Name: 교모세포종의 펄스 전기장 치료를 위한 유연한 유기 전자 장치 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: 학습하세요 교모세포종 치료를 위한 유연한 유기 전자 장치를 이용한 펄스 전기장 전달 방법을. 생체 내 종양 미세환경을 시각화하고 정밀 의학을 위한 바이오전자학의 잠재력을 탐색합니다.

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여기에 보고된 작업은 프랑스 국립 연구 기관(ANR-18-CE19-0029)의 지원을 받았습니다. 저자들은 안정적인 GCaMP6f 세포주 생성에 기여한 S.M. Bardet과 in ovo 모델에 도움을 준 D. O'Connor에게 진심으로 감사드립니다.

<ol><li>Koshy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+survival+time+trends+for+glioblastoma+using+the+SEER+17+population-based+registries%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">Improved survival time trends for glioblastoma using the SEER 17 population-based registries.</a> Journal of Neuro-Oncology. 107 (1), 207-212 (2012).</li>
<li>Davis, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma%3A+Overview+of+disease+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Journal+of+Oncology+Nursing%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma: Overview of disease and treatment.</a> Clinical Journal of Oncology Nursing. 20, 5 Suppl 2-8 (2016).</li>
<li>Edd, J. F., Horowitz, L., Davalos, R. V., Mir, L. M., Rubinsky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+results+of+a+new+focal+tissue+ablation+technique%3A+irreversible+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+transactions+on+Bio-Medical+Engineering%22%5BJournal%5D)">In vivo results of a new focal tissue ablation technique: irreversible electroporation.</a> IEEE transactions on Bio-Medical Engineering. 53 (7), 1409-1415 (2006).</li>
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<li>Frandsen, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+therapeutic+applications+of+calcium+electroporation+to+effectively+induce+tumor+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Direct therapeutic applications of calcium electroporation to effectively induce tumor necrosis.</a> Cancer Research. 72 (6), 1336-1341 (2012).</li>
<li>Lee, J. H., Kim, H., Kim, J. H., Lee, S. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+implantable+microelectrodes+for+future+medicine%3A+prosthetics%2C+neural+signal+recording+and+neuromodulation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Soft implantable microelectrodes for future medicine: prosthetics, neural signal recording and neuromodulation.</a> Lab on a Chip. 16 (6), 959-976 (2016).</li>
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<li>Fattahi, P., Yang, G., Kim, G., Abidian, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+organic+and+inorganic+biomaterials+for+neural+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">A review of organic and inorganic biomaterials for neural interfaces.</a> Advanced Materials. 26 (12), 1846-1885 (2014).</li>
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<li>Dijk, G., Ruigrok, H. J., O'Connor, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEDOT%3APSS-coated+stimulation+electrodes+attenuate+irreversible+electrochemical+events+and+reduce+cell+electropermeabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials+Interfaces%22%5BJournal%5D)">PEDOT:PSS-coated stimulation electrodes attenuate irreversible electrochemical events and reduce cell electropermeabilization.</a> Advanced Materials Interfaces. 8 (19), 2100214(2021).</li>
<li>Chen, T. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-sensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultra-sensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Ribatti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+5+Chick+embryo+chorioallantoic+membrane+as+a+useful+tool+to+study+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Chapter 5 Chick embryo chorioallantoic membrane as a useful tool to study angiogenesis.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 270, 181-224 (2008).</li>
<li>Valdes, T. I., Kreutzer, D., Moussy, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chick+chorioallantoic+membrane+as+a+novel+in+vivo+model+for+the+testing+of+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research%22%5BJournal%5D)">The chick chorioallantoic membrane as a novel in vivo model for the testing of biomaterials.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 62 (2), 273-282 (2002).</li>
<li>Ricard, C., Stanchi, F., Rougon, G., Debarbieux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orthotopic+glioblastoma+mouse+model+maintaining+brain+parenchymal+physical+constraints+and+suitable+for+intravital+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">An orthotopic glioblastoma mouse model maintaining brain parenchymal physical constraints and suitable for intravital two-photon microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e51108(2014).</li>
<li>Lefevre, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+flexible+electronics+for+pulsed+electric+field+delivery+in+a+vascularized+3D+glioblastoma+model%5BTitle%5D)+AND+%22npj+Flexible+Electronics%22%5BJournal%5D)">Integrating flexible electronics for pulsed electric field delivery in a vascularized 3D glioblastoma model.</a> npj Flexible Electronics. 5, 19(2021).</li>
<li>Perry, J. L., Ramachandran, N. K., Utama, B., Hyser, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+genetically-encoded+calcium+indicators+for+live+cell+calcium+imaging+and+localization+in+virus-infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Use of genetically-encoded calcium indicators for live cell calcium imaging and localization in virus-infected cells.</a> Methods. 90, 28-38 (2015).</li>
<li>Blömer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+and+sustained+gene+transfer+in+adult+neurons+with+a+lentivirus+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient and sustained gene transfer in adult neurons with a lentivirus vector.</a> Journal of Virology. 71 (9), 6641-6649 (1997).</li>
<li>Lenting, K., Verhaak, R., ter Laan, M., Wesseling, P., Leenders, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma%3A+experimental+models+and+reality%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Glioma: experimental models and reality.</a> Acta Neuropathologica. 133 (2), 263-282 (2017).</li>
<li>Hickman, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+models+of+cancer+for+pharmacology+and+cancer+cell+biology%3A+Capturing+tumor+complexity+in+vitro%2Fex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional models of cancer for pharmacology and cancer cell biology: Capturing tumor complexity in vitro/ex vivo.</a> Biotechnology Journal. 9 (9), 1115-1128 (2014).</li>
<li>Tay, S. L. M., Heng, P. W. S., Chan, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CAM-LDPI+method%3A+a+novel+platform+for+the+assessment+of+drug+absorption%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacy+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The CAM-LDPI method: a novel platform for the assessment of drug absorption.</a> Journal of Pharmacy and Pharmacology. 64 (4), 517-529 (2012).</li>
<li>Kundeková, B., Máčajová, M., Meta, M., Čavarga, I., Bilčík, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chorioallantoic+Membrane+Models+of+Various+Avian+Species%3A+Differences+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biology%22%5BJournal%5D)">Chorioallantoic Membrane Models of Various Avian Species: Differences and Applications.</a> Biology. 10 (4), 301(2021).</li>
<li>Ricard, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+dynamics+of+microglial+and+monocyte-derived+cells+in+glioblastoma-bearing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Phenotypic dynamics of microglial and monocyte-derived cells in glioblastoma-bearing mice.</a> Scientific Reports. 6 (1), 26381(2016).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

이 연구에서 설명된 접근 방식을 통해 통합 PEF 전달 시스템을 갖춘 뇌종양 모델은 다양한 수준의 생물학적 조직에서 PEF의 효과를 연구할 수 있습니다. 미세 가공 프로토콜은 표준 박막 공정으로 구성되며, 이는 특정 응용 분야에 적용할 수 있는 전극 설계에서 큰 자유를 제공합니다. 때때로, 추가적인 열 어닐링 단계는 제조 동안 발생한 전극의 굽힘을 감소시키기 위해 제조의 끝에서 유용할 수 있다.
형광 칼슘 지시약을 발현하는 안정한 교모세포종 세포주를 사용하면 특히 밀도가 매우 높은 3D 종양에서 염료 전달 및 유지와 관련된 모든 합병증을 피할 수 있다16. 실제로, 높은 발현 수준은 표준 화학 형광 칼슘 지시약에 비해 장기간에 걸쳐 관찰된다17. 이 프로토콜은 신경 활동을 영상화하는 데 일반적으로 사용되기 때문에 다양한 세포주에 적용될 수 있습니다11. 여기서, 인간 및 쥐 세포주를 사용하였다 (각각 면역결핍 또는 면역적격 마우스에의 이식을 위한 U87 및 Gl261). 실제로, 최근 연구에 따르면 U87 세포주는 수년간의 세포 배양을 통해 많은 돌연변이가 획득되어 실험 재현성에 영향을 미치기 때문에 원래 세포의 세포주와 다릅니다18. 3D 종양의 제조에 사용되는 방법은 처리량이 높고 재현성이 높으며 세포주, 파종 시 세포 수 및 성장 시간19에 따라 특정 크기의 스페로이드를 생성할 수 있습니다. 그러나 이러한 스페로이드는 밀도가 높기 때문에 종양의 핵심을 이미징할 때 단점이 있습니다.
in ovo 모델은 뇌에 존재하는 다른 세포 유형과의 상호 작용 없이 3D 종양 및 혈관 구조에 대한 PEF의 효과를 연구하기 위한 첫 번째 접근 방식으로 유용합니다. 이 모델은 저렴하고 빠르며 처리량이 높으며 동물 모델보다 윤리적 문제가 적습니다. 배아의 생존과 이미징의 품질에 영향을 미칠 수 있으므로 전체 실험에서 배아의 무결성을 유지하는 것이 중요합니다. 배아 막의 손상을 피하기 위해 메추라기 알을 여는 동안 특별한주의를 기울여야합니다. 배아를 죽일 수 있는 출혈을 피하기 위해 유연한 전극의 이식 및 배치도 신중하게 수행해야 합니다. 혈관에 형광 염료를 주입하면 형광 현미경으로 종양 세포와 혈관 형성을 동시에 시각화 할 수 있습니다. 안내 주사는 배아 액체로 염료가 누출되는 것을 방지하기 위해 신중하게 수행해야 하며, 이는 배경에 잔류 형광을 일으켜 이미징 품질을 저하시킬 수 있습니다. 이 모델은 순환계에 접근 할 수 있기 때문에 약물 섭취 후에도 사용할 수 있습니다. 그러나, 실험은 배아의 12일 생존 시간에 의해 제한되고, 따라서 7일의 관찰이 허용되며, 이는 생체 내 모델21보다 현저히 짧다.
생체 내 뇌종양 모델은 동물이 갑작스런 20 % 체중 감소에 의해 결정된 윤리적 실험 종점에 도달하기 전에 4-5 주 동안 모니터링 할 수 있습니다. 내약성이 좋으며 전극의 연결 꼬리가 너무 길지 않으면 제자리에 유지됩니다. 그렇지 않으면 동물이 뒤집는 커넥터를 긁는 경향이 있어 궁극적으로 찢어질 수 있으므로 자극기에 대한 후속 연결을 방지할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 이 4주 기간은 교모세포종 발달의 여러 단계를 다루는 데 가치가 있습니다. 상이한 시간 간격에서 동일한 관심 부피의 종양 세포 밀도를 비교할 때, 종양 성장 동역학의 진화가 관찰될 수 있다. 특히, 강화된 종양 성장은 면역스위치22시에 관찰되었다. 자극 전극이 있는 상태에서 유사한 연구는 종양 증식 속도와 면역 제거에 대한 종양 민감도에 대한 PEF의 효과에 대해 알려줄 것입니다. 생체 내 모델과 비교하여 생체 내 모델은 종양 진행에 대한 면역 세포의 영향과 PEF의 치료 효과에 대한 기여도를 연구하는 데 유용한 전임상 모델로 볼 수 있습니다. 이 프로토콜은 두개골 창(14)을 배치하기 전에 종양에 유연한 전극 장치를 추가한 이전 기사에서 채택되었습니다. 종양의 급성 및 만성 생체 전기 치료는 초기 자극이 세포 사멸을 유도하고 면역 반응의 지속적인 조절 장애를 유발할 것으로 예상된다는 점을 감안할 때 이광자 현미경을 사용한 직접 및 후속 관찰로 특징지을 수 있습니다.
플렉시블 프로브의 연결은 이광자 현미경으로 쉽게 접근할 수 있습니다. 따라서 전기 자극 매개변수는 의사가 환자의 MRI 또는 CT 이미지를 관찰하는 동안 중재적 절차를 수행하는 방법과 유사하게 신경 조직 및/또는 표적 세포에 대한 관찰된 효과를 기반으로 실시간으로 조정될 수 있습니다. 마지막으로 고려해야 할 사항은 조직 재성장을 방지하기 위해 초강력 접착제와 실리콘 접착제로 뇌의 전극을 조심스럽게 밀봉하는 것이 중요하다는 것입니다.
결론적으로, 여기에 설명된 프로토콜은 교모세포종 종양 모델에 대해 유연한 유기 폴리머 전극을 사용한 PEF 요법의 효과를 연구하기 위한 혁신적인 모델을 나타냅니다. 두 모델은 작용 메커니즘을 더 잘 이해하기 위해 세포, 혈관 또는 면역 효과를 분리할 수 있도록 서로 다른 수준의 복잡성을 나타냅니다. 등각 표면 전극은 의원성 손상을 줄이는 동시에 종양 미세 환경의 파괴를 가능하게 하여 혈관 수축 또는 세포 내 칼슘 조절 장애를 유발합니다15.

다형성 교모세포종(GBM)은 매우 침습적인 종양이므로 절제, 방사선 요법 및 화학 요법과 같은 표준 치료법으로 근절하기 어렵습니다. 복합 치료에도 불구하고 예후는 매우 좋지 않으며 대부분의 환자는 진단 후 1년 이내에 질병 진행을 경험한다 1,2. 최근 생체 전기 치료법의 개발은 기존 치료법을 개선할 수 있는 큰 잠재력을 보여주었습니다. 이러한 치료법은 일반적으로 단일 치료 세션에서 펄스 전기장(PEF)의 전달을 사용하여 세포막 무결성과 종양의 미세 환경을 방해합니다. 전기천공이라고도 하는 이 세포막 파괴는 전기장 강도와 펄스 수에 따라 가역적이거나 비가역적일 수 있습니다. 비가역적 전기천공법(Irreversible electroporation, IRE)은 비열 조직 절제 기법으로 적용되며, 전기 펄스가 세포막에 치명적인 손상을 일으켜 세포 사멸을 유도한다3. 전기화학요법(electrochemotherapy, ECT)은 암세포에서 약물 흡수를 향상시키기 위해 화학요법 약물과 함께 PEF를 전달하는 것으로 구성된 확립된 기술이다4. 또한, 최근 연구에서는 ECT의 대안으로 칼슘 전기천공법이 암 치료에 높은 효율을 보이며, 이는 또한 저렴하고 부작용을 덜 유발한다는 것을 입증했다5. 이러한 유망한 발전에도 불구하고, PEF는 일반적으로 연조직에 손상을 입히는 것으로 알려진 단단한 금속 전극을 사용하여 적용된다6. 뇌는 기계적 불일치가 염증과 성상아교세포 흉터를 유발하는 침습적 장치에 특히 민감하다7.
이러한 맥락에서, 미세 가공에서 쥐 모델에 이르기까지 교모세포종 종양의 3D 모델과 결합된 유연한 PEF 전달 시스템이 제시됩니다. 컨포멀 전극은 파릴렌-C, 금 및 pedot:PSS 8,9와 같은 연질 및 생체 적합성 재료의 사용을 포함하여 표준 박막 미세 가공 공정으로 만들어집니다. 인터디지티드 전극 설계는 전극 핑거(10) 사이의 이미징을 위한 적절한 투명성을 유지하면서 넓은 표면적을 커버하는 데 사용된다. 종양 모델의 경우, 유전적으로 암호화된 형광 리포터를 발현하는 교모세포종 세포의 3D 스페로이드는 액체 오버레이 96웰 플레이트 방법11의 변형을 사용하여 생산됩니다. 스페로이드는 메추라기 배아의 융모막에 이식되어 혈관신생 또는 약물 독성학을 연구하는 데 광범위하게 사용된 난소 모델을 생성합니다12,13. 종양은 배아 발달의 이 단계에서 면역계가 없는 상태에서 배아의 혈관 구조에 의해 이식되고 혈관화될 수 있다12. 그런 다음 유연한 전극을 혈관화된 종양 위에 배치하여 PEF 전달이 스페로이드와 혈관 구조에 미치는 영향을 연구합니다. 마지막으로, 이러한 효과는 쥐 모델14의 뇌 실질에 조작된 스페로이드를 이식하여 종양 미세 환경 및 면역 체계를 포함한 완전한 살아있는 유기체에 대해 조사됩니다. 유연한 전극을 삽입 부위 위에 놓고 개두술을 유리창으로 밀봉하여 몇 주에 걸쳐 반복적인 이광자 이미징을 허용합니다.
이러한 방법은 마이크로 일렉트로닉스 공학에서 종양학 응용 분야에 이르기까지 다양한 영역에 관심이있는 사람들에게 유용 할 것입니다. 미세 가공 프로토콜은 pedot:pss로 코팅된 박막 금속 전극이 필요한 모든 응용 분야에 사용 및 적용할 수 있습니다. 또한, 항종양 전기 치료의 평가를 위해 개발된 생물학적 모델은 이식된 물질에 대한 세포, 혈관 및 면역 반응의 분화 조사에 일반적인 관심이 될 것입니다.

<table><tbody><tr><td>(3-Glycidyloxypropyl)trimethoxysilane</td><td>Sigma</td><td>440167</td><td>GOPS</td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA (1X)</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>4-Dodecylbenzenesulfonic acid</td><td>Sigma</td><td>44198</td><td>DBSA</td></tr><tr><td>96-well plate</td><td>Falcon</td><td>353075</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Technic</td><td>530</td><td></td></tr><tr><td>아크릴 수지</td><td>Fischer 과학</td><td>NC1455685</td><td></td></tr><tr><td>아가로 스</td><td>시그마</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>오토 클레이브</td><td>Tuttnauer</td><td>3150 EL</td><td></td></tr><tr><td>AZ 10XT</td><td>Microchemicals</td><td></td><td>포지티브 포토 레지스트</td></tr><tr><td>AZ 826 MIF 개발자</td><td>Merck</td><td>10056124960</td><td>네거티브 포토 레지스트에 대한 금속 이온 프리 현상액</td></tr><tr><td>AZ 개발자</td><td>Merck</td><td>10054224960</td><td>포지티브 포토레지스트용 금속 이온 프리 현상액</td></tr><tr><td>AZ nLof 2070</td><td>Microchemicals</td><td>네거티브</td><td></td> 포토레지스트</tr><tr><td>부프레노르핀</td><td>Axience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Rimadyl</td><td></td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 Sorvall Legend X1R</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004260</td><td></td></tr><tr><td>CMOS 카메라 Prime 95B</td><td>광도 측정</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 인큐베이터 HERAcell 150i</td><td>Thermo scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAC 보드</td><td>National Instruments</td><td>USB 6259</td><td></td></tr><tr><td>D&eacute; CO 스프레이 P&eacute; b&eacute; o</td><td>Cultura</td><td>3167860937307</td><td>블랙 아크릴 페인트</td></tr><tr><td>덱스트란 텍사스 레드 70.000</td><td>Thermofisher</td><td>D1830</td><td></td></tr><tr><td>다이 본딩 페이스트 "Epinal"</td><td>Hitachi</td><td>EN-4900GC</td><td>실버 페이스트</td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드</td><td>시그마</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>디스펜싱 머신</td><td>Tianhao</td><td>TH-2004C</td><td></td></tr><tr><td>둘베코' 의 변형된 독수리' s Medium + GlutaMAX&trade;-I</td><td>Gibco</td><td>10567-014</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>Egg incubator COUVAD'OR 160</td><td>lafermedemanon.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethylene glycol</td><td>Carl Roth</td><td>6881.1</td><td></td></tr><tr><td>일본 메추라기</td><td>Japocaille</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum 수정란</td><td>VWR</td><td>S181BH</td><td></td></tr><tr><td>플라스크</td><td>Greiner</td><td>658170</td><td></td></tr><tr><td>형광 매크로스코프</td><td>Leica MZFLIII</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gl261</td><td>DSMZ</td><td>ACC 802</td><td></td></tr><tr><td>골드 펠릿 - 직경 3 mm x 6 mm th</td><td>Neyco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>휴대용 자동 셀 카운터</td><td>Millipore</td><td>PHCC00000</td><td></td></tr><tr><td>가열 및 건조 오븐</td><td>Memmert</td><td>UF110</td><td></td></tr><tr><td>Hexadimethrine Bromide Sequa-brene</td><td>Sigma</td><td>S2667</td><td></td></tr><tr><td>핫 플레이트 Delta 6 HP 350</td><td>S&uuml; ss Microtec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>조명 시스템 pE-4000</td><td>CoolLed</td><td></td><td></td></tr><tr><td>적외선 조정 가능 펨토초 레이저 (Ma&iuml;-Ta&iuml;)</td><td>Spectra Physics (USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin calcium salt</td><td>Sigma</td><td>I3909</td><td></td></tr><tr><td>Kapton tape SCOTCH 92 33x19</td><td>3M</td><td></td><td>폴리이미드 보호 테이프</td></tr><tr><td>Lab made pulse generator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Labcoter 2 Parylene Deposition system PDS 2010</td><td>SCS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lenti-X 293 T cell line</td><td>Takara Bio</td><td>63218</td><td>렌티바이러스 생산에 최적화된 HEK 293T 유래 세포주</td></tr><tr><td>Lenti-X GoStix Plus</td><td>Takara Bio</td><td>631280</td><td>정량적 렌티바이러스 역가 테스트</td></tr><tr><td>마스크 정렬기 MJB4</td><td>S&uuml; ss Microtec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro-90 농축 세척 용액</td><td>International Products</td><td>M9050-12</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드 76 x 52 x 1 mm</td><td>Marienfeld</td><td>1100420</td><td></td></tr><tr><td>바늘 30G</td><td>BD Microlance 3</td><td>304000</td><td></td></tr><tr><td>PalmSens4 potentiostat</td><td>PalmSens</td><td></td><td></td></tr><tr><td>parylene-c : dichloro-p-cyclophane</td><td>SCS</td><td>300073</td><td></td></tr><tr><td>PCB 처리 탱크</td><td>Mega Electronics</td><td>PA104</td><td></td></tr><tr><td>PEDOT:PSS Clevios PH 1000</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>팔콘</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>pGP-CMV-GCaMP6f</td><td>Addgene</td><td>40755</td><td>플라스미드</td></tr><tr><td>인산염 버퍼 식염수</td><td>Thermofisher</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>플라즈마 처리 시스템 PE-100</td><td>플라즈마 에칭</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PlasmaLab 80 반응성 이온 에칭</td><td>옥스포드 기기</td><td></td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 마스크</td><td>셀바</td><td></td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 계량 보트 64 x 51 x 19 mm</td><td>VWR</td><td>10770-454</td><td></td></tr><tr><td>폴리 디메틸 실록산 : SYLGARD 184 실리콘 엘라스토머 키트</td><td>Dow chemicals</td><td></td><td></td>1673921</tr><tr><td>폴리이미드 구리 필름 60 &마이크로; m (Kapton)</td><td>Goodfellow</td><td>IM301522</td><td></td></tr><tr><td>Propan-2-ol</td><td>Technic</td><td>574</td><td></td></tr><tr><td>Protolaser S</td><td>LPKF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>puromycin</td><td>Gibco</td><td>A11103</td><td></td></tr><tr><td>라운드 커버 유리 5 mm 직경</td><td>Fischer scientific</td><td>50-949-439</td><td></td></tr><tr><td>Scepter 센서 - 60 &micro; m</td><td>Millipore</td><td>PHCC60050</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 접착제 Kwik-Sil</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>스핀 코터</td><td>S&uuml; ss Microtec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>스핀 코터</td><td>Laurell</td><td>WS-650</td><td></td></tr><tr><td>슈퍼 글루</td><td>사무실 창고</td><td></td><td></td></tr><tr><td>테트라사이클린 프리 f&oelig; tal bovine 혈청</td><td>Takara Bio</td><td>631105</td><td></td></tr><tr><td>열 증발기 Auto 500</td><td>Boc Edwards</td><td></td><td></td></tr><tr><td>이광자 현미경</td><td>Zeiss LSM 7MP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>U87-MG</td><td>ATCC</td><td>HTB-14</td><td>인간 교모세포종 세포</td></tr><tr><td>초음파 세척기</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex VTX-3000L</td><td>LMS</td><td>VTX100323410</td><td></td></tr><tr><td>Xfect 단발성 시약</td><td>Takara Bio</td><td>631447</td><td>Transfection 시약</td></tr></tbody></table>

교모세포종의 펄스 전기장 치료를 위한 유연한 유기 전자 장치

Flexible Organic Electronic Devices for Pulsed Electric Field Therapy of Glioblastoma

교모세포종은 침습성이 높기 때문에 표준 종양 요법으로 근절하기 어렵습니다. 펄스 전기장(PEF)을 기반으로 하는 생체 전기 치료는 치료 효율성 향상에 유망합니다. 그러나 그들은 특히 뇌와 같은 연조직에서 급성 및 만성 손상을 일으키는 단단한 전극에 의존합니다. 이 작업에서는 유연한 전자 장치를 사용하여 PEF를 종양에 전달하고 생물학적 반응을 형광 현미경으로 평가했습니다. 얇고 투명한 파릴 렌 -C 기판 위에 인터 디지트 된 금 전극을 전도성 폴리머 PEDOT : PSS로 코팅하여 순응 성 및 생체 적합성 장치를 만들었습니다. 종양과 그 미세 환경에 대한 PEF의 영향은 다양한 생물학적 모델을 사용하여 조사되었습니다. 먼저, 교모세포종 세포의 단층을 전극 상부에서 배양하여 in vitro에서 현상을 조사하였다. 중간 단계로, 조작된 종양 스페로이드가 메추라기의 배아막에 이식되는 in ovo 모델이 개발되었습니다. 면역 체계가 없기 때문에 혈관이 많이 형성 된 종양이 발생했습니다. 이 발달 초기 단계에서 배아에는 면역 체계가 없으며 종양은 이물질로 인식되지 않습니다. 따라서 기존 배아 혈관계에서 자신의 혈관을 개발하면서 빠르게 발전할 수 있으며, 이는 가치 있는 3D 암 모델을 나타냅니다. 마지막으로, PEF의 유연한 전극 전달은 syngenic, orthograft (intracranial) 마우스 모델을 사용하여 기능적 면역 체계를 가진 완전한 유기체에서 평가되었습니다. 종양 스페로이드는 유연한 유기 전극 장치를 이식하기 전에 형질전환 다중 형광 마우스의 뇌에 이식되었습니다. 밀봉된 두개골 창은 몇 주 동안 PEF로 치료하는 동안 종양과 그 미세 환경의 다광자 이미징을 가능하게 했습니다.

이 프로토콜을 사용하면 유연한 PEF 전달 시스템이 통합된 두 개의 교모세포종 모델에 적용할 수 있습니다. 미세 가공 및 패키징 단계에 따라 유연한 전극은 성능을 평가하고 검증하기 위해 전기화학적 임피던스 분광법(EIS)에 의해 식염수에서 특성화됩니다. pedot:PSS 코팅 전극은 차단 주파수로 분리된 일반적인 정전 용량 및 저항 지배 영역을 보여주는 반면, 코팅되지 않은 전극은 정전 용량 거동만 표시합니다(그림 2).
액체 오버레이 96웰 플레이트 방법의 변형은 형광 세포내 칼슘 리포터를 안정적으로 발현하는 형질주입된 교모세포종 세포로 이루어진 3D 종양을 성장시키는 데 사용됩니다. 스페로이드의 성장은 명시야 현미경으로 관찰할 수 있습니다(그림 3; ED 0)입니다. 구형 및 조밀한 스페로이드를 얻기 위해서는 최소 2일 또는 3일이 필요하며, 이는 세포주와 파종된 세포의 수에 따라 다릅니다.
in ovo 모델에서 스페로이드는 메추라기 배아의 융모막에 이식됩니다(그림 3; ED 6)입니다. 이식편의 성공 여부는 며칠 후 형광 현미경으로 평가할 수 있는데, 살아있는 세포는 세포 내 칼슘을 가지고 있어 형광을 띠기 때문입니다(그림 3; ED 9)를 참조하십시오. 종양의 혈관 형성은 형광 염료를 혈관에 주입하여 형광 현미경으로 관찰할 수 있습니다(그림 3; ED9)입니다. 그러나 스페로이드가 매우 조밀하기 때문에 종양 내부의 혈관을 시각화하는 것이 항상 가능한 것은 아닙니다. 유연한 interdigitated 전극은 혈관 종양 위에 배치됩니다(그림 3; ED9)를 펄스 발생기에 연결한다. 탐침은 배아의 출혈을 피하기 위해 부드럽게 놓아야 합니다. 그렇지 않으면 형광 염료가 퍼져 이미징에 의한 관찰을 방해할 수 있습니다. 생물학적 환경으로의 펄스의 올바른 전달은 회로를 통과하는 전류를 측정하여 확인할 수 있습니다. OVO 모델에서 이들의 이미징을 통해 3D 교모세포종 종양에서 세포내 칼슘에 대한 PEF의 효과와 종양의 혈관 구조에 유도된 혈관 수축을 실시간으로 모니터링할 수 있어 면역 체계를 포함한 다른 세포 유형의 영향을 피할 수 있습니다15.
교모세포종에 대한 PEF 효과에 대한 연구는 또한 보다 완전하고 예측 가능한 모델에서 수행될 수 있다. 실제로, 상술한 생체내 모델(14 )은 마우스의 뇌 실질에 3차원 교모세포종 종양을 이식하는 것으로 구성된다(도 4). 종양의 주사 부위는 가교결합된 덱스트란 겔 헤미비드에 의해 막혀, 종양의 성장 동안 생리학적 생물물리학적 제약을 요약한다. 참고문헌14에 기재되어 있지만, 덱스트란 헤미비드가 경질막에 정확하게 초접착되는 것이 매우 중요하다는 것을 다시 강조할 가치가 있다; 그렇지 않으면 종양이 열린 경막을 통해 빠져나와 뇌를 완전히 덮어 영상 촬영이 불가능할 수 있습니다. 모든 만성 영상의 경우 두개골 창이 치유될 때 발생하는 조직 성장은 새로운 조직이 불투명하고 이미지를 흐리게 하거나 사용할 수 없게 만들기 때문에 심각한 장벽이 됩니다. 따라서 반구슬을 삽입하고 접착한 후 열린 두개골 창의 측벽은 초강력 접착제가 미끄러지거나 경막으로 흐르지 않도록 캐비티 벽 전체에 세심하게 배치된 얇은 초강력 접착제 층으로 밀봉해야 합니다. 플렉시블 프로브를 종양 주사 부위 위에 놓으면 두 가지 이유로 프로브 아래에 기포가 머무를 수 없습니다. 첫째, 기포가 있으면 이미징을 진행할 수 없습니다. 둘째, 기포는 절연체 역할을 하여 전기 자극 특성을 변화시킵니다. 위에서 설명한 예방 조치를 취한 후 개두술은 두개골에 접합된 유리창으로 밀봉되어 몇 주에 걸쳐 만성 영상이 가능합니다. 종양은 GCaMP 또는 DsRed 발현 세포로 구성되어 있으므로 형광 현미경으로 주사를 확인할 수 있습니다. 전극의 전기화학적 임피던스는 주입 후 성능을 검증하기 위해 측정되어야 합니다. 식염수의 임피던스와 비교할 때, 생물학적 환경의 존재로 인해 100Hz 이상의 주파수에서 생체 내에서 임피던스의 증가가 예상됩니다(그림 5). 혈관화된 신경 실질 및 종양 침윤은 이광자 현미경으로 몇 주에 걸쳐 투명 기질을 통해 관찰 및 특성화할 수 있습니다(그림 6). 관심 세포 (면역 세포 및 뉴런)에서 형광 단백질을 발현하는 형질전환 동물의 사용은 예를 들어 전극 이식 단독에 의해 유도된 최소 염증 과정의 입증을 허용하거나(도 6A) 성장하는 GBM 종양의 상부에 이식된 PEF 자극 전극의 이식 후 26일 후에 미세아교세포 및 단핵구의 존재를 보여줄 수 있다 (도 6B1 ). 후자의 경우, 말초-단핵구 유래 세포 및 뇌-상주 소교세포 둘 다 종양 주위 및 내부에서 발견되었다(도 6B2). PEF 전달 당일, 플렉시블 전극의 접촉 패드는 이광자 현미경 아래에서 직접 펄스 발생기에 연결할 수 있습니다. 전반적으로, 이 모델은 최대 약 500μm 깊이까지 뇌종양 발달에 관여하는 다양한 유형의 세포를 사용하여 시간 경과에 따른 생체 전기 치료의 효과를 조사하는 데 사용할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63527/63527fig01.jpg"> 그림 1: 플렉시블 전극의 미세 가공 . (A) 금 전극 패터닝 및 파릴렌 C 기판. (B) 개관 개구부. (C) pedot : PSS 코팅. (D) 연결 및 포장. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63527/63527fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63527/63527fig02.jpg"> 그림 2: 식염수에서 유연한 금 전극과 pedot:PSS 코팅된 저온 전극의 전기화학적 임피던스 분광법. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63527/63527fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63527/63527fig03.jpg"> 그림 3: 교모세포종의 내 난소 모델. ED 0: 명시야 현미경으로 관찰한 스페로이드. ED 3 : 개봉 후 3 일 동안 메추라기 배아의 껍질을 벗기지 않는 배양. ED 6: 명시야 현미경으로 관찰한 CAM에 이식된 종양. ED 9: 혈관화된 종양(녹색의 종양과 빨간색의 혈관)에 배치된 유연한 장치. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63527/63527fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63527/63527fig04.jpg"> 도 4: 생체 내 적용 . (A) 생체 내 실험을 위한 반응식. (B) 커버 유리와 아크릴 수지를 적용하기 전에 프로브 배치. (C) 프로브 이식 완료. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63527/63527fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63527/63527fig05.jpg"> 그림 5: 식염수 용액에서 이식된 프로브와 비교한 유연한 금 전극의 전기화학적 임피던스 분광법. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63527/63527fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63527/63527fig06.jpg"> 그림 6: 전극을 통한 생체 내 다분광 이광자 이미징 . (A) 전극 이식 3일 후 대조군 다형광 AMU-Neuroinflam 마우스에서 건강한 뇌 표면의 타일 이미지. 청록색은 5층 피라미드 뉴런의 수지상 수목화를 보여주고, 녹색은 모집된 과립구와 단핵구를 보여주며, 노란색은 활성화된 미세아교세포와 수지상 세포를 나타냅니다. 분홍색은 열 축적으로 인한 적외선 확산을 나타냅니다. (나1) A 에서와 유사한 이미지이지만 종양 스페로이드 이식 후 26일 후 피질 내부 200μm 깊이에 전극 이식 직후. 녹색과 노란색 면역 세포의 축적에 주목하십시오. (나2) B1 과 유사한 이미지이지만 전극 표면 아래 100μm입니다. 황색 미세 아교 세포와 수지상 세포에 의해 침윤 된 적색 종양 덩어리 자체의 주변에 청색 신경 수지상 수목이 존재한다는 점에 유의하십시오. 진한 파란색은 주위 콜라겐의 두 번째 고조파 신호를 나타냅니다. (나3) 종양 부근에 뉴런 소마(화살표로 표시)의 존재를 보여주는 B2 의 확대된 보기. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63527/63527fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 작업은 3D 뇌종양 모델, 즉 시험관 내 배양, 생체 내 모델 및 생체 내 쥐 모델에서 구현하기 위한 유연한 상호 디지털화 전극의 개발을 설명합니다. 제안된 방법은 상이한 수준의 복잡성에서 종양에 대한 펄스 전기장의 효과를 평가하기 위해 사용될 수 있다.

Glioblastoma is difficult to eradicate with standard oncology therapies due to its high degree of invasiveness. Bioelectric treatments based on pulsed ...

이 프로토콜은 교모세포종에 대한 치료 효과를 연구하기 위해 유연한 전자 장치에 의한 펄스 전기장의 전달을 허용합니다. 우리는 이미징을 통해 생체 내 종양 미세 환경을 시각화하여 이를 수행합니다. 생체 전자 공학은 맥동 필드가 암에 미치는 영향을 연구하기 위해 복잡성이 증가하는 여러 모델을 사용하여 이 프로토콜에 통합됩니다.이 연구에서 제시된 미세 가공 기술은 환자 유래 이종 이식편을 포함한 다른 유형의 암을 치료하는 수단으로도 테스트 할 수 있습니다. 이것은 각 개별 환자에 맞는 정밀 의학의 아이디어로 이동합니다. 이 프로브는 표준 미세 가공 기술로 만들어지므로 제조가 간단하며 클린룸만 있으면 누구나 만들 수 있습니다.금 전극 패터닝을 위해, 깨끗한 유리 슬라이드를 증착 챔버에 배치함으로써 파릴렌 증착 시스템으로 3 마이크로미터 층의 파릴렌 C를 증착한다. 알루미늄 보트에서 6 그램의 파릴 렌 C의 무게를 측정하고, 용광로에 넣고, 기계를 비우고, 원고에 설명 된 매개 변수로 증착을 시작하십시오. 증착이 완료되고 기화기 온도가 섭씨 40도 미만이면 냉각기, 기화기, 용광로를 끕니다.기계를 환기시키고 샘플을 수집하십시오. 플라즈마 처리된 샘플을 40초 동안 1, 000배 G에서 네거티브 포토레지스트로 스핀 코팅합니다. interdigitated 전극 디자인이 특징인 마스크를 통해 포토레지스트를 노출시킵니다.그런 다음 샘플을 금속 이온이 없는 현상액에 3분 동안 담그고 비노광 포토레지스트를 제거합니다. 열 증발기로 20 나노 미터의 크롬 접착 층과 300 나노 미터의 금 층을 증착하려면 증발기 기계를 환기시키고 금속 나사로 상부 원형 판에 샘플을 클립합니다. 전용 도가니를 각각 크롬과 금으로 채웁니다.기계를 밀봉하고 비우고 샘플 홀더의 회전을 시작합니다. 크롬이 포함된 도가니를 선택하고 증착 속도가 초당 0.2옹스트롬에 도달할 때까지 전류를 천천히 증가시킵니다. 셔터를 열고 20나노미터의 크롬이 증착될 때까지 기다렸다가 셔터를 닫고 0밀리암페어가 될 때까지 전류를 천천히 낮춥니다.도가니가 포함된 금을 선택하고 초당 0.2옹스트롬의 증착 속도가 될 때까지 전류를 천천히 증가시킵니다. 셔터를 열어 금을 증발시키고 10나노미터의 금이 증착될 때까지 기다린 다음 약 300나노미터가 증착될 때까지 증착 속도를 초당 1.5옹스트롬으로 높입니다. 셔터를 닫고 전류를 0밀리암페어로 천천히 낮춥니다.아세톤이 들어있는 비커에 샘플을 담그십시오. 그런 다음 샘플을 이소프로판올로 헹구고 에어건으로 건조시킵니다. PEDOT:PSS 용액의 4층을 150배 G에서 35초 동안 스핀 코팅합니다.샘플을 물에 침지하여 희생 파릴렌 C 층을 제거합니다. 샘플을 탈 이온수에 30 분 동안 담그면 pedot : pss 필름에 남아있는 비누와 저 분자량 화합물을 제거하고 유리 기판에서 샘플을 분리합니다. 96웰 플레이트의 각 웰에 75마이크로리터의 용융된 1% 아가로스 용액을 조심스럽게 첨가하고 실온에서 15분 동안 응고시킨다.안정한 세포주 생성 동안 얻어진 형질도입된 교모세포종 세포를 분리한다. 10, 000 교모세포종 세포를 웰 당 첨가하고 리터당 1그램 포도당, L-글루타민, 나트륨 피루브산 및 중탄산나트륨, 10% 태아 소 혈청, 페니실린의 마이크로리터당 100 단위 및 스트렙토마이신의 마이크로리터당 100 마이크로그램을 포함하는 DMEM을 사용하여 웰 당 150 마이크로리터에 총 부피를 구성한다. 추가 실험이 있을 때까지 배지의 절반을 새 배지로 교체하고 피펫 팁을 웰 상부에 유지하여 아가로스 또는 스페로이드 자체의 손상을 방지합니다.일본 메추라기 인 Coturnix japonica의 수정란을 2 시간마다 알을 돌리는 자동 회전자가있는 트레이의 인큐베이터에 넣습니다. 이 날은 배아 0 일로 간주됩니다. 배아 3일째에 70% 에탄올로 미리 세척한 얇은 팁이 있는 핀셋을 사용하여 알을 부드럽게 엽니다.배아를 플라스틱 계량 보트에 붓고 다른 계량 보트로 덮고 섭씨 37도의 표준 가습 인큐베이터에 3일 동안 넣습니다. 배아 6일째에 23게이지 바늘로 융모막 막을 작게 절개합니다. 피펫을 사용하여 절개 부위에 7일 스페로이드를 놓고 추가 실험이 있을 때까지 3일 동안 배아를 인큐베이터로 되돌립니다.개두술을 덮기 위해 DPBS 한 방울을 떨어뜨립니다. 유연한 전극을 DPBS 드롭에 놓고 접촉 패드가 있는 프로브 뒷면을 마우스 뒷면에 부드럽게 놓습니다. 프로브가 경막에 평평하게 놓일 수 있을 때까지 작은 종이 조각으로 DPBS 방울을 흡수하고 뇌의 곡률을 따라 작은 식염수 층이 전극 아래에 남아 접착제 유출에 대한 장벽 역할을 하도록 합니다.실리콘 접착제를 프로브에 작은 방울로 떨어뜨리고 5mm 원형 커버 유리로 덮습니다. 실리콘이 고르게 분포되고 커버 유리와 프로브 사이의 거리가 최소화될 때까지 커버 유리를 아래로 누릅니다. 그런 다음 실리콘이 굳을 때까지 30초 동안 기다립니다.커버 유리를 고정하려면 측면에 초강력 접착제를 빠르게 바르고 접착제가 단단해질 때까지 아래로 누릅니다. 이쑤시개를 사용하여 프로브의 목에 슈퍼 접착제를 바르고 슈퍼 접착제가 목 아래로 당겨져 안정적인 지지를 제공합니다. 두개골을 치과용 시멘트로 덮어 만성 캡을 만들고 커버 유리의 가장자리만 덮도록 각별히 주의하십시오.프로브 뒷면을 들어 올리고 프로브 목 아래에 시멘트를 바릅니다. 경화되기 전에 시멘트에 프로브의 나머지 부분을 올려줍니다. 프로브의 목을 부드럽게 아래로 눌러 표면을 커버 유리와 같은 높이에 놓고 실험 중에 현미경 대물렌즈를 방해하지 않도록 합니다.프로브를 단단히 고정하기 위해 프로브 넥의 상단을 1.5mm 이하의 치과용 시멘트 층으로 덮습니다. 커버 유리 주위 1-2mm에 1.5mm 융기를 나타내는 시멘트 우물을 만들어 2광자 이미징을 위한 침지 유체를 위한 분지를 만듭니다. 시멘트가 경화 된 후 수술 후 진통제를 투여하고 종이 타월로 싸서 적외선 전구 가까이에 두어 회복 될 때까지 동물을 따뜻하게 유지하십시오.pedot:pss 코팅 전극은 차단 주파수로 분리된 일반적인 용량성 및 저항성 지배 영역을 나타내는 반면, 코팅되지 않은 전극은 용량성 거동만 표시합니다. 명시야 현미경으로 관찰한 스페로이드의 성장은 세포주와 파종된 세포의 수에 따라 구형 및 조밀한 스페로이드를 얻는 데 최소 2-3일이 필요하다는 것을 보여주었습니다. in ovo 모델에서 융모막 막의 스페로이드 이식편은 살아있는 세포가 세포 내 칼슘을 가지고 있고 형광 염료를 혈관에 주입하여 종양의 혈관 형성을 평가할 수 있기 때문에 형광 현미경으로 평가할 수 있습니다.식염수 중의 임피던스와 비교하여, 생물학적 환경의 존재로 인해 100 헤르츠 이상의 주파수에서 생체 내에서 임피던스의 증가가 예상된다. 혈관화된 신경 실질 및 종양 침윤은 2개의 광자 현미경에 의해 수주에 걸쳐 투명 기질을 통해 관찰 및 특성화될 수 있다. 관심 세포에서 형광 단백질을 발현하는 형질전환 동물의 사용은 전극 이식 단독으로 유도되는 최소 염증 과정을 입증할 수 있습니다.그것은 미세아교세포와 단핵구의 존재를 보여줄 수 있습니다 이식 후 26일 펄스 전기장 자극 전극. 말초 단핵구 유래 세포와 뇌 공명 소교 세포가 모두 종양 주변과 내부에서 발견되었습니다. 임플란트 시술의 성공을위한 중요한 점은 두개골 창의 밀봉 및 평탄도를 보장하고 프로브와의 접촉 품질을 최적화하는 것입니다.생체 내 이미징 외에도 사이토카인에 대한 혈액 작업의 샘플링 및 측정, 유세포 분석에 의한 면역 상태 또는 행동 분석과 같은 다른 측정 및 기술과 우리의 프로토콜을 결합하는 것을 고려할 수 있습니다. 이 연구는 암에 대한 유연한 이식형 장치의 사용을 위한 길을 열어주고 이 만성 질환에 대한 생체 전자 의학의 사용에 대한 새로운 전망을 열어줍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

주변 종양 주위 영역으로의 종양 세포 침윤을 특징으로 하는 침윤성 종양인 재발성 교모세포종 진단을 받은 마취된 인간 환자부터 시작합니다.종양 주위 영역은 내피 세포 사이의 긴밀한 접합부가 약물 침투를 제한하는 온전한 혈액-뇌 장벽(BBB)을 유지합니다.두피를 절개하고 두개골에 구멍을 만든 다음 MRI 유도를 사용하여 종양 코어에 레이저 프로브를 삽입합니다.프로브를 통해 레이저 광을 전달합니다.조직 발색단은 빛을 흡수하여 열로 변환하여 국부적인 온열요법 또는 조직 온도 상승을 생성합니다.레이저는 열 구배를 유도하여 온도가 종양 코어에서 최고조에 달하고 주변으로 갈수록 감소합니다.높은 심부 온도는 세포 단백질을 변성시키고 세포 사멸의 한 형태인 응고 괴사를 유발합니다.말초의 적당한 온열요법은 BBB의 밀착 접합부를 방해합니다.일시적인 BBB 파괴는 종양 주위 영역에서 침윤하는 종양 세포로의 약물 전달을 촉진합니다.

레이저 유도 온열요법을 통한 재발성 교모세포종에서 약물 전달 강화

출처: Lefevre, MC, et al., 교모세포종의 펄스 전기장 치료를 위한 유연한 유기 전자 장치. J. Vis. 경험. (2022년)이 비디오는 신경 치료 응용 분야를 위한 표적 펄스 전기장 요법을 제공하기 위해 교모세포종 마우스 모델에 유연하고 생체 적합성 프로브를 이식하는 방법을 보여줍니다.

교모세포종 마우스 모델에서 유연한 생체 적합성 프로브 이식

이 동영상은 인간 뇌종양 모델에 Tumor Treating Fields 또는 TTFields를 적용하는 방법을 보여줍니다. 이 비침습적 기술은 저강도 교대 전기장을 뇌에 직접 전달하여 세포 분열과 그에 따른 세포사멸을 억제합니다.

인간 뇌종양 모델의 종양 치료 필드 응용 프로그램: 뇌종양 치료를 위해 인간 뇌에 교대 전기장을 전달하는 비침습적 기술

재발 성 아교 모세포종의 치료에 사용되는 신규 한 방법을 설명한다. 이러한 치료 방법은 베바 시주 맙은 현재 FDA는 단일 요법으로 승인 대상 에이전트와 조합 TTF 요법으로 알려진 전기 종양 필드 (TTFields)을 치료를 교대로의 적용을 사용한다.

재발 성 아교 모세포종의 치료를 위해 베바 시주 맙과 조합하여 필드 요법 치료 종양

종양 치료 필드 (TTFields)은 낮은 강도, 중간 주파수, 전기장을 교류의 연속적인 비 관혈적 애플리케이션을 통해 전달되는 효과적인 항암 치료 방법이다. TTFields 체외 응용 시스템을 이용하여 세포주 TTFields 애플리케이션 세포 수의 높은 감소를 유도하는 최적의 주파수의 결정을 허용한다.

필드를 치료 종양을 사용하여 암 세포에 대한 최적의 억제 주파수 (TTFields를) 결정

세포종은 가장 일반적이 고 적극적인 주 뇌 암 성인, 대부분 종양 초기 치료 후 재발 이다. 종양 치료 분야 (TTFields) 치료는 세포종에 대 한 최신 치료 양식 적임 이다. 여기, 우리는 적절 한 응용 프로그램 설명 TTFields 변환기 배열의 환자에 이론 및 치료의 측면을 토론.

종양 세포종 필드 치료 치료의 임상 적용

이 프로토콜은 생물학적 조직을 자극하는 데 사용되는 전기 및 자기 자극기를 모두 구축하는 단계별 프로세스를 설명합니다. 이 프로토콜에는 전산 전기 및 자기장을 시뮬레이션하고 자극기 장치의 제조를 위한 지침이 포함되어 있습니다.

생물학적 조직의 자극을 위한 전기 및 자기장 장치

여기에서는 자기 공명 유도 집속 초음파를 사용하여 생체 내 마우스 교모세포종 모델에서 초음파 역학 치료를 수행하는 방법을 자세히 설명하는 프로토콜을 설명합니다.

휴대용 Benchtop Focused Ultrasound System을 사용한 마우스 모델의 다형 교모세포종 치료를 위한 Sonodynamic Therapy

우리는 전극 제조를 위한 간단하고 비용 효율적인 접근 방식을 개발했으며 자유롭게 움직이는 마우스에서 여러 영역에 걸쳐 신호를 기록했습니다. 다중 지역 전기 생리학 및 칼슘 신호 기록과 함께 광유전학을 활용하면 발작 점화 모델에서 여러 지역의 신경 활동을 밝힐 수 있었습니다.

Multi-Region In vivo Recording을 위한 유연하고 편리한 전기생리학적 Optrodes를 제작하기 위한 통합 방법

당사의 특허 받은 맞춤형 3D 프린팅 헤드기어는 사무실 내 및 원격으로 전달되는 다중 전극 경두개 전기 자극(ME-tES)을 빠르고 안정적으로 전달합니다.

다중 전극 경두개 전기 자극을 위한 맞춤형 3D 프린팅 헤드기어

이 프로토콜은 척추 전이에 대한 환자별 전기장 시뮬레이션 및 검증을 위한 완전하고 재현 가능한 워크플로우를 설명합니다. 이 워크플로우는 다중 모달 영상, 반자동 및 수동 분할, 조직 전도도 모델링, 선형 유한 요소 전기장 시뮬레이션, 그리고 시술 후 MRI 기반 괴사 중복 분석을 통한 실험적 검증을 통합합니다.

척추 전이 전기화학요법에서의 환자별 전기장 시뮬레이션

학습하세요 교모세포종 치료를 위한 유연한 유기 전자 장치를 이용한 펄스 전기장 전달 방법을. 생체 내 종양 미세환경을 시각화하고 정밀 의학을 위한 바이오전자학의 잠재력을 탐색합니다.

교모세포종의 펄스 전기장 치료를 위한 유연한 유기 전자 장치

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