Name: CD226의 발현을 검출하기 위해 마우스 비강 점막에서 그룹 2 선천성 림프 세포 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: 배우세요 마우스 비강 점막에서 ILC2를 분리하고 CD226 발현을 검출하는 방법을. 이 기술은 알레르기 비염 연구와 면역학 연구에 활용됩니다.

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R.Z.는 중국 국립 자연 과학 재단 (No. 81871258)과 제 4 군 의과 대학 (No.2020rcfczr)이 제공 한 기금의 지원을 받았습니다. Y.Z.는 산시성 자연과학 기초 연구 프로그램(No. 2021JM-081)의 지원을 받았습니다.

모든 실험은 실험동물의 관리 및 사용 가이드라인에 따라 수행하였다. 모든 절차와 프로토콜은 제 4 군 의과 대학 과학 연구 윤리위원회 (No. 20211008)의 승인을 받았습니다.
1. Murine AR 모델 구축
<ol><li>특정 병원체가 없는 조건에서 8-12주령의 수컷 및 암컷 야생형(WT) C57BL/6 마우스를 기숙하고 표준 실험실 차우와 물을 제공합니다.</li>
	<li>무균 상태를 유지하기 위해 깨끗한 벤치에서 2mg의 수산화알루미늄을 함유한 0.2mL의 멸균 PBS에 50μg의 오브알부민(OVA)을 유화합니다. 0일, 7일 및 14일에 암컷 또는 수컷 마우스에 각각 50μg의 유화된 OVA를 복강 주사합니다.</li>
	<li>21일, 22일, 23일, 24일 및 25일에 흡입 마취(산소 유량 또는 0.5L/min).</li>
	<li>마지막 챌린지 후 24시간(26일째)에 마우스를 안락사시킵니다.</li>
</ol>2. 코 점막에서 단핵 세포 (MNC)의 분리
<ol><li>깊은 마취 하에서 자궁 경부 탈구에 의해 마우스를 안락사시킨다. 생쥐 머리를 75 % 에탄올에 5 분 동안 담그고 에탄올이 외부 콧 구멍으로 들어 가지 않도록하십시오. 복부를 수술대에 아래쪽으로 놓습니다.</li>
	<li>앞니를 잘라내십시오. 머리의 정중선을 절개하고 가위로 피부를 자릅니다.</li>
	<li>아래턱을 제거하고 입천장 끝을 따라 코 전체를 잘라낸 다음 조직을 얼음처럼 차가운 PBS 5mL가 들어 있는 60mm 페트리 접시에 넣습니다. 가위와 집게를 사용하여 뼈에 붙어있는 살과 근육을 제거하십시오.</li>
	<li>마우스 코를 얼음처럼 차가운 PBS 5mL가 들어 있는 새로운 60mm 페트리 접시로 옮깁니다. 얼음처럼 차가운 PBS 5mL로 뼈를 두 번 씻으십시오.</li>
	<li>코를 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>코를 충분히 부수고 2mL의 예열 소화 완충액(1mg/mL의 콜라게나제 IV 및 10U/mL DNase I이 보충된 RPMI 1640 배지)이 들어 있는 15mL 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>뚜껑을 덮고 튜브를 37°C의 오비탈 셰이커에 수직으로 놓고 120-150rpm에서 40분 동안 계속 교반합니다. 참고: 소화 완충액을 37°C로 예열하여 최고의 효소 활성을 달성하십시오.</li>
	<li>10% 소 태아 혈청(FBS)이 포함된 얼음처럼 차가운 RPMI 1640 배지 5mL를 추가하여 소화 과정을 중지합니다.</li>
	<li>70μm 셀 스트레이너를 통해 여과하여 고체 조각을 제거합니다.</li>
	<li>500 x g 에서 5분 동안 원심분리한 다음 상층액을 부드럽게 버립니다.</li>
	<li>펠릿을 얼음처럼 차가운 RPMI 1640 배지에 다시 현탁하고 500 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 부드럽게 버립니다.</li>
	<li>40% 밀도 구배 배지 4mL(10x PBS 160μL + 밀도 구배 배지 원액 1.44mL + RPMI 1640 배지 2.4mL)에 세포 펠릿을 재현탁합니다.</li>
	<li>파스퇴르 피펫을 튜브 바닥에 부드럽게 삽입하고 80% 밀도 구배 배지 2.5mL(10x PBS 200μL + 밀도 구배 배지 원액 1.8mL + RPMI 1640 배지 0.5mL)를 천천히 추가합니다.</li>
	<li>원심분리기의 가속 및 감속 속도를 3단 기어보다 낮게 설정하고 원심분리기를 400 x g 로 상온(RT)에서 15분 동안 조절한다.</li>
	<li>잠재적인 오염을 방지하기 위해 계면에서 세포를 배출하기 전에 불순물의 최상층을 제거하십시오. 피펫을 사용하여 40%/80% 밀도 구배 배지 계면의 단핵 세포(MNC) 층을 2mL의 얼음처럼 차가운 PBS가 들어 있는 15mL 튜브로 조심스럽게 배출합니다. 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 두 번 세척합니다.</li>
</ol>3. FCM 분석을 위한 표면 염색
<ol><li>세포를 수확하고, 4°C에서 5분 동안 500 x g 에서 원심분리한다. 세포 펠렛을 염색 완충액(2% FBS 및 0.1%NaN3로 보충된 PBS)에 재현탁하고, 4°C에서 5분 동안 500 x g 에서 원심분리하였다. 상청액을 버리십시오. 주의 : 염색 완충액을 준비할 때 주의하십시오. NaN3는 매우 독성이 강하며 삼키거나 흡입하거나 피부에 접촉하면 장기에 손상을 줄 수 있습니다. 또한 환경으로의 방출을 피하십시오.</li>
	<li>튜브당 80μL 블로킹 용액(염색 완충액에 희석된 항-CD16/32 항체(1:100))에 세포를 재현탁합니다. 4°C의 어두운 곳에서 30분 동안 배양합니다.</li>
	<li>세척하지 않고 표면 염색 항체 칵테일의 적절한 희석액 20μL를 추가합니다(표 1).</li>
	<li>항체 칵테일을 샘플에 추가하기 직전에 고정 가능한 생존도 염료 520(FVD) 1μL(테스트당)을 추가합니다. 4°C의 어두운 곳에서 30분 동안 배양합니다. 일치하는 이소타입 항체와 형광 마이너스 1(FMO)을 음성 대조군으로 설정합니다.</li>
	<li>4°C에서 5분 동안 500 x g 에서 원심분리하여 500 μL의 염색 완충액으로 세포를 세척한다.</li>
	<li>세포 펠릿을 200μL의 염색 완충액에 재현탁합니다. 50 μL의 vortexed absolute counting beads를 염색된 세포에 넣고 교반합니다. 유세포 분석(FCM) 분석을 실시합니다. 참고: FCM 데이터는 스펙트럼 세포 분석기를 사용하여 얻었고 유세포 분석(FCM) 분석 소프트웨어로 분석했습니다.</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

ILC2는 제2형 염증 및 염증성 질환과 밀접한 관련이 있으며, 이는 점점 더 많은 연구에서 입증되고 있습니다. 마우스 모델과 인간 관찰 모두 상기도에서의 기능을 더 잘 이해하는 데 기여합니다. 천식 병태생리학에서 ILC2는 주로 상피 세포에서 생성되는 흉선 기질 림프포이에틴, IL-25 및 IL-33을 통해 활성화됩니다. 그런 다음 Th2 세포를 미러링하여 ILC2는 IL-4, IL-5 및 IL-13을 생성하여 유형 2 염증을 악화시킵니다32. 또한, ILC2의 상이한 하위세트는 또한 IL-10 및 IL-1733,34,35를 생성한다. AR은 또한 제2형 세포에 의해 유발되는 기도 알레르기 염증의 한 유형입니다. AR 병태생리학에서 ILC2의 참여는 최근14에서 입증되었습니다....

그룹 2 선천성 림프 세포(ILC2s)는 생쥐의 복강 조직에서 처음 발견되었고, 이후 혈액 및 폐, 피부 및 비강과 같은 다른 말초 조직에 존재하는 것으로 입증되었다 1,2,3. 조직 상주 세포로서 ILC2는 주로 국소적으로 유지 및 증식되며 수많은 제2형 사이토카인을 생성하고 제2형 면역을 유도하여 외인성 유해 자극에 반응하는 첫 번째 가드 역할을 합니다 4,5,6. ILC2는 또한 감염된 조직으로 인신매매를 함으로써 그 효과를 발휘할 수 있다 7,8.
T-헬퍼 2(Th2) 세포와 유사하게, ILC2의 복잡한 조절 네트워크는 기도 알레르기 질환을 포함한 다양한 제2형 염증성 질환의 진행에 중요한 관여를 보장합니다 8,9. 천식에서 상피세포 유래 알람민은 인터루킨(IL)-4, IL-5, IL-13의 분비를 통해 폐 염증을 촉진하는 ILC2를 활성화시킬 수 있다10. 임상 연구에서도 중증 천식 환자의 객담과 혈액에서 ILC2 수치가 유의하게 상승한 것으로 나타났으며, 이는 ILC2가 천식 중증도와 천식 진행의 예측 인자로서의 기능과 관련이 있음을 시사한다11.
알레르기성 비염(AR)은 매년 수백만 명의 사람들에게 영향을 미치는 흔한 만성 염증성 질환이며, 이 질환에 대한 효과적인 치료법은 제한적이다12,13. ILC2는 감작 단계 또는 증상 생성 및 염증 단계14에서 AR의 병태생리학에서 중요한 역할을 합니다. AR 환자의 경우, 말초 혈액 내 ILC2 수치가 국소 및 전신적으로 상승하는 것으로 보고되었다15. 그러나 AR의 병태생리학 및 진행에 대한 ILC2의 특정 효과와 기본 메커니즘은 여전히 추가 탐색이 필요합니다.
CD226 - 공동자극 분자 역할을 하는 막횡단 당단백질 - 은 주로 자연 살해(NK) 세포, T 세포 및 기타 염증성 단핵구에서 발현됩니다16,17. CD226과 그의 리간드 (CD155 및/또는 CD112) 또는 경쟁자 (TIGIT)의 상호작용은 다양한 면역 세포의 생물학적 기능에 참여할 수 있게 한다18. 세포독성 림프구 (CTL) 상의 CD226에 대한 항원-제시 세포 상의 리간드의 결합은 두 세포의 동시 활성화를 촉진하는 반면, CTL의 활성화는 CD226의 경쟁자인 TIGIT (Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체)에 의해 추가로 억제될 수 있다19,20. 인간 생체 외 연구에 따르면 T 세포의 CD226 및 CD155는 차등 조절 Th 하위 집합21을 통해 Th1/Th17과 Th2 사이의 균형을 조절합니다. CD226은 마찬가지로 혈소판 부착 및 NK 종양 사멸 활성을 매개할 수 있다22,23. 한편, CD226은 다양한 감염성 질환, 자가면역질환 및 종양의 발병기전에서 잘 연구되어 있다 18,24,25. 현재 CD226은 면역 요법의 새로운 밝은 지점이되었습니다. 연구에 따르면 세포외 소포체는 NK 세포에서 CD226 발현을 역전시켜 세포독성 활성을 회복하고 폐암의 진행에 개입할 수 있다26. 최근 연구에서는 단일 세포 RNA 시퀀싱27에 의해 높은 CD226 발현을 특징으로 하는 태아 장 그룹 3 ILC의 하위 클러스터가 밝혀졌으며, 이는 CD226이 선천성 림프 세포 매개 면역에서 역할을 발휘할 수 있음을 나타냅니다.
기도 염증에서 ILC2에 대한 우리의 지식은 주로 천식에 대한 연구를 기반으로 합니다. 그러나 비강 점막 면역에서의 기능에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 따라서 비강 점막에서 ILC2를 분리하고 식별하기 위한 프로토콜이 수립되었습니다. 이 연구는 비강 조직의 ILC2에 대한 CD226의 발현과 건강한 마우스와 AR 마우스 간의 변이에 초점을 맞춥니다. 이것은 국소 면역에서 ILC2 매개 조절의 기본 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 제공하고 AR 치료를 위한 새로운 접근 방식을 개발하기 위한 기초가 될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>수산화 알루미늄</td><td>Meilun 생물학적 기술</td><td>21645-51-2</td><td></td></tr><tr><td>CD11b</td><td>eBioscience</td><td>11-0112-82</td><td>항체 coctail</td></tr><tr><td>CD11c</td>에 사용 <td>BioLegend</td><td>117306</td><td>항체 coctail</td></tr><tr><td>CD16 / 32</td>에 사용 <td>BioLegend</td><td>101302</td><td>클론 : 93; 희석 1:100</td></tr><tr><td>CD226</td><td>BioLegend</td><td>128812</td><td>항체 coctail에 사용</td></tr><tr><td>CD3e</td><td>BioLegend</td><td>100306</td><td>항체에 사용</td></tr><tr><td>CD45</td><td>BioLegend</td><td>103128</td><td>항체 coctail에 사용</td></tr><tr><td>CD45R</td><td>eBioscience</td><td>11-0452-82</td><td>항체에 사용</td></tr><tr><td>CD90.2</td><td>BD Pharmingen</td><td>553014</td><td>항체에 사용 coctail</td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>DIYIBio</td><td>DY40128</td><td></td></tr><tr><td>CountBright 절대 계수 구슬</td><td>Invitrogen</td><td>C36950</td><td>절대 계수 구슬</td></tr><tr><td>Dnase <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63525/63525eq01v2.jpg" style="margin: auto; "></td><td>Beyotime</td><td>D7076</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Fixable Viability Dye eFluor 520 (FITC)</td><td>eBioscience</td><td>65-0867-14</td><td>FVD</td></tr><tr><td>HBSS, 칼슘, 마그네슘</td><td>Servicebio</td><td>G4204-500</td><td></td></tr><tr><td>KLRG1</td><td>eBioscience</td><td>17-5893-81</td><td>항체 coctail</td></tr><tr><td>NaN3</td><td>SIGMA</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>NovoExpress 소프트웨어</td><td>AgilentTechnologies</td><td>버전 1.5.0</td><td>유세포 분석(FCM) 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>OVA</td><td>SIGMA</td><td>9006-59-1</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1x</td><td>Servicebio</td><td>G4202-500</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 10x</td><td>Servicebio</td><td>G4207-500</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Yeasen</td><td>40501ES60</td><td>밀도 구배 매체</td></tr><tr><td>RPMI 1640 배양 매체</td><td>Corning</td><td>10-040-CVRV</td><td></td></tr><tr><td>스펙트럼 세포 분석기</td><td>SONY</td><td>SA3800</td><td></td></tr></tbody></table>

cd226의 발현을 검출하기 위해 마우스 비강 점막에서 그룹 2 선천성 림프 세포 분리

Isolation of Group 2 Innate Lymphoid Cells from Mouse Nasal Mucosa to Detect the Expression of CD226

수년에 걸쳐 발표된 그룹 2 선천성 림프 세포(ILC2)에 대한 풍부한 연구를 통해 ILC2는 항기생충 면역, 조직 복구, 열 발생 및 천식 및 알레르기 비염(AR)과 같은 자가면역 질환을 포함한 다양한 병리학적 과정을 조절하는 데 연루된 것으로 널리 알려져 있습니다. ILC2는 피부, 장, 폐 및 비강과 같은 말초 조직에 영구적으로 존재합니다. 그러나 비강 점막 면역의 정확한 기능에 대한 정보는 제한적입니다. CD226은 주로 자연 살해(NK) 세포, T 세포 및 염증성 단핵구에서 발현되는 활성화 공동자극 분자입니다. 그러나 ILC2가 CD226을 발현하는지 또는 ILC2s 관련 질병의 발병기전에서 역할을 하는지 여부는 아직 알려지지 않았습니다. 여기에서 우리는 비강 점막에서 ILC2를 분리 및 식별하는 방법을 확립하고 건강한 AR 마우스에서 얻은 ILC2에서 CD226 발현을 검출했습니다. 여기에서 우리는 비강 점막 질환에서 면역 장애의 내부 병리학적 메커니즘을 탐색하는 데 도움이 될 마우스 비강 점막에서 ILC2s의 분리 및 식별을 위한 이 프로토콜을 설명합니다.

AR에서 ILC2의 역할을 탐색하기 위해 OVA 유도 쥐 모델이 개발되었습니다. AR 쥐 모델의 구성은 약간의 수정 28,29,30,31을 가진 이전 연구를 기반으로 했습니다. 마지막 콧물 챌린지 후 재채기와 코 긁힘의 빈도를 측정하기 위해 10분 분량의 비디오를 캡처했습니다. OVA가 유도된 AR 마우스의 알러지 증상을 도 1에 나타내었다. AR 마우스에서 비강 마찰 및 재채기의 빈도는 대조군보다 유의하게 높았다.
다음으로, 쥐의 코 점막에서 MNC를 분리하고 FCM 분석을 사용하여 특성화를 수행하는 절차를 설명했습니다. 약 2-3 x 106개의 림프구가 각각의 쥐 코로부터 얻어...

제2형 염증과 관련된 그룹 2 선천성 림프 세포(ILC2s)는 주로 기생충 감염, 알레르기 질환, 대사 항상성 및 조직 복구에 대한 반응에 참여합니다. 이 연구에서는 쥐의 코 점막에서 ILC2를 분리하고 CD226의 발현을 감지하는 절차를 입증합니다.

CD226의 발현을 검출하기 위해 마우스 비강 점막에서 그룹 2 선천성 림프 세포 분리

With abundant research on group 2 innate lymphoid cells (ILC2s) published over the years, ILC2s are widely known to be implicated in regulating various ...

이 프로토콜은 쥐 비강 점막에서 그룹 2 선천성 림프 세포를 분리 및 식별하고 비강 질환에서 ILC 2의 특정 효과 및 기본 메커니즘을 탐색하기 위해 확립되었습니다. 이 기술을 통해 연구자들은 국소 중피에서 ILC 2를 분리하고 유세포 분석을 통해 표면 항원의 발현을 노출시킬 수 있습니다. 우리의 기술에는 복잡한 작업이 포함되지 않습니다.그러나, 한 가지 중요한 것은 다른 주변 조직의 영향을 피하기 위해 작은 뼈에 붙어있는 살을 완전히 제거하려고 노력하는 것입니다 실험을 시작하기 전에, 8 내지 12 주령의 야생형 C57 검정 6 마리의 수컷 및 암컷 마우스를 표준 실험실 차우와 물이 제공된 특정 병원체가없는 조건 하에서 집어 넣었다. 알레르기성 비염 모델을 확립하기 위해, 2mg의 수산화알루미늄을 함유한 0.2 밀리리터의 멸균 PBS에 50 마이크로그램의 오브알부민을 유화시키고, 0일, 7 및 14일에 각 마우스에 50 마이크로그램의 유화된 오브알부민을 복강 주사한다. 21일, 22일, 23일, 24일 및 25일에 30마이크로리터의 멸균 PBS에 용해된 50마이크로그램의 오브알부민을 마우스에 비강 내 주입한 다음, 마지막 챌린지 후 24시간 후에 마우스를 안락사시켰다.안락사된 쥐의 머리를 75% 에탄올에 5분 동안 담그고 에탄올이 외부 콧구멍으로 들어가지 않도록 합니다. 복부를 수술대에 아래쪽으로 놓습니다. 4 개의 치아를 잘라 내고 머리의 정중선을 절개하고 가위로 피부를 자릅니다.그런 다음 아래턱을 제거하고 입천장 끝을 따라 코 전체를 잘라낸 다음 5리터의 얼음처럼 차가운 PBS가 들어 있는 60mm 페트리 접시에 조직을 넣습니다. 가위와 집게를 사용하여 뼈에 붙어있는 살과 근육을 제거하십시오. 다음으로, 5 밀리리터의 얼음처럼 차가운 PBS가 들어있는 새로운 60 밀리미터 페트리 접시에 마우스 코를 옮기고 뼈를 씻으십시오.두 번째 세척 후 코를 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브로 옮깁니다. 조직을 충분히 부수고 2 밀리리터의 예열 된 소화 완충액이 들어있는 15 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 뚜껑을 덮고 튜브를 섭씨 37도, 120-150RPM의 궤도 셰이커에 수직으로 40분 동안 놓습니다.다음으로, 소화를 멈추기 위해 10% 소 태아 혈청을 함유한 얼음처럼 차가운 RPMI 1640 배지 5밀리리터를 추가합니다. 그런 다음 70미크론 셀 스트레이너를 통해 내용물을 여과하여 고체 조각을 제거합니다. 여과액을 500G에서 5분 동안 원심분리한 후, 상층액을 부드럽게 버리고 펠릿을 얼음처럼 차가운 RPMI 1640 배지에 재현탁시켰다.앞에서 설명한 대로 원심분리를 반복하려면 40% 밀도 구배 배지 4밀리리터에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 그런 다음 파스퇴르 피펫을 튜브 바닥에 부드럽게 삽입하여 2.5ml의 80% 밀도 구배 매체를 추가합니다. 튜브를 400G에서 실온에서 15분 동안 원심분리하고 가속 및 감속 속도를 3단 기어보다 낮게 설정합니다.계면에서 셀을 배출하기 전에 잠재적인 오염을 방지하기 위해 불순물의 최상층을 제거하십시오. 그런 다음 피펫을 사용하여 40% x 80% 밀도 구배 매체 계면의 단핵 세포층을 2밀리리터의 얼음이 들어 있는 15밀리리터 튜브로 배출합니다. 세포를 얼음처럼 차가운 PBS로 2회 세척한다.세포를 수확하고 섭씨 4도에서 500G에서 5분 동안 원심분리합니다. 세포 펠렛을 염색 완충액에 재현탁하고 500G에서 5분 동안 다시 원심분리하여 상층액을 버립니다. 세포를 80 마이크로리터 차단 용액에 재현탁하고 어두운 조건에서 섭씨 4도에서 30분 동안 배양한다.적절한 희석액의 20 마이크로리터의 표면 염색 항체 칵테일을 샘플에 첨가하기 직전에 1 마이크로리터의 고정가능한 생존성 염료 520을 첨가한다. 또한 일치하는 이소타입 항체와 형광 마이너스 1을 음성 대조군으로 설정합니다. 다음으로, 섭씨 4도에서 5분 동안 500배 G에서 원심분리하여 500 마이크로리터의 염색 완충액으로 세포를 세척한다.그런 다음 세포 펠릿을 200 마이크로리터의 염색 완충액에 재현탁합니다. 마지막으로, 50 마이크로리터의 와류된 절대 계수 비드를 염색된 세포에 추가합니다. 교반하고 유세포 분석 대상에 적용합니다.그룹 2 선천성 림프 세포의 역할을 탐색하기 위해 개발된 난자 유도 쥐 모델은 알레르기성 비염 마우스에서 비강 마찰 및 재채기 빈도가 대조군보다 유의하게 더 높은 것으로 나타났습니다. 건강한 대조군 마우스의 코 점막에서 약 2 내지 3%의 계통 음성 및 CD 45 양성 세포가 확인되었다. 그룹 2 선천성 림프 세포의 절대 수는 2, 000에서 4, 000까지 다양했습니다.유세포 분석 결과, 알러지성 비염 코 점막에서 건강한 대조군 마우스에 비해 그룹 2 선천성 림프 세포의 총 수가 현저하게 증가한 것으로 나타났습니다. CD 226의 더 높은 발현은 대조군 마우스에서보다 알러지성 비염 마우스에서 2개의 선천성 림프 세포군에서 검출되었다. 또한, CD 226의 평균 형광 강도는 AR 마우스에서 유의하게 상향 조절되었다.비강 뼈에 부착 된 살을 제거하고, 배지를 원심 분리하고, 단핵 세포를 배출 할 때 가속 및 감속 속도를 설정하는 단계를 알고 있어야합니다. 확인된 ILC 2는 세포 배양을 위해 분류되거나 시험관 내에서 자극되는 유세포 분석 특성 분석을 위한 스탠드가 될 수 있으며, 이는 비강 조직에서 ILC 2의 특정 위험을 탐색하는 데 도움이 될 것입니다. 특히 비강 점막의 선천성 림프 세포에서 림프구를 분리하고 특성화하는 이 절차는 이 프로토콜을 국소 비강 면역 환경을 탐구하는 연구자들을 위한 예비 참고 자료로 만듭니다.

isolation-group-2-innate-lymphoid-cells-from-mouse-nasal-mucosa-to

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

Miltenyi 맥스 키트를 사용 lymphocytes의 격리는 전체 림프 조직 homogenates에서 세포를 정화하는 안정적인 방법입니다. Miltenyi 시스템을 사용하여 정화 세포는 일반적으로 ≥ 96% 순수하고 있습니다. 여기, 우리는 CD4 + T 세포, Miltenyi에서 제공하는 많은 키트 중 하나를 분리하기 위해 취한 단계를 보여줍니다.

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마우스 성기 요로 점막에서 림프구의 분리

Peyer의 패치에있는 셀의 특정 subpopulations (조달청), 창자 관련 림프의 조직의 주요 유도 사이트의 면역 기능을 이해 증가 관심이 있습니다. 여기 흐름 cytometric 분석 및 immunostaining을위한 PP cryosections위한 단일 셀 준비를 PP 준비 병렬 프로토콜을 설명합니다.

림프구와 손쥐 Peyer의 패치에서 수지상 세포를 분리하고 Immunostaining

림프절 기질 세포의 분리는 섬유아세포 망상 세포, 림프 및 혈액 내피 세포를 얻기 위한 효소 분해 및 기계적 분해를 포함하는 다단계 절차입니다. 설명된 절차에서는 짧은 분해와 자동화된 기계적 분해를 결합하여 생존 가능한 림프절 기질 세포의 표면 마커 저하를 최소화합니다.

쥐과 림프절 기질 세포의 분리

백신이 어떻게 작용하는지에 대한 전반적인 지식이 부족합니다. 여기에서는 수지상 세포와 T 세포 면역에 특히 중점을 두고 백신에 대한 초기 숙주 면역 반응에 대한 통찰력을 얻기 위해 역유전학과 골수 키메라 마우스를 함께 사용할 것을 제안합니다.

키메라 마우스 모델에서 재조합 인플루엔자 백신의 비강 관리는 점막 면역을 연구하기 위해

여기에서는 Plasmodium sporozoites의 피내 주사 후 마우스 피부에서 골수성 세포를 분리하고 림프절을 배출하는 프로토콜을 설명합니다. 수집된 세포의 유세포 분석은 기생충에 대한 피부 및 배액 림프절 염증 반응을 특성화하기 위한 신뢰할 수 있는 분석을 제공합니다.

약독 화와 피내 접종에 따라 마우스의 피부와 배수 림프절에서 골수 세포 분리<em&gt; 변형체</em&gt; 포자 소체

여기 창 자 연관 된 림프 조직 Peyer의 패치 및 배수 mesenteric 림프절을 포함 하 여 유도 사이트와 lamina propria 포함 이펙터 사이트에서 세포의 고립에 대 한 자세한 프로토콜 설명 및 작은 장 면역 시스템의 장 상피입니다.

마우스 작은 장의 면역 시스템에서 세포를 분리

본 의정서에서는, 점막 조직에 있는 바이러스성 감염을 모방하고 활성화시 선천적인 면역 반응을 공부하기 위하여 부분적인 외과 편도선 절제술을 겪고 있는 건강한 인간에게서 편도선 단핵 세포를 쉽게 처리하고 배양하는 방법을 설명합니다.

편도선 단핵 세포의 격리는 인간 점막 림프구 조직에서 Ex Vivo 타고난 면역 반응을 연구합니다

여기에서는 인간 limbal niche 세포를 분리하고 식별하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

Limbal Niche 세포의 분리 및 식별

배우세요 마우스 비강 점막에서 ILC2를 분리하고 CD226 발현을 검출하는 방법을. 이 기술은 알레르기 비염 연구와 면역학 연구에 활용됩니다.

CD226의 발현을 검출하기 위해 마우스 비강 점막에서 그룹 2 선천성 림프 세포 분리

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