Name: 사카리나 라티시마 배아의 표적 레이저 절제 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: 배우세요 Saccharina latissima 배아의 레이저 절제 기법으로 세포 운명과 상호작용을 정밀하게 연구하는 방법입니다. 이 프로토콜은 갈조류 발생생물학 연구에 신뢰할 수 있는 기초를 제공합니다.

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S.B.의 박사 학위 교부금은 지역 브레타뉴 (ARED 보조금 번호 COH20020)와 소르본 대학 (Sorbonne Université)이 지원합니다. I.T.is PhD 보조금은 지역 브레타뉴 (ARED 보조금 번호 COH18020)와 Norvegian NMBU University가 자금을 지원합니다. 이 프로젝트는 MITI 학제 간 프로그램을 통해 CNRS로부터 재정 지원을 받았습니다. MRic은 프랑스 국립 연구소 (ANR-10-INBS-04)가 지원하는 국가 인프라 France-BioImaging 회원입니다.

1. 사카리나 라티시마 게임토피테스의 생산
<ol><li>앞서 기술한 바와 같이 야생으로부터 S. latissima의 성숙한 포자피테를 수집한다20,21. 선택된 sporophytes에 epiphytes (블레이드 표면에 보이는 작은 유기체) 또는 내부 기생충 (블레이드의 표백 된 부위 또는 반점에서 발견됨)이 없는지 확인하십시오. 
</li>
	<li>메스를 사용하여 블레이드 중앙의 가장 어두운 부분 (비옥 한 포자 생성 조직22)을 1-5 정사각형 조각 (1cm²)으로 자르고 표백 된 반점이있는 경우 피하십시오.</li>
	<li>메스 뒷면과 일부 흡수성 종이로 절단 된 조각을 부드럽게 청소하여 남아있는 epiphytes를 제거하십시오.</li>
	<li>청소된 조각을 멸균된 천연 바닷물로 채워진 유리 접시에 45분 동안 넣어 이전에 발표된 보고서22에 따라 포자를 방출한다.</li>
	<li>블레이드 조각을 제거하고 40 μm 세포 스트레이너를 통해 바닷물을 여과하여 파편이나 원치 않는 유기체를 제거합니다.</li>
	<li>여과액의 포자를 플라스틱 페트리 접시 22에 20-40 포자 / mL 농도로 희석하십시오.</li>
	<li>포자 용액을 최적의 배양 조건(13°C, 24 μE.m-2.s-1, 광주기 16:8 L:D)으로 구성된 배양 캐비닛(자료표 참조)에 놓는다.</li>
	<li>포자가 발아하여 게임 토피트로 발전하도록하십시오. 참고 : 포자 발아는 캐비닛에서 2 일 후에 볼 수 있으며 게임 토피 세포의 첫 번째 세포 분열은 일반적으로 다음 48 시간 이내에 발생합니다.</li>
	<li>5일 후 성장 배지를 0.5x Provasoli 용액(NSW1/2)으로 농축된 미세 여과된 천연 해수로 교체 한다(표 참조). 참고 : 이러한 단계를 반복하지 않기 위해 특정 남성과 여성 gametophytes를 선택하고 몇 달 동안 식물적으로 전파 할 수 있습니다. 게임토피테스는 전술한 동일한 배양 조건에서 적색광(4 μE.m-2.s-1 이상의 파장을 갖는 580 nm)23 하에서 성장할 때 식물성으로 남아있다(단계 1.7).</li>
</ol>2. 난생의 단편화 및 유도
<ol><li>세포 스크레이퍼로 gametophytes를 수확하십시오.</li>
	<li>작은 플라스틱 유모차를 사용하여 수집 된 gametophytes를 1.5 mL 튜브에서 4-5 셀 조각으로 분쇄하십시오.</li>
	<li>튜브를 1mL NSW1/2로 채웁니다(단계 1.9).</li>
	<li>분쇄된 게임토피테 용액 2.5μL를 1x 프로바솔리 용액(NSW)이 풍부한 천연 바닷물 3mL에 넣고 페트리 접시에 넣습니다. 참고: 취급이 용이하도록 25mm의 유리 바닥 페트리 접시를 사용하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>준비된 접시를 배양 캐비닛에 놓고 24 μE.m-2.s-1 (희미한 빛, 광주기 16:8 L:D)의 강도를 갖는 백색광 하에서 13°C에서 게임토제네시스를 유도한다. 참고 : 첫 번째 gametangia (여성 oogonia 및 남성 archegonia)는 5 일 후에 관찰 될 수 있습니다. 수컷은 작은 세포로 과분형이며, 암컷은 긴 필라멘트15,22를 형성하는 더 큰 세포로 구성됩니다. 첫 번째 알은 ~ 10 일 후에 관찰되며, zygotes의 첫 번째 분열은 보통 다음 2 일 이내에 발생합니다.</li>
	<li>첫 번째 달걀을 관찰 한 지 6 일 후, 접시를 더 밝은 백색광 조건으로 옮깁니다 : 50 μE.m-2.s-1, 광주기 16 : 8 L : D, 여전히 13 °C에서.</li>
</ol>3. 절제를위한 배아 선택 및 후속 성장 모니터링을위한 이미지 수집
<ol><li>전체 페트리 접시를 이미지화하여 절제 단계 동안 선택된 배아를 (재)위치시키고(접시를 안구 현미경으로 되돌릴 필요가 없음) 선택된 배아의 후속 발달을 모니터링한다. 참고: 이미징을 위해 거꾸로 된 레이저 스캐닝 공초점 현미경( 재료 표 참조)을 사용하고(그림 1), 레이저 절제술은 5단계에서 설명합니다.</li>
	<li>페트리 접시를 무대에 놓고 시각적 인 표시로 방향을 잡으십시오 (예 : 영구 마커가있는 선을 그립니다).</li>
	<li>배아에 초점을 맞추기 위해 10x/0.45 목표를 사용하십시오. 페트리 접시의 네 가지 기본 포인트의 위치를 기록하십시오.</li>
	<li>타일 스캔을 시작합니다. 256 x 256 픽셀, 양방향 스캐닝을 통한 1.54 μs의 픽셀 체류 시간, 1.2% 전송에서 561nm 레이저를 사용하여 0.6x의 디지털 줌 등 전체 페트리 접시의 전송/형광 이미지를 저해상도로 획득할 수 있습니다. 참고: 전체 2.5cm 페트리 접시의 스캔 시간은 225타일의 경우 최대 6분입니다(그림 2). 여기서, 561 nm 레이저를 투과 및 형광 이미징에 사용하였다. 형광 신호는 공초점 광배수 (PMT)에서 580-720 nm 사이에서 수집되었고 투과 된 빛은 투과 된 PMT에서 수집되었습니다. 561nm 레이저는이 단계에서 엽록소를 모니터링 할 수도 있지만 신호 잡음과 유기체를 올바르게 구별하는 데 도움이되기 때문에 불필요합니다.</li>
	<li>타일 스캔 이미지를 저장하고 이미지 수집 소프트웨어( 자료 표 참조) 창에서 열어 둡니다.</li>
	<li>목표를 변경하고, 페트리 접시를 제거하지 마십시오. 참고: 40x/1.2 물 목표는 스테이지 측면으로 이동되어 페트리 접시를 초기 위치에서 움직이지 않고도 침지 매체(물)를 목표에 추가할 수 있었습니다.</li>
	<li>이전에 획득한 타일 스캔 이미지를 탐색하여 적절한 배아를 선택합니다. 이 이미지에서 배아가 확인되면 단계를 배아의 정확한 위치로 이동하고 해당 배아의 전송 / 형광 이미지를 고해상도로 획득하십시오. 참고: 고해상도 설정: 512 x 512 픽셀, 0.130 μm/픽셀, 단방향 스캐닝을 통한 0.208 μs 픽셀 체류 시간 및 0.9% 전송에서 561nm 레이저를 사용하는 2x 디지털 줌.</li>
	<li>레이저 절제를 위해 각 배아 후보에 대한 타일 스캔 이미지에 주석을 달고(도 2B) 레이저 절제 단계를 진행한다.</li>
</ol>4. 레이저 교정
<ol><li>레이저를 교정하고 이미지 수집 소프트웨어를 "Click & Fire 모드"의 레이저 드라이버 소프트웨어 및 펄스 355nm 레이저와 동기화합니다. 참고: 이 단계는 레이저 드라이버 소프트웨어에서 마우스 커서의 위치( 자료 표 참조)와 획득 소프트웨어의 라이브 이미지 위치 간의 완벽한 동기화를 보장하는 데 매우 중요합니다.</li>
	<li>레이저 드라이버 소프트웨어 패키지를 열고 이미지 수집 소프트웨어 패키지에서 라이브 를 클릭하십시오.</li>
	<li>레이저 드라이버 소프트웨어 패키지에서 획득 시작 을 클릭하여 두 소프트웨어 패키지를 동기화합니다. 라이브 이미지는 이제 UV 레이저 드라이버 소프트웨어에도 기록됩니다.</li>
	<li>AOI 선택 버튼을 클릭하고 UV 레이저 드라이버 소프트웨어 패키지에서 이미지의 가장자리(오른쪽, 왼쪽, 위쪽 및 아래쪽)를 클릭하여 관심 영역( AOI )을 정의합니다. 참고: 이 보정 단계 후에는 획득 소프트웨어 패키지의 픽셀 크기, 이미지 형식 및 확대/축소에 대한 설정이 일정하게 유지되어야 합니다.</li>
	<li>접시에서 빈 영역을 선택하고 스테이지 레벨을 샘플 초점면 아래 20μm로 낮추어 유리 바닥에 초점을 맞춥니다.</li>
	<li>교정 시작 을 클릭하여 절제 레이저 및 이미징 레이저 궤적을 설정하고 수동 교정을 선택합니다.</li>
	<li>유리 커버슬립의 구멍에 해당하는 라이브 이미지 중앙에 검은 점이 보이도록 충분히 높은 레이저 파워를 선택합니다(모든 셔터는 열려 있어야 함).</li>
	<li>마우스 커서로이 중앙 검은 점을 클릭하고 소프트웨어에서 제안한 18 개의 추가 점을 클릭하여 정렬 절차를 완료하십시오.</li>
	<li>동일한 커버슬립의 "Click & Fire 모드"에서 보정을 확인하십시오. 참고: 레이저 보정은 이미징 파라미터에 따라 다릅니다. 레이저가 보정되면 이미징 파라미터(예: 단방향 스캐닝 및 2x 디지털 줌을 사용한 512 x 512픽셀, 0.130μm/픽셀, 0.208μs 픽셀 체류 시간)가 변경되지 않았는지 확인하십시오.</li>
</ol>5. 레이저 절제
<ol><li>관심있는 배아를 선택하십시오. 이미지 수집 소프트웨어에서 타임랩스 녹화를 시작합니다.</li>
	<li>고해상도에서 40x/1.2W 대물렌즈로 전송/형광 이미지를 획득합니다(즉, 512 x 512 픽셀, 0.130 μm/픽셀, 단방향 스캐닝을 통한 1.54μs 픽셀 체류 시간 및 0.9% 전송에서 561nm 레이저를 사용한 2x 디지털 줌). 최대 속도로 타임랩스 레코딩을 획득합니다.</li>
	<li>타임랩스 녹화가 시작될 때 영역을 축소합니다. AOI를 확대합니다.</li>
	<li>레이저 드라이버 소프트웨어의 "Click & Fire" 기능을 사용하여 배아에 관심 있는 세포에 손상 조사를 적용합니다. 45% 레이저 투과율(최대 40μW에 해당) 및 1ms 펄스 시간 지속 시간(단계 4)과 같은 파라미터를 사용합니다. 참고: 레이저 촬영 중 비디오 녹화를 권장합니다.</li>
	<li>688 nm 하에서, 세포질로부터 자가형광 엽록체의 배출을 모니터링한다.</li>
	<li>셀 내용이 셀에 남아 있으면 "Click & Fire" 기능을 다시 한 번 사용하여 셀의 위반 크기를 늘리십시오. 대부분의 셀 내용이 해제될 때까지 샷 수를 최소한으로 유지하면서 반복하십시오.</li>
	<li>배아가 안정화된 후에 타임랩스 기록을 중단한다(즉, 더 이상의 세포내 이동은 검출될 수 없다(∼1-5분).</li>
	<li>필요한 경우 타일 스캔 이미지의 주석을 업데이트합니다.</li>
</ol>6. 조사된 배아의 성장 모니터링
참고: 모니터링은 며칠 동안 수행됩니다.
<ol><li>레이저 절제 후 발생하는 배아의 수를 모니터링하여 생존율을 결정하고 죽는 배아와 비교하십시오. 참고 : 일부 배아는 여러 가지 이유로 절제 직후에 사망합니다. 높고 빠른 사망률은 일반적으로 부적절한 레이저 매개 변수 또는 실험 또는 후속 운송 중 스트레스에 더 높거나 더 오래 노출된다는 신호입니다.</li>
	<li>매일 레이저 샷 배아의 길이를 측정하고 손상되지 않은 배아와 비교하여 성장 지연을 결정하십시오. 참고 : 레이저 샷 유기체의 성장 속도는 일반적으로 처리되지 않은 유기체의 성장 속도보다 느립니다. 그러나 일부 (부적절한) 레이저 설정은 일주일 이상 성장을 억제 할 수 있으며 그 후에 성장이 재개됩니다.</li>
	<li>절제된 세포에 인접한 세포의 반응을 모니터링함으로써 인접한 손상을 알아내라. 어떤 경우에는 파열 후 감압으로 인해 이웃 세포가 파열될 수 있습니다.</li>
	<li>미생물 오염을 확인하십시오. 배지에서 미세조류와 박테리아의 성장을 모니터링합니다. 접시에 비정상적인 수준의 미생물이 있으면 폐기하고 2 단계 또는 3 단계의 프로토콜을 반복하십시오. 참고: 레이저 절제 후, 손상된 S. latissima 배아는 이미 높은 스트레스를 받고 있으며, 추가적인 외부 스트레스로 인해 사망률이 증가할 수 있습니다. 박테리아 또는 바이러스 발생은 치료 된 배아가 축 상태에서 자랄 수 없기 때문에 가능합니다.</li>
	<li>표현형을 연구하고 표적 부위의 발달에 대한 역할을 이해함으로써 샷 유기체의 글로벌 개발을 확인하십시오.</li>
</ol>

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<li>Ebbing, A., Pierik, R., Bouma, T., Kromkamp, J. C., Timmermans, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+light+and+biomass+density+influence+the+reproduction+of+delayed+Saccharina+latissima+gametophytes+%28Phaeophyceae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Phycology%22%5BJournal%5D)">How light and biomass density influence the reproduction of delayed Saccharina latissima gametophytes (Phaeophyceae).</a> Journal of Phycology. 56 (3), 709-718 (2020).</li>
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국소 세포 레이저 절제술은 높은 수준의 정밀도로 시간적, 공간적 절제를 허용합니다. 그러나, 그의 효율은 표적 세포의 접근성 불능에 의해 방해받을 수 있다; 예를 들어, 모든 세포는 입체 배아로 되어 있다. 이 프로토콜은 alga Saccharina latissima의 배아에서 개발되었으며, 모든 세포를 쉽게 구별하고 레이저 빔으로 개별적으로 파괴 할 수있는 단층 라미나를 개발합니다.
레이저 파워와 파장 NIR fs-펄스 레이저는 일반적으로 동물24,25에 대한 발달 연구에 사용됩니다. 그러나 사카리나 (Saccharina)와 같은 갈조류의 경우, 레이저는 전체 배아를 태우지 않고 세포를 파열 할 수 없었습니다. 이 반응은 엽록체 광 수확기의 높은 활성과 관련이있을 수 있습니다.
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레이저 절제는 배아 발달을 연구하기 위해 수십 년 동안 사용되어 왔습니다. 레이저 빔으로 배아 세포를 조사하면 배아 발생 동안 세포 계보의 재생 잠재력 및 변형을 모니터링하고 세포 분열 및 세포 운명에 대한 표적 절제의 영향을 조사 할 수 있습니다. 레이저 절제 방법에 사용되는 모델 유기체는 전형적으로 동물, 예컨대 곤충 1,2, 선충류 3,4, 척추동물 5,6, 및 때때로 식물 7,8이다. 또한, 레이저 미세 절제 접근법이 초기 배아 9,10의 광분극에서 세포벽의 역할을 입증하기 위해 1994 년과1998 년에 갈색 알가 푸쿠스에 사용되었다.
갈색 조류는 1.6 억 년 전에 진핵 나무의 뿌리에서 갈라진 Stramenopiles 그룹에 속합니다. 결과적으로, 이들은 동물 및 식물(11)과 같은 다른 다세포 유기체와 계통유전학적으로 독립적이다. Saccharina latissima는 다시마로 더 일반적으로 알려진 Laminariales 순서에 속하며 지구상에서 가장 큰 유기체 중 하나이며 30m 이상의 크기에 도달합니다. Saccharina sp.는 식품 및 사료와 같은 많은 응용 분야에 사용되는 대형 해초이며 다당류는 전 세계 농업, 약리학 및 화장품 산업에 사용하기 위해 추출됩니다12, 13. 주로 아시아에서, 그리고 최근에는 유럽에서 재배를하기 위해서는 바다에서 청소년을 방출하기 전에 부화장에서 배아를 준비해야합니다. 모든 켈프와 마찬가지로, 그것은 반수체 gametophyte가 성장하고 수정을위한 게이머를 생산하는 현미경 게임 토피틱 단계로 구성된 이단계 생활주기와 큰 평면 블레이드가 해저 또는 암석에 부착 된 홀드 패스트에서 발달하는 이배체 거시적 인 산포 성 단계. 스포로피테는 성숙 시에 반수체 포자를 방출하여 수명주기14,15,16을 완료한다.
S. latissima는 몇 가지 흥미로운 형태학적 특징을 제시한다17. 그것의 배아는 다른 조직 유형의 출현과 일치하는 다층 구조를 획득하기 전에 단층 평면 시트15,18,19로 발전합니다. 또한, Laminariales는 배아가 모성 게임 피텍 조직에 붙어있는 갈색 조류의 유일한 택시 중 하나입니다 (Desmarestiales와 Sporochnales도15 세입니다). 이 기능은이 발달 과정에서 모성 조직의 역할을 연구하고 갈조류의 모성 조절 메커니즘을 동식물의 모성 조절 메커니즘과 비교할 수있는 기회를 제공합니다.
이 기사는 초기 다시마 배아에서 레이저 절제를위한 최초의 완전한 프로토콜을 제시합니다. UV ns-펄스 기술을 포함하는 이 프로토콜은 배아 발생 동안 각각의 역할을 연구하기 위해 개별 배아 세포의 특이적 파괴를 초래한다. 이 절차는 Laminariales에서 배아 발생 중 세포 상호 작용과 세포 운명을 조사하기위한 신뢰할 수있는 접근법을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>25mm 유리 바닥 페트리 접시</td><td>NEST</td><td>801001</td><td></td></tr><tr><td>오토클레이브 해수</td> <td>-</td><td></td> <td>Astan 부표 근처 연안에서 수집 (48&deg; 44.934 N 003&deg; 57.702 W) 프랑스 로스코프(Roscoff)에서 20m 깊이로 가깝습니다.</td></tr><tr><td>셀 스크레이퍼</td><td>MED 2</td><td>83.3951</td><td></td></tr><tr><td>셀 스트레이너 40 & 마이크로; m</td><td>코닝/팔콘</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>문화 장</td><td>Snijders 과학적인 식물 성장 내각 ECD01</td><td></td><td>다른 어떤 상표든지 가벼운 광도, 광주기 및 온도를 통제될 수 있다</td></tr> 조건으로 적당합니다.<tr><td>LSM 880 Zeiss 컨포칼 현미경</td><td>Carl Zeiss 현미경, 독일</td><td></td> 예나 <td>절제 및 이미징은 40x/1.2 물 대물</td></tr>렌즈 <tr><td>펠릿 절굿공이</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z359947</td><td>Blue 폴리프로필렌(오토클레이브 가능)</td></tr><tr><td>Provasoli 보충제</td><td></td><td></td>를 사용하여 수행되었습니다.<td> http://www.sb-roscoff.fr/sites/www.sb-roscoff.fr/files/documents/station-biologique-roscoff-preparation-du-provasoli-2040.pdf</td></tr><tr><td>펄스 355 레이저 (UGA-42 Caliburn 355/25)</td> <td>Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>메스</td><td>파라마운트</td><td>PDSS 11</td><td></td></tr><tr><td>SysCon 소프트웨어</td><td>Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany</td><td></td><td>레이저 드라이버 소프트웨어</td></tr><tr><td>ZEN 소프트웨어</td><td>Carl Zeiss 현미경, 예나, 독일</td><td></td><td>SysCon 소프트웨어와 함께 사용되는 이미징 소프트웨어; 블랙 2.3 버전</td></tr></tbody></table>

사카리나 라티시마 배아의 표적 레이저 절제

Targeted Laser Ablation in the Embryo of Saccharina latissima

Saccharina latissima에서 배아는 lamina 또는 블레이드라고 불리는 단층 세포 시트로 발전합니다. 각 배아 세포는 관찰하기 쉽고, 이웃과 쉽게 구별 할 수 있으며, 개별적으로 타겟팅 될 수 있습니다. 수십 년 동안 레이저 절제는 배아 발달을 연구하는 데 사용되어 왔습니다. 여기서, 갈색 알가 S. 라티시마의 초기 배아를 위해 세포 특이적 레이저 절제를위한 프로토콜이 개발되었다. 제시된 연구에는 (1) 배양 조건을 포함한 중요한 매개 변수에 대한 설명과 함께 사카리나 배아의 준비, (2) 레이저 절제 설정, (3) 타임랩스 현미경을 사용하여 조사 된 배아의 후속 성장 모니터링이 포함됩니다. 또한, 이미징 플랫폼에서 실험실로 배아를 다시 운반하기위한 최적의 조건에 대한 세부 사항이 제공되며, 이는 후속 배아 발달에 중대한 영향을 줄 수 있습니다. Laminariales 순서에 속하는 조류는 Saccharina와 유사한 배아 발생 패턴을 표시하며; Algae belonging to the order Laminariales display embryogenesis pattern similar to Saccharina; 따라서 이 프로토콜은 이 분류에서 다른 종으로 쉽게 옮겨질 수 있다.

S. latissima의 Gametophytes가 성장되었고, gametogenesis는 zygotes와 embryos를 생산하도록 유도되었다. 게임 발생의 유도 후 열두 일, 배아는 레이저 절제를 받았다. 여기서, 실험은 S. latissima 배아의 전반적인 발달에서 특정 세포의 역할을 평가하는 것을 목표로했다. 가장 정점 세포, 가장 기저 세포, 및 중앙값 세포를 표적으로 삼았다. 타일 스캐닝 후, 관심있는 배아인 페트리 접시 전체(도 2A)를 레이저 촬영에 적합한 후보로 확인하였다(도 2B). 이 배아의 특정 세포를 선택하고, 표적화하고, 1ms 동안 최대 40μW의 레이저 파워(여기에 사용된 장비의 최대 전력의 45%에 해당)를 갖는 펄스 UV 레이저 빔으로 촬영하였다(무비 1). 세포는 내용물 (엽록체와 세포질)을 방출했...

배아에서 특정 세포의 파괴는 세포 운명과 관련된 세포 상호 작용을 연구하기위한 강력한 도구입니다. 본 프로토콜은 갈색 알가 사카리나 라티시마의 초기 배아에서 표적화된 세포의 레이저 절제술을 위한 기술을 기술한다.

In Saccharina latissima, the embryo&#160;develops as a monolayered cell sheet called the lamina or the blade. Each embryo cell is easy to observe, readily ...

이 프로토콜은 초기 다시마 배아에 대한 최초의 완전한 레이저 절제 프로토콜입니다. 이 절차는 갈조류에서 배아 발생 중 세포 운명과 상호 작용을 조사하는 데 신뢰할 수있는 접근법을 제공합니다. 국소 세포 레이저 절제술은 세포에 높은 수준의 정밀도와 조직으로 시간적 및 특수 절제를 허용합니다.이 접근법은 갈조류의 초기 배아에서 세포 운명과 상호 작용을 연구하는 유망한 방법입니다. 그것은 거의 변화없이 다른 조류 시스템에 적용될 수 있습니다. 먼저 전체 페트리 접시를 이미징하여 절제 단계 동안 선택을 위한 배아를 찾고 선택된 배아의 후속 발달을 모니터링한다.타일 스캔을 시작합니다. 페트리 접시의 네 가지 기본 포인트의 위치를 기록하십시오. 텍스트 원고에 정의 된대로 매개 변수를 입력하고 낮은 해상도로 전체 Petri 접시의 전송 또는 형광 이미지를 획득하십시오.타일 스캔 이미지를 저장하고 이미지 획득 소프트웨어 창에서 열린 상태로 유지합니다. 페트리 접시를 제거하지 않고 목표를 변경하십시오. 스캔에서 관심있는 배아를 찾으십시오.레이저를 보정하려면 레이저 드라이버와 이미지 수집 소프트웨어 패키지를 엽니다. 그런 다음 레이저 경로를 초기화합니다. 레이저 드라이버 소프트웨어 패키지에서 획득 시작을 클릭하여 두 소프트웨어 패키지를 동기화합니다.레이저 절제를위한 매개 변수를 설정하고 라이브를 클릭하십시오. 접시에서 빈 영역을 선택하고 무대 레벨을 페트리 접시의 윗면 아래 20 마이크로 미터로 낮추어 유리 바닥에 초점을 맞 춥니 다. AOI 선택 버튼을 클릭하고 UV 레이저 드라이버 소프트웨어 패키지에서 이미지의 가장자리를 클릭하여 관심 영역을 찾으려면교정 시작을 클릭하고 수동 교정을 선택하여 절제 레이저 및 이미징 레이저 궤적을 설정합니다. 모든 셔터가 열려 있는지 확인합니다. 유리 커버 슬립의 구멍에 해당하는 라이브 이미지의 중앙에 검은 점을 볼 수 있을 만큼 충분히 높은 레이저 파워를 선택하십시오.마우스 커서가있는 중앙 검은 점을 클릭하고 소프트웨어에서 제안한 18 개의 추가 점을 선택하여 정렬 절차를 완료하십시오. 클릭 및 화재 모드를 클릭하십시오. 동일한 커버 슬립에서 교정을 확인하고 레이저 충격이 보이는 유리 층을 클릭하십시오.타일 스캔에서 관심있는 배아를 선택하고 클릭하여 단계를 이동하십시오. 시계열을 시작합니다. 라이브에서 시간 경과 매개 변수를 테스트하고 필요한 경우 조정하십시오.최대 속도로 이미지 수집 소프트

targeted-laser-ablation-in-the-embryo-of-saccharina-latissima

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

사파이어 femtosecond 레이저 발진기 : 메소드는 티에서 두 광자 흡수를 사용하는 형광 단백질 갇힌를 포함하는 단일 세포를 photoactivate에 설명되어 있습니다. 운명의지도 photoactivated 세포는 immunohistochemistry가 사용됩니다. 이 기술은 모든 세포 유형에 적용할 수 있습니다.

Zebrafish의 단세포 운명 매핑

여기에 제시된 방법은 고 에너지 레이저 펄스와 시간을 통해 이러한 부상과 회복의 후속 분석 라이브 zebrafish 배아의 정확한 부상을 포함한다. 우리는 또한 유전자 하나의 표시 또는 골격근 세포의 그룹이 동안 레이저 광 유도 손상 후 추적 할 수있는 방법을 보여줍니다.

Zebrafish 배아 골격근의 레이저 쏜 부상

출처: Morsch, M.,   et. al., Triggering cell stress and death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy. J. Vis. 특급. (2017) 이 비디오에서는 형질전환 제브라피시의 개별 뉴런을 정확하게 표적화하고 연구하기 위한 고강도 UV 레이저 절제 기술을 살펴봅니다. 우리는 신경 반응을 준비하고, 고정하고, 시각화하는 방법을 보여주며, 부상과 회복의 세포 역학을 강조합니다.

컨포칼 현미경을 사용한 제브라피시 유충의 선택적 단일 뉴런 레이저 절제

출처: Muto, A., et al. 이광자 레이저를 사용한 신경 세포 집단의 절제 및 제브라피시 유충의 칼슘 이미징 및 행동 기록을 사용한 평가.J. Vis. Exp. (2018) 이 비디오에서,  이광자 레이저 절제 절차가 시연되어 아가로스에 고정된 제브라피시 유충에서 형광 뉴런을 선택적으로 파괴할 수 있습니다. 시술 전후의 고해상도 이미징은 형광의 부재로 관찰되는 바와 같이 효율적인 신경 손상을 확인합니다.

제브라피시 라라바(Larava)에서 이광자 현미경을 사용한 표적 신경 세포 절제

amphipod Parhyale의 hawaiensis 갑각류 발생학 및 비교 절지 동물의 개발과 진화 연구를위한 유망한 모델 생물이다. 이 프로토콜은 Parhyale의 초기 분열 단계의 배아에서 단일 할구를 수동으로 제거하는 방법을 설명합니다.

Amphipod 갑각류의 여덟 세포 배아에서 단일 셀의 절제<em&gt; Parhyale hawaiensis</em

이 프로토콜은 농장 동물 접합자에서 세포질 미세주입을 수행하는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 녹아웃 동물을 생성하기 위한 게놈 편집 도구와 같은 단일 세포 배아에 모든 솔루션을 전달하는 데 사용할 수 있습니다.

레이저를 이용한 가축 접합체의 세포질 미세 주입을

레이저 절제는 생물학적 시스템의 재생을 연구하는 데 널리 적용되는 기술입니다. 제시된 프로토콜은 제브라피시 측면에서 신경마비 세포를 재생시키는 레이저 절제 및 후속 시간 경과 화상 진찰을 위한 표준 레이저 스캐닝 공초점 현미경의 사용을 설명합니다.

제브라피시 간 신경종 세포의 공초점 현미경 기반 레이저 절제 및 재생 분석

배아 발달은 세포 운동의 대규모 조정을 요구합니다. 2광자 포동 중재 레이저 절제는 심층 세포의 큰 그룹의 공간 적으로 제어 된 3 차원 절제를 허용한다. 또한, 이 기술은 생체 내에서 집단적으로 이동하는 세포의 반응을 기계적 환경에서 의 동요로 조사할 수 있다.

얼룩말 피시 가스트룰라의 2광자 현미경을 사용하여 깊고 공간적으로 제어된 볼륨 절제

본 프로토콜은 유충 취급을 위한 자동화된 미세유체 플랫폼과 결합된 레이저 병변 시스템을 사용하여 제브라피쉬 유충에서 조직 특이적이고 재현성이 높은 부상을 유도하는 방법을 기술한다.

제브라피쉬 유충의 척수 재생 연구를위한 제어 된 반자동 레이저 유도 부상

이 프로토콜은 온전한 Drosophila 유충에서 개별 뉴런의 레이저 세포 절제를 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 발달 중인 신경계에서 뉴런 간의 경쟁을 줄이는 효과를 연구할 수 있습니다.

온전한 Drosophila 유충의 레이저 세포 절제는 시냅스 경쟁을 보여줍니다.

이 프로토콜은 제브라피시 유충에서 수행된 이광자 레이저 절제 접근법을 설명하며, 이는 뼈 재생과 절제에 대한 면역 반응의 효과를 연구하기 위한 모델 역할을 합니다.

발달 중인 제브라피시 유충에서 조골세포의 Two-photon 레이저 매개 절제

배우세요 Saccharina latissima 배아의 레이저 절제 기법으로 세포 운명과 상호작용을 정밀하게 연구하는 방법입니다. 이 프로토콜은 갈조류 발생생물학 연구에 신뢰할 수 있는 기초를 제공합니다.

사카리나 라티시마 배아의 표적 레이저 절제

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