 및 퇴행의 기초가되는 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 얻을 수 있습니다. 시작하려면 음극과 양극 전선을 전원 공급 장치에 연결하십시오. 음극선 끝의 악어 클립을 부분적으로 곧게 펴는 종이 클립에 부착하고 종이 클립을 수산화 칼륨 용액에 삽입하여 항아리 측면에 부착하십시오.

양극 와이어의 악어 클립을 바늘 홀더의 목에 부착하십시오. 전원을 약 20V로 돌리고 텅스텐 와이어를 수산화 칼륨 용액에 담그고 와이어를 용액에서 비스듬히 당겨 와이어를 미세한 팁으로 전해로 날카롭게하십시오. 해부 현미경으로 바늘 끝을 확인하여 충분히 날카로운지 확인하십시오.

곡선 바늘 팁은 날카로운 바늘이 페트리 접시에 부드럽게 닿아 구부러질 때 발생합니다. 수술 당일에는 넓은 보어 유리 목초지 피펫을 사용하여 10 ~ 15 마리의 유충을 신선한 E3로 채워진 35 밀리미터 페트리 접시로 옮깁니다. 애벌레에 마취제 세 다섯 방울을 넣으십시오. 유충이 적절하게 마취되었는지 확인하려면 접촉 반응이 부족한지 확인하십시오.

유충이 세 분 후에도 여전히 만지기에 반응하고 재평가되는 경우 마취제를 두 세 방울 더 넣으십시오. 수술을 위해 유충을 고정시키려면 유충 한 마리를 소량의 E3만으로 좁은 보어 유리 목초지 피펫으로 가져 가십시오. 다음으로, 약 200 마이크로리터의 용융된 1%저융점 또는 LMP 아가로스 유충을 함유하는 피펫에 넣고 혼합하여 유충이 LMP 아가로스 내에 현탁되도록 한다. 해부 현미경 아래에 35 밀리미터 페트리 접시의 뚜껑을 올려 놓은 다음 유충과 아가로스를 거꾸로 된 페트리 접시 뚜껑에 쏟아 붓습니다.

애벌레가 방울의 중심에 있도록 아가로스를 퍼뜨립니다. 둔한 텅스텐 바늘을 사용하여 유충을 빠르고 부드럽게 조종하여 한쪽 눈이 위쪽을 향하게하여 측면이되도록하십시오. 아가로스가 설정될 때까지 몇 분 정도 기다립니다.

눈 궤도의 가장자리를 따라 미세하게 전해로 날카롭게 된 텅스텐 바늘의 끝을 사용하여 눈 주위의 피부를 관통하십시오. 그런 다음 눈의 측두엽 - 복부 쪽에서 눈 밑의 바늘 가장자리를 밀어 넣습니다. 제어된 압력을 사용하여 소켓에서 눈을 떼어냅니다.

바늘 옆으로 눈을 등쪽과 앞쪽으로 계속 누르고 결국 시신경을 통해 슬라이스하고 눈을 풀어줍니다. 또는 매우 미세한 수술 포셉을 사용하여 시신경을 꼬집고 눈을 내측에서 옆으로 밀어 눈을 제거 할 수 있습니다. 성공적인 눈 제거 후, MMR 용액으로 아가로스를 덮고, 텅스텐 바늘을 머리 주위와 몸 주위를 부드럽게 닦아서 각 유충을 해방시키고 포셉으로 페트리 접시 뚜껑을 안정화시킵니다.

수술 후 다음 날까지 항생제가 보충 된 MMR 용액에 유충을 넣은 다음 유충을 E3로 돌려 보내고 실험이 끝날 때까지 되돌립니다. 유충이 말기 마취 된 후 4 % 파라 포름 알데히드로 고정하십시오. 해부 현미경으로 밀봉 가드 플레이트 상의 PBS 액적에 고정된 유충을 현탁시킨다.

노토코드를 통해 두 개의 텅스텐 핀을 AGM 영역을 덮고 다른 핀을 AGM 영역을 덮는 착색 된 영역에 후방으로 배치하고 다른 핀을 노른자 연장의 끝과 일치시켜 측면으로 고정하십시오. 날카로운 텅스텐 바늘과 미세한 포셉으로 눈을 제거하십시오. 때로는 바늘을 턱을 통해 반대쪽으로 찌르고 다른 쪽 눈을 제거 할 수 있습니다.

텅스텐 바늘을 사용하여 귀의 측두엽에서 복부 쪽으로 긁으십시오. 움직이는 것과 같은 동작으로 바늘 후방을 턱으로 가져 와서 귀와 턱이 제거 될 때까지 부드럽게 앞쪽으로 당깁니다. 턱을 통해 바늘을 찌르고 다른 눈과 귀를 제거하십시오.

포셉을 사용하여 복부 장기와 남아있는 노른자를 꺼냅니다. 마지막으로, 뒷 뇌와 척수 사이의 교차점 근처의 등쪽 두개골 피부에 얕은 절개를하십시오. 포셉으로 피부를 들어 올리고 전방과 텔렌스팔론 주위를 당깁니다.

포셉으로 남아있는 조직을 제거하십시오. 유충을 핀을 풀고 PBS로 옮겨 1.5 밀리리터 마이크로원심분리 튜브로 옮긴다. 챔버 슬라이드를 진공 그리스로 100mm 페트리 접시의 뚜껑에 고정시킵니다.

면역 염색되고 가공 된 유충을 우물 플레이트 또는 우울증 슬라이드로 옮겨 해부 현미경으로 봅니다. 유충을 1 % LMP 아가 로즈 컬럼의 챔버 슬라이드에 장착하십시오. 피펫을 지나 유리를 사용하여 챔버 슬라이드에 유충 한 마리를 올려 놓고 가능한 한 적은 PBS를 증착하십시오.

동일한 피펫을 사용하여 녹이고 따뜻한 1 % LMP 아가로오스로 유충을 덮으십시오. LMP 아가로스를 컬럼에 피펫 한 다음 유충을 등쪽 표면이 보이는 가능한 한 대칭으로 배치합니다. 눈 제거 후, 망막 축색돌기의 진행성 변성이 광학 텍텀 뉴로필에서 관찰되었다.

수술 후 이틀 후, RFP 라벨이 붙은 축삭은 블래빙과 분열과 같은 빠른 Wallerian 변성의 특징을 나타 냈습니다. RFP 양성 누자는 화살표로 표시된 바와 같이 텍텀의 오른쪽에있는 뉴로필 내외에서 모두 기록되었습니다. 수술 후 나흘 후, 우측 지각 엽에서 파편화된 축삭돌기와 RFP 라벨이 붙은 축삭 파편이 상당히 감소하여 죽어가는 축삭돌기의 비교적 빠른 제거를 나타냅니다.

뇌는 피부와 결합 조직의 눈, 턱, 귀 및 두개골 뚜껑을 해부하여 노출되었습니다. 이상적으로, 뇌는이 과정에서 손상되지 않은 상태로 남아 있습니다. 그러나 앞뇌의 일부, 특히 후각 전구는 피부 또는 턱의 두개골 뚜껑이 제거되었을 때 손상되거나 완전히 제거되었을 가능성이 큽니다.

또한, 때로는 텍텀의 측면 선반이 피부를 관통하거나 꼬집어 뇌에서 떼어 낼 때 슬라이스됩니다. 두 샘플이 동일하지 않습니다. 따라서 필요에 따라 눈 제거와 뇌 해부를 통해 미묘한 적응을 할 수 있어야합니다.

환자와 날카로운 도구는 성공을 위해 필수적입니다. 이 기술은 생체 내 살아있는 세포 이미징 또는 RNA 시퀀싱과 같은 세포 및 분자 접근법을 따라 광학 텍텀 성장 및 개발의 분자 및 세포 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 얻을 수 있습니다.