Name: 살아있는 애기장대 뿌리의 표피 세포의 물리적 특성을 연구하기 위한 원자력 현미경 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-31T13:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: 배우세요 살아있는 애기장대 뿌리 표피 세포의 물리적 특성을 원자력 현미경으로 분석하는 방법을. 비침습적 기술로 세포벽 변화를 정량화하고 기관 성장과 연관시켜 식물 발달 생물학 연구에 활용합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 연구는 CSIC I + D 2018, 보조금 번호 95 (Mariana Sotelo Silveira)의 자금 지원을 받았습니다.; CSIC 그루포스 (오마르 보르사니) 와 페데시바.

1. 식물 재료의 준비 및 성장 조건
<ol><li>필요한 식물 재료를 생성하려면 Arabidopsis 야생형과 돌연변이 관심 라인의 씨앗을 살균하십시오. 참고: 이 프로토콜에서는 다음을 사용했습니다: ttl1: T-DNA 삽입 라인 Salk_063943(TTL1의 경우; AT1G53300) - 콜롬비아-0(Col-0) 야생형; 앞서 10,11에 기술된 바와 같이 CESA6 유전자(AT5G64740)의 녹아웃 돌연변이(Q720stop)로 구성된 Procuste1(prc1-1) 돌연변이; 및 TTL1 x PRC1-1 이중 돌연변이체.<ol><li>대략 50μL의 씨앗을 마이크로 튜브에 넣습니다. 실온에서 70% 에탄올 + 0.01% 트윈 용액 500μL를 추가합니다. 7 분 동안 혼합하고 배양하십시오.</li>
		<li>에탄올 용액을 붓고 20% 차아염소산나트륨 500μL를 추가합니다. 7 분 동안 혼합하고 배양하십시오.</li>
		<li>차아 염소산 나트륨 용액을 부어 멸균 수로 씨앗을 3-4 회 씻으십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>도금<ol><li>미리 기초 무라시게 및 스쿠그(MS) 배지12 + 1.5% 수크로스 + 1% 한천(pH 5.7)을 준비한다( 재료 표 참조). 매체를 오토 클레이브하십시오. 멸균 환경에서 작동하도록 층류 후드를 준비하고 실험에 필요한 사각형 페트리 접시에 라벨을 붙입니다. 배지를 페트리 접시에 붓고 배지가 고형화되도록 합니다.</li>
		<li>멸균 피펫 팁을 사용하여 멸균 된 씨앗을 배지가 들어있는 사각형 페트리 접시에 접시에 담습니다. 씨앗을 두 줄로 골고루 분배하십시오. 씨앗이 마르면 뚜껑을 닫고 판을 밀봉하십시오. 씨앗을 4 일 동안 어둠 속에서 4 ° C에서 층화하십시오. 참고 : 발아를 동기화하려면 층화가 필요합니다.</li>
		<li>플레이트를 25μmol m 2s-1 광도 및23°C(낮/밤)의 긴 하루 체제(16시간의 빛/8시간의 어둠)에서 성장 챔버에 수직으로 놓습니다. 묘목을 7 일 동안 재배하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 삼투압 스트레스 치료(선택 사항)
참고: 이 섹션에서는 극저온 삼투압계(재료 표)로 추정한 -1.2MPa의 삼투압 잠재력에서 애기장대 뿌리의 성장에 대한 세부 정보를 제공합니다. 이 부분은 당면한 실험 질문에 따라 생략하거나 변경할 수 있습니다.
<ol><li>기저 MS 배지 + 1.5% 수크로스 + 400 mM 만니톨 + 1% 한천 (pH 5.7)을 준비한다. 매체를 오토 클레이브하십시오. 층류 후드의 사각형 페트리 접시에 매체를 붓고 매체가 고형화되도록 합니다.</li>
	<li>핀셋 (재료 표)을 사용하여 400mM 만니톨이 보충 된 배지를 포함하는 정사각형 페트리 접시에 기초 MS + 1.5 % 자당 배지에서 미리 자란 5 일 된 묘목을 놓습니다. 플레이트를 1.2.3 단계와 동일한 조건으로 성장 챔버에 수직으로 놓습니다. 이 삼투압 스트레스 조건에서 7 일 동안 묘목을 재배하십시오. 참고 : 심한 삼투압 스트레스 동안 1 차 뿌리의 뿌리 성장 적응을 평가하려면 뿌리 분열 조직 크기가 이미 설정되어 있는지 확인하기 위해 통제 된 조건에서 자란 발아 5 일 후 묘목을 사용하는 것이 좋습니다13. 대안적으로, 삼투압 스트레스 작용의 발달 효과를 결정하기 위해 발달의 모든 단계에서 분석을 수행 할 수있다.</li>
</ol>3. 원자력 현미경(AFM) 나노인덴테이션 실험
<ol><li>나노인덴테이션 실험을 위한 시료의 제조 참고 : 이것은 살아있는 생물학적 샘플 연구에 AFM을 적용하기위한 중요한 단계입니다. 샘플은 압입 측정 중에 기계적으로 안정되도록 기판에 단단히 부착되어야 합니다. 동시에 샘플 구조적 품질을 보존해야합니다. AFM에 대한 큰 샘플을 안정화하는 효과적인 전략은 접착제를 사용하는 것입니다. 접착제는 빠르게 건조되어야 하며 독성이 있거나 주변 매체와 반응하지 않아야 합니다. 이 프로토콜에서는 폴리스티렌 페트리 접시를 기질로 사용하고 비산성 실리콘 접착제 (재료 표)를 사용하여 애기장 묘목을 묶었습니다.<ol><li>커버 슬립으로 페트리 접시에 실리콘 접착제의 얇은 층을 펼칩니다. 접착제를 공기 중에 45 초 동안 그대로 두십시오.</li>
		<li>핀셋을 사용하여 묘목을 접착제 위에 놓고 묘목의 튀어 나온 부분과 캔틸레버 사이의 접촉을 피하는 방향으로 향하게하십시오. 그런 다음 뿌리를 실리콘 접착제 층에 부드럽게 눌러 단단히 묶습니다. 프로토콜의 다음 단계를 계속하기 전에 묘목을 접착제와 45초 동안 접촉시키십시오.</li>
		<li>부착 된 묘목을 2 μg / mL 요오드화 프로피듐 (PI; 재료 표) 어두운 곳에서 5 분 동안 조심스럽게 1x 인산염 완충 식염수 (PBS) 용액 (재료 표)으로 세 번 씻으십시오.</li>
		<li>PI 배양 된 묘목을 AFM과 결합 된 도립 형광 현미경에 넣습니다. 형광을 관찰하려면 여기 및 방출 파장을 각각 572nm 및 617nm로 설정하십시오. 표피 세포 내부에 형광이 없으면 뿌리의 생존 가능성이 확인됩니다.</li>
		<li>묘목을 1x 인산염 완충 식염수 (PBS) 용액으로 덮으십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>들여쓰기 프로토콜 알림: 실온에서 지지대에 샘플을 고정한 후 1시간 이내에 모든 AFM 측정을 수행하십시오. AFM이있는 방은 에어컨으로 25 ° C로 유지해야합니다. PBS 용액은 동일한 온도에 있어야합니다.<ol><li>피라미드 팁이 있는 표준 실리콘 질화물 캔틸레버(재료 표 참조)를 유체용 AFM 프로브 홀더(재료 표)에 장착합니다.</li>
		<li>캔틸레버의 레이저를 팁의 위치에 가깝게 정렬합니다. 그런 다음 포토 다이오드를 움직여 레이저 스폿을 검출기 중앙에 놓습니다.</li>
		<li>편향 감도를 보정하려면 AFM 아래에 1x PBS가 있는 폴리스티렌 페트리 접시를 놓습니다. 참고: 이 단계는 들여쓰기를 계산하는 데 필요합니다. 단단한 표면에서 힘을 측정할 때 표면에 압입이 없으므로 z 스캐너 변위의 변화는 캔틸레버 처짐에 해당합니다. 따라서 단단한 표면에서 편향 감도를 보정하는 것이 매우 중요합니다. 부드러운 표면을 사용하면 편향 감도가 과대 평가되어 스프링 상수가 너무 낮아집니다.</li>
		<li>비접촉 편향이 0V에 가까워지도록 광검출기를 조정합니다. 램프 크기가 3μm, 압입 및 수축률이 0.6μm/s, 트리거 임계값이 0.5V인 압입(힘 곡선)을 수행하여 편향 감도를 보정합니다.</li>
		<li>캔틸레버의 스프링 상수를 교정하려면 스프링 상수가 약 5N/m 미만인 프로브에 권장되는 AFM 소프트웨어(재료 표)의 열 조정 유틸리티를 사용하거나 참조14에 설명된 방법을 사용하십시오. 소프트웨어에서 Thermal Tune을 활성화하기 전에 프로브가 샘플과 상호 작용하지 않는지 확인하십시오.<ol><li>캔틸레버 온도를 입력하십시오. &gt; 열 튜닝 보정 또는 NanoScope 도구 모음의 열 튜닝 아이콘을 클릭합니다. 주파수 범위(1-100Hz)를 선택합니다.</li>
			<li>Thermal Tune 패널에서 데이터 수집을 클릭합니다. AFM이 데이터를 수집할 때까지 기다린 다음 단순 고조파 발진기(유체) 버튼을 클릭합니다.</li>
			<li>중앙값 필터 너비를 3으로 조정합니다. PSD Bin 너비를 조정하여 평균화하여 수집된 데이터의 노이즈를 줄입니다. 첫 번째 공진 피크 주위에 맞춤 경계를 설정합니다.</li>
			<li>스프링 상수 k 계산을 클릭한 다음 사용자가 이 값을 사용할 것인지 묻는 팝업 창에서 예를 클릭합니다.</li>
			<li>위에서 설명한 단계를 세 번 반복하고 수동으로 스프링 상수 값의 평균을 취하십시오. PicoForce 보기의 램프 매개변수 리스트에 있는 스프링 상수 상자에 이 평균값을 입력합니다. 이 시점에서 보정이 종료됩니다.</li>
		</ol></li>
		<li>10x, 20x 및 40x 접안 렌즈 배율의 도립 광학 현미경을 사용하여 AFM 프로브를 1 차 뿌리의 네 번째 길쭉한 표피 세포 표면에 배치하여 세포 중앙에 위치시킵니다.</li>
		<li>계산된 스프링 상수 값(단계 3.2.5.5)을 사용하여 선택한 지점에서 램프 크기 3μm, 트리거 임계값 11nN, 압입 및 수축 속도 0.6μm/s의 힘 곡선을 얻습니다. 참고 : 이전 작업15,16은 낮은 빈도의 압입 및 수축이 히스테리시스와 항력을 최소화하는 데 도움이된다는 것을 발견했습니다.</li>
		<li>각 처리에 대해 뿌리당 3개의 세포에서 힘 곡선을 얻습니다(처리당 3개의 생물학적 복제물 사용). 각 루트에 대해 최소 150개의 힘 곡선을 캡처합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>4. 겉보기 영률 측정
<ol><li>각 힘 곡선을 피라미드 압자17에 대한 다음 모형에 피팅합니다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63533/63533eq01.jpg" style="margin: auto;">여기서 E 는 표본의 겉보기 영률이고, 는 표본의 포아송 계수이고, <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63533/63533eq02.jpg" style="margin: auto;"> α 는 꼭짓점에 대한 반각입니다. 상관 계수(r2)가 0.99&lt; 피팅을 폐기합니다. 완전히 비압축성 재료에 대한 푸아송의 비율: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63533/63533eq02.jpg" style="margin: auto;"> = 0.5 및 제조업체가 제공한 압자의 형상을 고려하십시오. 참고: 피팅이 세포벽 역학에 최대한 민감하고 겉보기 영률 값에 대한 팽창 압력의 영향을 줄이기 위해 로딩 곡선의 접촉점에서 처음 100nm를 사용하십시오.8. 피팅은 로딩 곡선의 접점에서 특정 압입 깊이를 설정할 수 있는 맞춤형 MATLAB 프로그램(JC B에 쓰기를 통해 개인적인 요청에 따라 사용 가능)을 사용하여 수행되었습니다.</li>
	<li>명백한 영률 데이터로 정규화된 히스토그램을 만들고 가우스 분포에 맞춥니다. 95% 신뢰 구간을 벗어난 데이터 점을 버리고 히스토그램과 가우스 피팅을 모두 다시 계산합니다. 겉보기 영률의 평균과 표준 편차를 계산하고 보고합니다.</li>
	<li>ANOVA와 같은 다중 비교 검정을 통해 그룹 간 비교의 유의성을 결정합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Anderson, C. T., Kieber, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+construction%2C+perception%2C+and+remodeling+of+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic construction, perception, and remodeling of plant cell walls.</a> Annual Review of Plant Biology. 71, 39-69 (2020).</li>
<li>Roeder, A. H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fifteen+compelling+open+questions+in+plant+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Fifteen compelling open questions in plant cell biology.</a> The Plant Cell. 34 (1), 72-102 (2022).</li>
<li>Zhang, B., Gao, Y., Zhang, L., Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plant+cell+wall%3A+Biosynthesis%2C+construction%2C+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Integrative+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">The plant cell wall: Biosynthesis, construction, and functions.</a> Journal of Integrative Plant Biology. 63 (1), 251-272 (2021).</li>
<li>Hamant, O., Haswell, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+behind+the+wall%3A+Sensing+mechanical+cues+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Life behind the wall: Sensing mechanical cues in plants.</a> BMC Biology. 15 (59), 1-9 (2017).</li>
<li>Scheres, B., Benfey, P., Dolan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Root+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+Arabidopsis+Book%22%5BJournal%5D)">Root development.</a> The Arabidopsis Book. 1, 0101(2002).</li>
<li>Cuadrado-Pedetti, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+arabidopsis+tetratricopeptide+thioredoxin-like+1+gene+is+involved+in+anisotropic+root+growth+during+osmotic+stress+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">The arabidopsis tetratricopeptide thioredoxin-like 1 gene is involved in anisotropic root growth during osmotic stress adaptation.</a> Genes. 12 (2), 236(2021).</li>
<li>Milani, P., Braybrook, S. A., Boudaoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shrinking+the+hammer%3A+micromechanical+approaches+to+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Shrinking the hammer: micromechanical approaches to morphogenesis.</a> Journal of Experimental Botany. 64 (15), 4651-4662 (2013).</li>
<li>Braybrook, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+elasticity+of+plant+cells+with+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Measuring the elasticity of plant cells with atomic force microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 125, 237-254 (2015).</li>
<li>Bidhendi, A. J., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+quantify+primary+plant+cell+wall+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Methods to quantify primary plant cell wall mechanics.</a> Journal of Experimental Botany. 70 (14), 3615-3648 (2019).</li>
<li>Desnos, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procuste1+mutants+identify+two+distinct+genetic+pathways+controlling+hypocotyl+cell+elongation%2C+respectively+in+dark-+and+light-grown+Arabidopsis+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Procuste1 mutants identify two distinct genetic pathways controlling hypocotyl cell elongation, respectively in dark- and light-grown Arabidopsis seedlings.</a> Development. 122 (2), 683-693 (1996).</li>
<li>Fagard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procuste1+encodes+a+cellulose+synthase+required+for+normal+cell+elongation+specifically+in+roots+and+dark-grown+hypocotyls+of+arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Procuste1 encodes a cellulose synthase required for normal cell elongation specifically in roots and dark-grown hypocotyls of arabidopsis.</a> The Plant Cell. 12 (12), 2409-2423 (2000).</li>
<li>Murashige, T., Skoog, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+revised+medium+for+rapid+growth+and+bio+assays+with+tobacco+tissue+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Physiologia+Plantarum%22%5BJournal%5D)">A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures.</a> Physiologia Plantarum. 15 (3), 473-497 (1962).</li>
<li>Perilli, S., Sabatini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+root+meristem+size+development%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of root meristem size development.</a> Methods in Molecular Biology. 655, Clifton, N.J. 177-187 (2010).</li>
<li>Sader, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+virtual+instrument+to+standardise+the+calibration+of+atomic+force+microscope+cantilevers%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">A virtual instrument to standardise the calibration of atomic force microscope cantilevers.</a> Review of Scientific Instruments. 87 (9), 093711(2016).</li>
<li>Collinsworth, A. M., Zhang, S., Kraus, W. E., Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apparent+elastic+modulus+and+hysteresis+of+skeletal+muscle+cells+throughout+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Apparent elastic modulus and hysteresis of skeletal muscle cells throughout differentiation.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 283 (4), 1219-1227 (2002).</li>
<li>Mathur, A. B., Collinsworth, A. M., Reichert, W. M., Kraus, W. E., Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial%2C+cardiac+muscle+and+skeletal+muscle+exhibit+different+viscous+and+elastic+properties+as+determined+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Endothelial, cardiac muscle and skeletal muscle exhibit different viscous and elastic properties as determined by atomic force microscopy.</a> Journal of Biomechanics. 34 (12), 1545-1553 (2001).</li>
<li>Sirghi, L., Ponti, J., Broggi, F., Rossi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+elasticity+and+adhesion+of+live+cells+by+atomic+force+microscopy+indentation%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Probing elasticity and adhesion of live cells by atomic force microscopy indentation.</a> European Biophysics Journal. 37 (6), 935-945 (2008).</li>
<li>Peaucelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AFM-based+mapping+of+the+elastic+properties+of+cell+walls%3A+At+tissue%2C+cellular%2C+and+subcellular+resolutions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">AFM-based mapping of the elastic properties of cell walls: At tissue, cellular, and subcellular resolutions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e51317(2014).</li>
<li>Peaucelle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pectin-induced+changes+in+cell+wall+mechanics+underlie+organ+initiation+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis.</a> Current Biology. 21 (20), 1720-1726 (2011).</li>
<li>Fernandes, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+epidermal+cells+of+whole+living+roots+of+Arabidopsis+thaliana%3A+An+atomic+force+microscopy+study%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+E%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of epidermal cells of whole living roots of Arabidopsis thaliana: An atomic force microscopy study.</a> Physical Review E. 85 (2), 21916(2012).</li>
</ol>

저자는 이해 상충이 없습니다. 데이터를 피팅하는 데 사용되는 MATLAB 스크립트는 개인적인 요청에 따라 J. C. B.에게 편지를 써서 사용할 수 있습니다.

세포 및 세포벽 역학은 역학이 성장 과정에 미치는 영향에 대한 통찰력을 얻기 위해 점점 더 관련성이 높아지고 있습니다. 물리적 힘이 고형 조직에서 상당한 거리에 걸쳐 전파됨에 따라 세포벽의 물리적 특성 변화와 이러한 특성이 식물의 성장을 감지, 제어, 조정 및 영향을 미치는 방법에 대한 연구가 중요한 연구 분야가 되고 있습니다 2,3,8.
애기장대 뿌리의 신장 영역에서 세포의 세포벽 물리적 특성을 연구하기위한 방법이 여기에 제시됩니다. AFM 기술은 뿌리 성장에서 세포벽 물리적 특성의 효과를 이해하기 위해 성장 속도 연구와 같은 다른 기술과 쉽게 결합 될 수 있습니다.
가장 중요한 실험 단계 중 하나는 샘플의 기계적 고정화입니다. 샘플은 들여쓰기되어 있는 동안 샘플...

식물 세포는 세포 유형과 성장 단계에 따라 두께가 0.1에서 수 μm까지 다양한 다당류, 단백질, 대사 산물 및 물의 상호 작용 네트워크로 구성된 복잡한 구조 인 세포벽으로 둘러싸여 있습니다 1,2. 세포벽의 기계적 특성은 식물의 성장에 필수적인 역할을 합니다. 세포벽의 낮은 강성 값은 세포 성장 및 세포벽 확장의 전제 조건으로 제안되었으며 모든 세포가 기능을 수행하기 위해 기계적 힘을 감지한다는 증거가 증가하고 있습니다. 그러나 세포벽의 물리적 특성의 변화가 세포 운명 2,3,4를 결정하는지 여부는 여전히 논쟁의 여지가 있습니다. 식물 세포는 발달 중에 움직이지 않기 때문에 장기의 최종 모양은 세포가 얼마나 멀리 그리고 어떤 방향으로 확장되는지에 달려 있습니다. 따라서, 애기장대 뿌리는 뿌리의 다른 영역에서 다른 유형의 확장이 발생하기 때문에 세포 확장에서 세포벽 물리적 특성의 영향을 연구하기에 좋은 모델입니다. 예를 들어, 이방성 확장은 신장 영역에서 그리고 특히 표피 세포에서 두드러지게 나타난다5.
여기에 설명 된 방법은 도립 형광 위상 현미경 6과 결합 된 원자력 현미경 (AFM)을 사용하여 살아있는 애기장대 뿌리의 나노 스케일에서 표피 세포의 세포벽의 물리적 특성을 특성화하는 데사용되었습니다. AFM 기술의 광범위한 개정판은 7,8,9를 참조하십시오.
이 프로토콜은 식물 세포벽의 AFM 기반 탄성 측정을 위한 기본 샘플 준비 방법과 일반적인 방법을 간략하게 설명합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63533/63533fig01v2.jpg"> 그림 1: 원자력 현미경(AFM)을 사용한 애기장대 뿌리의 힘 압입 실험의 개략적인 개요. 이 계획은 뿌리 샘플을 단단히 고정하기 위한 기질 준비(1-2), 요오드화 프로피듐 염색을 통한 뿌리 생존력 확인(3), 1차 뿌리의 길쭉한 표피 세포 표면에 캔틸레버 위치(4-5), 힘 곡선 측정(6) 및 겉보기 영률을 계산하기 위한 힘 곡선 처리(7-8). EZ: 신장 영역. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63533/63533fig01largev2.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>1 x 인산염 완충 식염수(PBS)</td><td></td><td></td><td>는 염화나트륨과 인산염 완충액을 포함하며 삼투압 쇼크를 방지하고 살아있는 세포의 수분 균형을 유지하도록 제조되었습니다.</td></tr><tr><td>AFM 소프트웨어</td><td>Bruker, Billerica, MA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Atomic force microscopy (AFM)</td><td>BioScope Catalyst, Bruker, Billerica, MA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Catalyst Probe holder-fluid</td><td>Bruker, Billerica, MA, USA</td><td>CAT-FCH</td><td>Bioscope Catalyst용 프로브 홀더로, 접촉 또는 탭핑 모드에서 유체 작동을 위해 설계되었습니다. 공기 작동과도 호환됩니다.</td></tr><tr><td>극저온 투압계; 모델 OSMOMAT 030</td><td>Gonotech, Berlin, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murashige & Skoog Medium</td><td>Duchess Biochemie</td><td>M0221</td><td>Original concentration, (1962)</td></tr><tr>AFM <td>Olympus IX81, Miami, FL, USA</td><td></td><td></td>PEGAMIL Anaerobicos S.R.L., Buenos Aires, Argentina 100429에 <td>결합된 광학 도립 현미경</td></tr> 중<tr><td></td><td></td><td></td><td>성, 비산성 실리콘 접착제</td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Deltalab</td><td>200201.B</td><td>폴리스티렌, 55 x 14mm, 방사선 멸균.</td></tr><tr><td>Propidium iodide</td><td>Sigma</td><td>P4170</td><td>뿌리 생존 능력 테스트용.</td></tr><tr><td>질화규소 프로브, DNP-10, 캔틸레버 A</td><td>Bruker, Billerica, MA, USA</td><td>DNP-10/A</td><td>액체 작동의 힘 조절 현미경용. 프로브 팁 반경 20-60nm. 175-&뮤; M-긴 삼각형 캔틸레버,&nbsp; 0.35 N/m의 스프링 상수.</td></tr><tr><td>핀셋</td><td>Sigma</td><td>T4537</td><td></td></tr></tbody></table>

살아있는 애기장대 뿌리의 표피 세포의 물리적 특성을 연구하기 위한 원자력 현미경

Atomic Force Microscopy to Study the Physical Properties of Epidermal Cells of Live Arabidopsis Roots

광학 도립 형광 현미경과 결합 된 원자력 현미경 (AFM)으로 나노 압입을 통해 살아있는 애기장대 뿌리의 표피 세포 세포벽의 물리적 특성을 특성화하는 방법이 여기에 설명되어 있습니다. 이 방법은 변형을 측정하는 동안 샘플에 제어된 힘을 가하는 것으로 구성되어 세포 내 분해능에서 세포벽의 겉보기 영률과 같은 파라미터를 정량화할 수 있습니다. 샘플의 신중한 기계적 고정과 압자 및 압입 깊이의 올바른 선택이 필요합니다. 외부 조직에서만 사용할 수 있지만이 방법을 사용하면 발달 중 식물 세포벽의 기계적 변화를 특성화 할 수 있으며 이러한 미세한 변화와 전체 장기의 성장의 상관 관계를 가능하게합니다.

힘-압입 실험 다음 텍스트는 프로토콜이 잘 실행될 때 예상되는 일반적인 출력을 보여주기 위해 강제 들여쓰기 실험을 수행할 때 예상되는 몇 가지 결과를 제공합니다.
힘-변위 곡선 루트 신장 영역의 셀 중앙에 배치된 위치에서 살아있는 샘플을 들여쓰기하여 얻은 대표적인 힘 압입 플롯이 그림 2에 나와 있습니다. AFM 팁이 세포벽의 표면을 들여쓰기 시작하면 변형에 대한 세포벽 반대 때문에 힘이 증가하기 시작합니다( 그림 1A에서 2로 표시됨). 힘 (하중)의 증가는 최대 힘 값에 도달 할 때까지 계속됩니다 ( 그림 2A에서 2로 표시). 이 시점이 지나면 들여 쓰기의 언로드 부분이 시작됩니다.
<p class="jove_content biglegen...

원자력 현미경 압입 프로토콜은 정상 또는 제한된 성장 (즉, 물 부족 상태) 동안 조직 또는 기관의 특정 세포의 세포벽의 물리적 특성의 역할을 해부 할 수있는 가능성을 제공합니다.

A method is described here to characterize the physical properties of the cell wall of epidermal cells of living Arabidopsis roots through ...

이 방법을 사용하면 발달 중 식물 세포벽의 물리적 특성 변화를 정량화하고이 미세한 변화를 전체 장기의 성장과 관련시킬 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 침습적이지 않으며 세포벽의 물리적 특성의 생체 내 정량화가 세포 내 분해능을 비교적 빠르게 추가 할 수있는 치료가 필요하지 않다는 것입니다. 시작하려면 커버 슬립으로 페트리 접시에 실리콘 접착제의 얇은 층을 펴고 45 초 동안 공기 중에 두십시오.핀셋을 사용하여 묘목을 접착제 위에 놓고 묘목의 튀어 나온 부분과 캔틸레버 사이의 접촉을 피하기 위해 방향을 향하게하십시오. 그런 다음 뿌리를 실리콘 접착제 층에 부드럽게 눌러 단단히 묶습니다. 45초 동안 그대로 두고 1X PBS 솔루션을 추가합니다.피라미드 팁이 있는 표준 실리콘 질화물 캔틸레버를 유체용 AFM 프로브 홀더에 장착하고 캔틸레버의 레이저를 팁 위치에 가깝게 정렬합니다. 그런 다음 포토 다이오드를 움직여 레이저 스폿을 검출기 중앙에 배치합니다. 램프 크기가 3마이크로미터, 압입 및 수축률이 초당 0.6마이크로미터, 트리거 임계값이 0.5V인 압입 감도를 수행하여 편향 감도를 보정합니다.프로브가 샘플과 상호 작용하지 않는지 확인하고 캔틸레버의 스프링 상수를 보정합니다. 열 조정 유틸리티를 사용하여 보정을 클릭한 다음 열 조정을 클릭하거나 나노 스코프 도구 모음의 열 조정 아이콘을 클릭하고 캔틸레버 온도를 입력합니다. 주파수 범위를 선택한 후 샘플 고조파 발진기 유체 버튼을 클릭합니다.그런 다음 열 조정 패널에서 수집된 데이터를 클릭합니다. 이제 중앙값 필터 너비를 3으로 조정합니다. PSD binwidth를 조정하여 평균화하여 수집된 데이터의 노이즈를 줄이고 첫 번째 공진 피크 주변의 피팅 경계를 설정합니다.스프링 상수 K 계산을 클릭 한 다음 팝업 창에서 예를 클릭하여 사용자가이 값을 사용할 것인지 묻습니다. 10, 20 및 40 배 접안 렌즈 배율의 도립 광학 현미경을 사용하여 AFM 프로브를 1 차 뿌리의 네 번째 길쭉한 표피 세포 표면에 배치하여 세포 중앙에 위치시킵니다. 이전에 계산 된 스프링 상수 값으로 3 마이크로 미터의 램프 크기, 11 나노 뉴턴의 트리거 임계 값, 선택한 지점에서 초당 0.6 마이크로 미터의 압입 및 수축 속도를 갖는 힘 곡선을 얻었습니다.각 처리에 대해 루트당 3개의 셀에서 힘 곡선을 얻고 각 루트에 대해 최소 150개의 힘 곡선을 캡처합니다. 이 그림은 루트 신장 영역의 셀 중심에 위치한 라이브 샘플에 대해 힘 압입 실험을 수행할 때 예상되는 결과를 보여줍니다. AFM 팁이 들여쓰기를 시작하면, 세포벽의 표면이 명예훼손에 반대하기 때문에 힘이 증가하기 시작한다.힘의 증가는 최대 힘 값에 도달할 때까지 계속됩니다. 이 시점이 지나면 들여 쓰기의 언로드 부분이 시작됩니다. 압입 부분의 포물선을 따라 힘이 증가하며, 이는 계산에 사용되는 피라미드 압자에 대한 예측 모델에 각 곡선을 맞추는 데 중요합니다.피팅 매개 변수로서 접촉점 위치는 압입 전의 셀 벽 표면과 일치해야하며 AFM 팁 변위의 원점으로 간주됩니다. 압입 전에 접촉점을 감지 할 수없는 힘 곡선은 버려야합니다. 또한, 힘 압입 실험의 로딩 및 언로딩 곡선에는 노이즈가 없어야 합니다.각 힘 곡선을 모델에 맞춘 후, 겉보기 영률의 얻어진 값의 빈도 분포를 보여주는 히스토그램을 얻었다. 이 히스토그램은 대조 조건에서 성장한 Columbia Zero의 3 개의 서로 다른 식물의 9 개의 다른 세포에 대해 201 개의 성공적인 들여 쓰기 세트로 얻은 빈도를 보여줍니다. 들여쓰기는 뿌리의 형태로 인해 일부 유전자형의 경우 어려울 수 있습니다.예를 들어, TTL 1PRC 1-1 이중 돌연변이체는 심각한 삼투압 스트레스에서 성장하였다. 이 히스토그램은 9 개의 서로 다른 세포에서 얻은 겉보기 영률 값의 확률 분포를 보여줍니다. 하나의 셀에 해당하는 히스토그램 H만 가우스 분포에 맞출 수 있습니다.여기에 제시된 금속은 성장 속도 연구 또는 세포벽의 화학적 조성 분석과 같은 다른 기술과 결합 될 수 있습니다. 이러한 다른 기술은 세포벽의 물리적 특성에 대한 화학적 조성이 장기의 성장에 어떻게 영향을 미치는지 이해하기 위해 정보를 더욱 보완합니다.

atomic-force-microscopy-to-study-physical-properties-epidermal-cells

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 stomatal 차별화를 문서화, 개발 며칠 동안 표피의 공 촛점 이미징을위한 식물 cotyledons를 고정하기 위해 챔버 슬라이드 및 미디어를 사용하여 프로토콜을 설명합니다. 형광 태그 단백질은 세포 분열과 세포 형 차별화 중에 가능한 역할의 이해를 증가 표현과 subcellular 지방화에 의해 동적으로 추적 할 수 있습니다.

의 장기, 고해상도 공 촛점 시간 경과 영상<em&gt; Arabidopsis 떡잎</em발아시&gt; 표피

원자력 현미경(AFM)을 사용하여 식물 조직의 기계적 특성을 매핑하는 방법을 설명합니다. 우리는 식물 발달 중 세포벽에서 발생하는 기계적 변화를 광시야 중간 규모로 기록하여 이러한 변화가 성장 및 형태 형성과 상관 관계가 있을 수 있도록 하는 방법에 중점을 둡니다.

셀 벽의 탄성 특성의 AFM 기반의 매핑 : 조직, 세포 및 세포 이하의 해상도에서

이 프로토콜의 목적은 기공 복합체의 세포 피질에, GFP - 태그 PATROL1, 막 인신 매매 단백질의 점을 점멸 표시 가변 각도 표면 형광 현미경으로 식물 세포 표면에 형광 표지 된 단백질의 역학을 모니터링하는 방법을 설명하는 것입니다 애기 장대.

가변 각도 표면 형광 현미경으로 식물 세포 표면 역학의 실시간 영상

결정질 셀룰로오스는 식물 세포벽의 중요한 구성 성분입니다. 그러나 세포 분해능에서 정량화하는 것은 기술적으로 어렵습니다.  여기에서는 시공간 해상도에서 세포벽 구성에 대한 정보를 얻기 위해 편광 기술과 뿌리 단면을 사용하는 방법을 보고합니다.

에서 결정 셀룰로오스 축적의 높은 해상도 정량<em&gt; 애기 장대</em&gt; 뿌리 조직 특이 세포 벽 수정을 모니터링하는

이 문서에서는 기본 루트 및 루트 머리카락 하나의 광학 평면을 제한 하는 2 층 미세 플랫폼에서 애기 thaliana 묘 문화 하는 방법을 보여줍니다. 이 플랫폼은 다른 방법으로 고해상도 영상 뿐만 아니라 좋은 루트 형태학의 실시간 광학 영상에 대 한 사용할 수 있습니다.

2 층 미세 플랫폼에서 애기 모종의 루트 머리 형태를 이미징

여기에서, 우리는 세포와 조직에 나노 및 마이크로 들여 쓰기 공구로 작동하는 원자력 현미경 검사법 (AFM)를 제시합니다. 이 계측기는 시료의 3D 표면 지형과 세포벽 Young의 계수및 터거 압력을 포함한 기계적 특성을 동시에 수집할 수 있습니다.

식물 세포 및 식물 조직의 기계적 특성 및 터거 압력을 측정하기 위해 원자력 현미경 검사법 사용

여기서 우리는 촬영 에 피질 미세 투하 세포 골격의 살아있는 세포 이미징을위한 프로토콜을 설명하고 물리적 인 힘의 변화에 대한 반응을 모니터링.

미생물의 미세 관 세포 골격및 아라비도시스 촬영 Apical 메리스템의 미세 기계적 조작의 라이브 세포 이미징

세포벽 생체 역학에 대한 연구는 식물 성장과 형태 형성을 이해하는 데 필수적입니다. 다음 프로토콜은 원자력 현미경을 사용하여 젊은 식물 기관의 내부 조직에서 얇은 1 차 세포벽을 조사하기 위해 제안됩니다.

원자력 현미경을 사용한 살아있는 식물 장기의 일차 세포벽의 기계적 특성 특성 분석

이 논문은 기공 발달을 제어하는 유전자를 특성화하기 위해 표피 껍질을 사용하지 않는 두 가지 표현형 방법을 설명합니다. 첫 번째 방법은 톨루이딘 블루 O-염색 식물 표피를 사용하여 기공 표현형을 분석하는 방법을 보여줍니다. 두 번째 방법은 기공 리간드를 식별하고 생물학적 활성을 모니터링하는 방법을 설명합니다.

표피 표현형 점수를 통한 기공 발달에 관여하는 유전자 식별

원형질막 수용체 키나아제의 막 이동 이벤트를 연구하기 위해 일반적으로 사용되는 몇 가지 방법이 여기에 소개됩니다. 이 원고는 식물 재료 준비, 약리학적 처리 및 컨포칼 이미징 설정을 포함한 자세한 프로토콜을 설명합니다.

기공 계통 세포에서 막 트래피킹 사건을 연구하기 위한 이미지 기반 방법

이 과정은 공초점 현미경과 형광 표지된 핵 및 염색질 마커 라인을 결합하여 애 기장대 뿌리의 핵과 염색질 역학을 동시에 기록하고, 발달 및 환경 신호에 반응하여 이러한 역학 변화를 조사  합니다.

애기장대 뿌리의 핵 형태와 염색질 역학의 정량적 생세포 영상화 및 발달 및 환경 스트레스 중

배우세요 살아있는 애기장대 뿌리 표피 세포의 물리적 특성을 원자력 현미경으로 분석하는 방법을. 비침습적 기술로 세포벽 변화를 정량화하고 기관 성장과 연관시켜 식물 발달 생물학 연구에 활용합니다.

살아있는 애기장대 뿌리의 표피 세포의 물리적 특성을 연구하기 위한 원자력 현미경

더 많은 동영상 탐색