공동 배양물로부터의 침습적 세포 하위집단의 실시간 검출 및 포획

이 기술은 공동 배양된 기질 세포로부터 분비된 인자의 영향 하에 상이한 침습적 능력을 갖는 세포의 동정을 가능하게 한다. 이 기술은 공동 배양된 기질 또는 면역 세포로부터 분비된 인자가 세포 침윤에 미치는 영향을 평가한다. 또한 이종 세포 혼합물에 존재하는 침습성 세포 하위집단의 회복 및 분석을 허용한다.

이 기술은 어떤 종양이 전이로 이어지는 침습적 세포 하위집단을 보유하는지 결정할 수 있다. 침습성 암세포의 포획 및 분석은 치료 결정을 알릴 수 있다. 세포 배양을 시작하기 위해, 대략 70%컨플루언시를 갖는 부착성 세포 배양물을 1X 포스페이트 완충 식염수로 세척한다.

그런 다음 0.05 % 트립신과 EDTA 용액을 첨가하여 세포를 들어 올립니다. 트립신 용액을 혈청을 함유하는 세포 배양 배지로 중화시키고, 세포 현탁액의 분취량을 사용하여 세포를 계수한다. 세 개의 멸균 챔버를 모두 조직 배양 후드에 놓습니다.

아래쪽 챔버의 짧은 쪽에 있는 손잡이를 찾고 노브가 실험자를 향하도록 아래쪽 챔버의 방향을 지정합니다. 기포를 형성하지 않고 하부 챔버로부터 각 웰에 90 마이크로리터의 배지에 30, 000 내지 50, 000 세포를 첨가한다. 세포 운동성에 대한 양성 대조군으로 두 개의 하부 챔버에서 태아 소 혈청 보충 배지의 5 %를 사용하고 음성 대조군으로 0 % 혈청 보충 배지를 사용하십시오.

후드에서 10 ~ 15 분 동안 정착시킨 후 하부 챔버를 90도에서 회전시킵니다. 그런 다음 중간 챔버를 상단에 배치하여 하단 챔버의 노브가 중간 챔버의 노치로 미끄러지도록하십시오. 어셈블리의 긴 측면 각각에서 딸깍 소리가 들릴 때까지 챔버를 수직으로 아래로 밀어 넣습니다.

중간 챔버의 모든 웰에 160 마이크로 리터의 혈청이없는 배지를 추가하십시오. 우물을 채운 후에 돔 모양의 메니스커스가 보이는지 확인하고 전극이 중간 챔버에 아래쪽을 향하도록 상단 챔버를 배치하여 중간 및 상단 챔버에 파란색 점을 정렬하십시오. 어셈블리의 긴 측면 각각에서 클릭 소리가 들릴 때까지 챔버를 수직으로 누릅니다.

20 ~ 50 마이크로 리터의 무혈청 배지를 상단 챔버에 첨가하십시오. 조립체를 조직 배양 인큐베이터의 이중 용도 세포 분석기에 장착하고 배경을 측정하기 전에 30분 동안 기다렸다. 셀 분석기 소프트웨어를 연 다음 사용할 크래들을 선택한 다음 메시지 탭을 클릭하고 어레이가 크래들에 잘 배치되고 전극이 센서와 잘 정렬되어 있는지 확인하기 위해 연결 확인"이라고 표시되는지 확인하십시오.

실험 노트 탭을 클릭하고 실험에 대한 가능한 모든 정보를 입력합니다. 그런 다음 레이아웃 탭을 클릭하고 배열 레이아웃에 대한 설명을 입력하십시오. 그런 다음 일정 탭을 클릭하고 단계 메뉴에서 두 단계, 한 번의 스윕이있는 배경 단계 및 100 번의 스윕이있는 테스트 단계를 추가하십시오.

어레이가 이중 용도 세포 분석기 인큐베이터에 30 분 동안 있으면 재생 버튼을 클릭하여 배경 측정을 시작하십시오. 배경 측정이 완료되면 크래들에서 어레이를 제거하고 세포 배양 후드에 다시 놓습니다. 그런 다음 100 마이크로리터의 무혈청 배지에 30, 000 내지 50, 000 세포를 상부 챔버의 각 웰에 첨가한다.

이들은 전극이 멤브레인을 통해 성공적으로 이동하면 감지 할 세포입니다. 임피던스 측정을 위해 이중 용도 셀 분석기에 장착하기 전에 조립품을 후드에 30분 동안 방치하십시오. 어레이를 이중 용도 셀 분석기에 다시 배치하고 메시지 탭에서 연결 정상"메시지를 확인합니다.

재생 버튼을 클릭하여 임피던스 측정을 시작한 다음 플롯 탭을 클릭하여 신호의 진행률을 모니터링합니다. 끝점이 25시간 전에 도달하면 실행 드롭다운 메뉴에서 중단 단계를 클릭합니다. 데이터를 내보내려면 그래프를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 목록 형식으로 복사를 선택한 다음 데이터를 스프레드시트에 붙여 넣습니다.

이중 목적 셀 분석기에서 실시간으로 이동 속도를 모니터링하여 관심 지점의 정지 지점을 결정합니다. 일단 달성되면, 조립체를 이중 목적 세포 분석기로부터 마운트 해제하고 조직 배양 후드에 놓는다. 관심있는 웰에서 세포를 수집하기 위해 적절한 수의 1.5 밀리리터의 마이크로 원심분리 튜브를 준비하십시오.

챔버가 분리 될 때 액체를 담기 위해 어셈블리를 10 센티미터 접시에 넣으십시오. 딸깍 소리가 들릴 때까지 중간 챔버의 긴 쪽에있는 유연한 스냅 끝을 안쪽으로 밀어 넣은 다음 상단 챔버를 해체하고 새로운 10 센티미터 접시로 뒤집습니다. 13mm 블레이드가 있는 셀 리프터를 사용하여 동일한 실험 조건을 수용하는 모든 웰에서 세포를 수집합니다.

블레이드를 헹구거나 1X 인산염 완충 식염수에 담그고 세포를 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리 튜브에 모으십시오. 그런 다음 세포를 5분 동안 500배 G에서 스핀다운하고 수집된 세포를 전파하거나 단일 세포 RNA 시퀀싱과 같은 종점 분석을 수행한다. 기질 세포의 존재 또는 부재 하에서의 세포의 침윤의 평가는 MDA-MB-231 세포 침윤이 조사된 Swiss-3T3 섬유아세포 J2 균주가 두 세포주 사이의 인자 교환을 위해 바닥 챔버에 앉았을 때 강화되었다는 것을 보여주었다.

흥미롭게도, MDA-MB-231 침윤은 3T3 J2 세포의 수가 두 배로 증가했을 때 증가하였다. 한편, MCFDCIS 세포의 침습성 클론인 DCIS-Delta Four의 침윤 속도는 3T3 J2 세포와의 누화에 의해 억제되는 것으로 보이며, 이는 스트로마의 다양한 효과를 측정하기 위한 3개의 챔버 어레이의 유용한 적용을 시사한다. 이 경우, 세포 침윤에 섬유 아세포.

인간 탯줄 정맥 내피 세포는 DCIS 세포에 의해 분비되는 것과 달리 MDA-MB-231 세포에 의해 분비되는 인자에 반응하여 더 침습적이었으며, 이는 혈관 형성을 위해 내피 세포를 모집하고 나중에 순환 내로 보급하는 침습성 종양의 능력과 일치한다. 환자 유래 이종이식편 세포는 상부 챔버로부터 침윤되어 공동 배양된 인간 골수 면역 세포에 반응하여 증가하였다. 흥미롭게도, 인간 골수 면역 세포와 함께 바닥 챔버 내의 2%혈청의 존재는 환자 유래 이종이식편 침윤에 필수적이었다.

웰은 기저막 장벽을 모방하기 위해 세포외 매트릭스로 코팅될 수 있다. 치료제는 침윤에 대한 그들의 효과를 모니터링하기 위해 웰 내의 매체에 첨가될 수 있다.