Name: 라만 염료를 이용한 고도의 다중화 조직 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-21T12:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: 배우세요 epr-SRS 라만 염료 이미징을 활용한 다중화 단백질 분석 기법으로 두꺼운 조직에서 세포 수준 단백질 상호작용을 관찰하는 방법입니다. 이 기술은 신경과학 및 종양 미세환경 연구에 활용됩니다.

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마우스 췌장 조직을 제공해주신 Ruth A. Singer와 Richard K.P. Benninger에게 감사드립니다. W.M.은 NIH R01 (GM128214), R01 (GM132860), R01 (EB029523) 및 미국 육군 (W911NF-19-1-0214)의 지원을 인정합니다.

이 프로토콜은 컬럼비아 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에서 승인 한 동물 실험 프로토콜 (AC-AABD1552)에 따라 수행되었습니다.
1. 라만-염료-컨쥬게이션된 항체의 제조
<ol><li>콘쥬게이션 버퍼를 PBS 완충액 중의 ∼0.1 MNaHCO3 로 제조하고, pH = 8.3, 4°C에서 보관한다.</li>
	<li>무수 DMSO 중에서 3 mM로서 N-하이드록시숙신이미디(NHS) 에스테르 기능화 MARS 프로브(보충 물질) 용액을 제조하였다. MARS 프로브의 합성은 선행 보고13,17,18을 참조할 수 있다. 참고: 저장 목적을 위해, 염료 NHS 에스테르 용액은 빛으로부터 보호되어야 하고 -20°C에서 유지되어야 한다.</li>
	<li>항체 고체를 콘쥬게이션 완충액에 2mg/mL의 농도로 용해시킨다. 다른 완충액에 용해된 항체의 경우, 원심 필터로 1-2 mg/mL의 농도로 콘쥬게이션 버퍼로 교환하십시오. 참고: 고도로 교차-흡착된 이차 항체는 종간 반응성을 최소화하기 위해 멀티플렉스 염색에 바람직하다. 사용된 이차 항체는 표 1 및 표 물질에 열거되어 있다.</li>
	<li>콘쥬게이션 반응을 수행한다.<ol>
<li>이차 항체의 경우, 15배 몰 과량의 염료 용액을 유리 바이알에 넣고 교반하면서 천천히 첨가한다. 예를 들어, 0.5 mL 2 mg/mL 항체 용액에 35 μL 3 mM 염료 용액을 첨가한다.</li>
		<li>반응 혼합물을 1 h 동안 교반하면서 실온 (RT)에서 인큐베이션한다. 빛으로부터 반응을 보호하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>정화.<ol>
<li>겔 여과 수지의 슬러리(표 물질)를 PBS 완충액으로 제조하고, 다음 단계 1.5.2-1.5.4를 수행한다.</li>
		<li>겔 여과 수지 분말 10 mL를 PBS 버퍼 40 mL에 넣고 50-mL 튜브 내부에 넣는다.</li>
		<li>용액을 1 시간 동안 90 °C 수조에 보관하십시오.</li>
		<li>상청액을 데칸트하고 PBS를 40 mL에 다시 첨가한다. 슬러리를 4°C에서 보관한다.</li>
		<li>크기 배제 컬럼 (직경 1-cm, 중력 흐름 컬럼)을 슬러리 용액으로 10-15 cm의 높이로 포장하십시오.</li>
		<li>컬럼을 헹구고 PBS 완충액∼10 mL로 세척하여 수지를 추가로 포장한다.</li>
		<li>콘쥬게이션 반응 혼합물(∼0.5 mL)을 컬럼에 피펫팅한다. 모든 반응 혼합물이 로딩될 때 즉시 PBS 완충액 1 mL를 용출 완충액으로서 첨가한다. 용출 완충액(PBS)을 컬럼에 지속적으로 재충전한다.</li>
		<li>콘쥬게이트 용액의 용출액을 수집하여 컬럼 상의 색상을 보고(MARS 염료는 연한 녹색에서 청색을 띠고 있음) 280 nm에서 흡광도를 측정한다(A280).</li>
	</ol>
</li>
	<li>수집 된 용액을 원심 필터로 1-2 mg / mL로 농축하십시오.</li>
	<li>나노플레이트 리더를 이용하여 접합체 용액의 농도 및 평균 표지 정도(DOL, 염료-단백질 비)를 자외선 가시광선(UV-Vis) 스펙트럼으로 측정하여 확인하였다. 참고 : 보충 자료 는 계산을 위해 MARS 염료 NHS 에스테르의 특성을 제공합니다. 이차 항체에 대한 정상 DOL은 약 3이다.</li>
</ol>2. 조직 샘플 준비
<ol><li>파라포름알데히드는 마우스 뇌 조직을 고정시켰다.<ol>
<li>마우스 (C57BL / 6J, 암컷, 출생 후 25 d)를 이소플루란으로 마취하십시오. 발가락 꼬집음 검사로 적절한 마취를 평가하십시오.</li>
		<li>자궁 경부 변위로 생쥐를 죽여라. 마우스를 PBS 중의 4% 파라포름알데히드 (PFA)로 즉시 경심으로 관류시킨다.</li>
		<li>2.1.4-2.1.5 단계에 따라 마우스 뇌를 수집합니다.</li>
		<li>시상 봉합사를 따라 뇌 줄기에서 위쪽으로 자릅니다. 두개골의 두 반쪽을 옆으로 떼어 내고 트위저로 뇌를 훑어 내십시오.</li>
		<li>수집된 뇌를 PBS 중의 4% PFA에 4°C에서 24시간 동안 고정시켰다. 이어서, 뇌를 PBS 완충액에서 4°C에서 24시간 동안 세척하여 과량의 PFA를 제거하였다.</li>
		<li>단단한 아가로스를 비이커에 최종 농도 7 % (w / v)로 물에 넣고 뚜껑을 느슨하게하십시오. 유리 교반 막대로 용액을 저어줍니다. 용액이 맑아질 때까지 슬러리를 전자 레인지로 가열하십시오.</li>
		<li>아가로스를 45-55°C로 냉각시킨다.</li>
		<li>액체 아가로스를 작은 챔버에 붓고 PBS에서 액체 아가로오스로 뇌를 옮기고 주걱으로 방향을 잡아 뇌를 내장시킵니다. 조직 - 아가로스 블록이 경화 될 때까지 기다리십시오.</li>
		<li>절편된 조직-비브라톰을 사용하여 40-μm 두께의 코로나 슬라이스로 생겨났다.</li>
		<li>다음 염색을 위해 조직을 4-웰 플레이트로 옮긴다. 트위저로 아가로스를 제거하십시오. 조직을 PBS 1 mL로 세 번 세척한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>고정 동결 마우스 췌장 조직.<ol>
<li>마우스 췌장을 PBS 중의 4% PFA에 고정시키고 4°C에서 16-20시간 동안 흔들었다.</li>
		<li>시료를 PBS 1 mL(4°C)로 세 번 세척하여 PFA를 제거하였다.</li>
		<li>시료 (~ 0.3-0.5 cm 크기)를 최적 절삭 온도 (OCT) 복합 블록에 내장하십시오. OCT 2 방울을 플라스틱 냉동 금형에 넣으십시오. 조직을 올바른 방향으로 놓고 조직이 노출되지 않을 때까지 조직 위에 OCT를 붓습니다.</li>
		<li>췌장을 8-μm 두께의 슬라이스로 절편하고, 이를 조직 결합 유리 슬라이드 상에 고정화시키고, 이를 -80°C에 보관한다.</li>
		<li>염색하기 전에, 시편을 RT로 평형화시킨다. 조직을 PBS로 세척하여 OCT 블록을 제거한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>FFPE 샘플.<ol>
<li>FFPE 조직 슬라이드를 60°C에서 10분 동안 구우십시오.</li>
		<li>탈파라핀화 및 재수화: 샘플을 RT의 50mL 튜브에 있는 다음 용액에 순차적으로 넣고 가볍게 흔들면서 매번 3분 동안 복용합니다. 자일렌 두 번, 에탄올을 두 번, 탈이온수에 95% (vol/vol) 에탄올을 두 번, 탈이온수에 70% (vol/vol) 에탄올을 두 번 넣고, 탈이온수에 50% (vol/vol) 에탄올을 한 번, 한 번 탈 이온수.</li>
		<li>샘플을 유리 병에서 100°C에서 20 mM 시트르산 나트륨 (pH 8.0) 내로 옮긴다. 조직이 용액에 잠겨 있는지 확인하십시오.</li>
		<li>항아리를 60°C 수조에 넣고 45분 동안 수조에 넣는다.</li>
		<li>샘플을 RT에서 탈이온수로 5분 동안 세척한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 조직 면역-eprSRS 염색
<ol><li>소수성 펜을 사용하여 슬라이드의 조직 섹션 주위에 경계를 그립니다. 참고: 슬라이드 염색 항아리는 슬라이드 조직의 배양 단계를 따르는 데 사용됩니다. 부유 조직 (40-μm 두께의 마우스 뇌 절편)은 웰 플레이트에서 염색됩니다.</li>
	<li>조직을 10분 동안 0.3-0.5% PBST (PBS 중의 트리톤 X-100)로 인큐베이션한다.</li>
	<li>조직을 블로킹 완충액 (PBS 중 5% 당나귀 혈청, 0.5% 트리톤 X-100)으로 30분 동안 인큐베이션한다.</li>
	<li>일차 염색 용액을 준비한다: 모든 일차 항체를 200-500 μL의 염색 완충액 (PBS 중 2% 당나귀 혈청, 0.5% 트리톤 X-100)에 원하는 농도로 첨가한다. 일차 염색 용액을 13,000 x g 에서 5분 동안 원심분리한다. 침전물이 형성되는 경우에만 상층액을 사용하십시오.</li>
	<li>조직을 1-2일 동안 4°C에서 1-2일 동안 일차 항체 용액에서 인큐베이션한다. 참고: 슬라이드에서 조직 절편을 염색하려면 젖은 닦아내기로 염색 상자에 샘플을 넣어 습도를 유지하십시오.</li>
	<li>슬라이드를 RT에서 0.3-0.5% PBST로 각각 5분 동안 세 번 세척한다. 부유 조직에 1 mL PBST를 사용하십시오. 슬라이드의 조직의 경우 슬라이드 염색 항아리에서 슬라이드를 세척하고 조직이 모두 용액에 잠겨 있는지 확인하십시오.</li>
	<li>조직을 200-500 μL의 블로킹 완충액에서 30분 동안 인큐베이션한다.</li>
	<li>보조 염색 용액을 준비하십시오 : 모든 이차 항체 (및 필요한 경우 렉틴)를 원하는 농도 (일반적으로 10 μg / mL)의 염색 완충액 200-500 μL에 첨가하십시오. 보조 염색 용액을 13,000 x g 에서 5분 동안 원심분리한다. 침전물이 형성되는 경우에만 상층액을 사용하십시오.</li>
	<li>조직을 200-500 μL의 이차 항체 용액으로 4°C에서 1-2일 동안 인큐베이션한다.</li>
	<li>슬라이드를 RT에서 0.3-0.5% PBST로 각각 5분 동안 두 번 세척합니다.</li>
	<li>200-500 μL의 DAPI 용액과 함께 30분 동안 인큐베이션한다.</li>
	<li>슬라이드를 각각 5분 동안 RT에서 PBS로 세 번 세척한다.</li>
	<li>떠 다니는 조직 절편의 경우 유리 떨어 뜨리는 피펫으로 유리 슬라이드로 옮깁니다. 티슈 브러시로 티슈를 펼치고 필요한 경우 물티슈로 주변을 닦으십시오.</li>
	<li>유리 커버 슬립으로 퇴색 방지 시약 한 방울에 조직을 장착하고 매니큐어로 고정하십시오.</li>
</ol>4. SRS 현미경 집합
참고: 상용 공초점 형광 시스템은 SRS-형광 이미징과 함께 사용됩니다. 더 많은 설명은 이전 보고서(17)에서 찾을 수 있다. 이 프로토콜은 협대역 여기를 사용하는 SRS 이미징 측면에 초점을 맞출 것이다.
<ol><li>온도 조절 장치가 있는 방에서 진동 분리형 광학 테이블을 준비합니다.</li>
	<li>냉각기가 연결된 광학 테이블(그림 2A)에 동기화된 이중 레이저 시스템(펌프 및 스토크스)을 놓습니다. 참고: 듀얼 레이저 시스템의 기본 레이저는 1064nm에서 6ps 펄스 폭 및 80MHz 반복률로 출력 펄스 트레인을 제공합니다. 스토크스 빔은 기본 레이저에서 나온 것입니다. Stokes 빔의 강도는 90% 이상의 변조 깊이를 갖는 8MHz에서 내장된 EOM(electro-optic amplitude modulator)에 의해 정현파적으로 변조되었다. 기본 레이저의 다른 부분은 주파수가 532nm로 두 배로 증가하며, 이는 5-6ps 펄스 폭을 갖는 모드 잠금 펄스 트레인을 생성하기 위해 피코초 광학 파라메트릭 발진기(OPO)를 동기적으로 시드하는 데 더 사용됩니다(OPO의 아이들러 빔은 간섭 필터로 차단됨). OPO의 출력 파장은 펌프 빔 역할을하는 720-950nm에서 조정할 수 있습니다.</li>
	<li>거울 (파장 범위 : 750-1100nm), 이색성 빔 스플리터 (DBS, 980nm 장역 필터, 직사각형) 및 렌즈 (무채색, 650-1050nm의 AR 코팅)를 각각의 마운트에 장착하십시오. 거울 및 이색성 빔 스플리터에 매우 안정적인 운동학 거울 마운트를 사용하십시오.</li>
	<li>레이저 출력의 높이와 펌프와 스토크스 빔의 빔 크기를 측정합니다. 거울과 렌즈의 높이를 조정하여 빛이 모든 광학 요소의 중심에 닿을 수 있도록하십시오.</li>
	<li>미러 M1을 광학 테이블 위에 놓고 레이저 출력에 ~45°로 만듭니다(그림 2B). 운동학 마운트의 손잡이를 사용하여 팁과 기울기를 조정하십시오. 빛이 테이블 길이를 따라 동일한 높이로 이동하고 테이블에 대해 직선으로 이동하는지 확인하십시오.</li>
	<li>이색성 빔 스플리터(980nm 장역 필터)와 거울을 배치하고 정렬하여 펌프와 스토크스 빔을 분할합니다(그림 2A-B).</li>
	<li>렌즈 쌍(L1, L2 및 L3, L4)을 각 빔 경로에 배치하고 정렬하여 빔을 시준하고 빔 직경을 확장하여 목표물의 후방 동공과 일치시킵니다(그림 2A-B).</li>
	<li>M7 및 M8 미러를 사용하여 결합된 레이저 빔을 현미경에 정렬합니다(그림 2C). 먼저 한 빔을 현미경에 맞추고 다른 빔의 미러 쌍을 사용하여 두 빔의 공간적 겹침을 보장하십시오.</li>
	<li>감지 부품을 설정합니다.<ol>
<li>적외선 코팅 오일 콘덴서(1.4-NA)를 착용하여 시편을 통과한 후 전진 펌프와 스토크스 빔을 수집합니다(그림 2C).</li>
		<li>대면적 Si 광 다이오드를 BNC 커넥터가 있는 차폐 박스에 장착합니다(그림 2E). 실장형 광 다이오드에 64V DC 전원 공급 장치를 추가하여 포화 임계값 및 응답 대역폭을 늘립니다.</li>
		<li>2인치 거울로 앞으로 나아가는 빛을 반사합니다. 광 필터 후 광 다이오드에 조명의 초점을 다시 맞추어 변조 스톡스 빔을 차단합니다(그림 2D).</li>
		<li>광 다이오드의 출력 전류를 신호 복조를 위해 50으로 종단된 고속 록인 앰프로 보냅니다. 8MHz 트리거를 잠금 증폭기에 기준 신호로 보냅니다.</li>
		<li>잠금 증폭기의 동위상 X 구성 요소를 현미경의 아날로그 인터페이스 상자로 보냅니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>현미경에서 순수한D2O액체의 SRS 신호를 측정하여 내장 된 전동 지연 단계와의 시간적 중첩을 최적화하십시오.</li>
</ol>5. 이미지 수집 및 분석
<ol><li>순차적 펌프 파장 튜닝으로 다중 채널 epr-SRS 이미징을 수행합니다.<ol>
<li>레이저 제어 패널에서 레이저 파워를 P 펌프 = 10-40 mW 및 P 스토크스 = 40-80 mW로 설정하십시오.</li>
		<li>픽셀 유지 시간을 2-4μs로 설정하고 현미경 소프트웨어에서 일반적으로 평균 10-20프레임의 여러 프레임을 사용합니다. 참고: 다중 광자 여기로 인해 라만 염료의 '표백 효과'를 일으킬 가능성이 높은 레이저 전력 (P펌프> 40mW> P스톡스< 80m) 및 작은 픽셀 크기 (0.2 μm)의 조합 사용을 피하십시오.</li>
		<li>잠금 증폭기의 시간 상수를 픽셀 유지 시간의 절반으로 설정합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>선형 스펙트럼 혼합 해제. 참고: epr-SRS는 전체 농도 범위에 걸쳐 엄격한 선형 신호 대 농도 의존성을 따릅니다. 따라서, 선형 스펙트럼 언믹싱은 채널 사이의 잠재적인 교차 회담을 제거하는 데 효과적이다. N MARS 프로브를 사용한 N 채널 epr-SRS 측정의 경우, 측정된 신호(S)는 S = MC로 표현될 수 있으며, 여기서 C는 MARS 프로브 농도이고, M은 MARS 프로브의 라만 단면에 의해 결정된 NxN 매트릭스이다. <ol>
<li>상이한 MARS 프로브로 표지된 단색 면역-eprSRS 샘플에서 매트릭스 M 을 측정한다.</li>
		<li>사용 방정식 C = M−1· S는 멀티플렉스 샘플 신호 측정 S를 갖는 MARS 프로브의 농도 매트릭스를 결정 한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

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여기에서, 우리는 갓 보존된 마우스 조직, FFPE 인간 조직 및 동결된 마우스 조직을 포함하는 일반적인 조직 유형에 광범위하게 적용 가능한 면역-eprSRS 프로토콜을 제시한다. 면역-eprSRS는 표 1에 열거된 바와 같이 세포 및 조직에서 에피토프의 패널에 대해 검증되었다. 이 원샷 플랫폼은 순환 전략이 잘 작동하지 않는 응용 분야에 특히 적합합니다. 예를 들어, 순환 형광은 3D 면역 표지의 다중 라운드가 비실용적 인 긴17이기 때문에 두꺼운 조직에 대해 요구된다. 또한 비선형 3D 조직학적 변화(11,17)로 인해 등록 오류가 발생할 가능성이 매우 높습니다. Immuno-eprSRS는 이러한 시나리오에서 순환 형광의 실질적인 장벽을 극복하고 대량에 걸쳐 단백질 상호 작용 네트워크를 밝힐 수있는 기회를 제공합니다1...

복잡한 조직 시스템은 공간적 위치와 상호 작용 네트워크가 기능 및 기능 장애 1,2와 깊이 얽혀있는 별개의 세포 하위 집단으로 구성됩니다. 조직 구조를 밝히고 복잡성을 조사하기 위해서는 단일 세포 분해능에서 단백질의 공간적 위치에 대한 지식이 필수적입니다. 따라서 고도로 다중화 된 단백질 이미징 기술은 점점 더 높이 평가되어 조직 생물학 3,4,5을 연구하기위한 초석이 될 수 있습니다. 현재의 일반적인 다중화 단백질 이미징 방법은 크게 두 가지 범주로 분류할 수 있다. 하나는 여러 차례의 조직 염색 및 이미징에 의존하는 직렬 면역 형광 이미징이고, 다른 하나는 중금속 태깅 항체 6,7,8,9,10,11,12와 결합 된 질량 세포 측정법을 이미징하는 것입니다.
여기서, 다중화된 항체 기반 단백질 이미징을 위한 대안적인 전략이 도입된다. 광범위한 여기 및 방출 스펙트럼 (절반 최대 (FWHM) ~ 500cm-1에서 전체 너비)으로 인해 4-5 채널을 동시에 시각화 할 수있는 널리 퍼진 형광 이미징 양식과 달리 라만 현미경은 훨씬 좁은 스펙트럼 선폭 (FWHM ~ 10cm-1)을 나타내므로 확장 가능한 다중성을 제공합니다. 최근에, 좁은 스펙트럼을 이용함으로써, 전자 사전 공명 자극 라만 산란 (epr-SRS) 현미경이라는 라만 현미경의 새로운 계획이 개발되어 다중화 이미징(13)에 대한 강력한 전략을 제공한다. epr-SRS는 라만 염료의 전자 결합 진동 모드를 조사함으로써 라만 단면에서 10,13배의 과감한 향상 효과를 달성하고 기존 라만 현미경의 감도 병목 현상을 극복합니다(그림 1A)13,14,15. 그 결과, epr-SRS의 검출 한계는 sub-μM로 밀려났으며, 이는 세포 내부의 특정 단백질 및 소기관과 같은 흥미로운 분자 마커의 라만 검출을 가능하게 한다(13,16). 특히, 라만 염료-접합된 항체를 이용하여, 세포 및 조직에서 특정 단백질의 epr-SRS 이미징 (면역-eprSRS로 불림)은 표준 면역형광에 대한 필적할만한 민감성으로 입증되었다 (도 1B)13,17. 펌프 파장을 2nm만 튜닝하면 epr-SRS 신호가 완전히 꺼지며(그림 1B), 높은 진동 대비를 보여줍니다.
프로브 측에서는 항체 접합을 위해 맨해튼 라만 산란 (MARS) 염료라고 불리는 무지개와 같은 라만 프로브 세트가 개발되었습니다13,18,19,20. 이 독특한 라만 팔레트는 π 공액 삼중 결합(보충 재료)을 담은 새로운 염료로 구성되며, 각각은 생체 직교 라만 스펙트럼 범위에서 단일의 좁은 epr-SRS 피크를 표시합니다(그림 1C). 코어 발색단의 구조를 변형시키고 삼중 결합(Supplementary Material)의 두 원자를 동위원소적으로 편집함으로써, 분광적으로 분리된 라만 프로브가 개발되었다. 확장 가능한 다중성을 활용하여 MARS 염료 팔레트와 결합된 epr-SRS 현미경은 세포 및 조직에서 원샷 멀티플렉스 단백질 이미징을 위한 광학 전략을 제공합니다.
Immuno-eprSRS는 독특한 강점을 가진 현재의 멀티플렉스 단백질 이미징 방법에 대한 대안적인 전략을 제공합니다. 순환 염색, 이미징 및 신호 제거를 통한 형광 접근법과 비교할 때, 이 Raman 기반 플랫폼은 단일 라운드 염색 및 이미징을 보장합니다. 따라서 순환 절차의 실질적인 복잡성을 피하고 프로토콜을 크게 단순화하여 다중화 된 단백질 이미징의 새로운 영역을 열어줍니다. 예를 들어, 라만-염료-맞춤형 조직 제거 프로토콜을 이용하여, 면역-eprSRS는 두꺼운 온전한 조직(17)에서 고도로 다중화된 단백질 매핑을 위해 세 차원으로 확장되었다. 10개 이상의 단백질 표적이 밀리미터 두께의 마우스 뇌 조직(17)을 따라 시각화되었다. 보다 최근에, 면역-eprSRS를 최적화된 생체분자-보유 확장 현미경(ExM) 프로토콜(21)과 결합시켜, 다중 표적의 원샷 나노스케일 이미징도 입증되었다(22). 이미징 질량 분광법4,9와 비교할 때, epr-SRS는 비파괴적이며 본질적으로 광학 단면화 능력을 가지고 있습니다. 또한, epr-SRS는 조직 스캔에서 더 시간 효율적입니다. 전형적으로, 0.5 μm의 픽셀 크기를 갖는0.25 mm2의 조직 영역은 단일 epr-SRS 채널에 대해 이미지화하는 데 단지 몇 분이 걸린다. 예를 들어, 도 4에서 4개의 SRS 채널과 4개의 형광 채널의 총 이미징 시간은 약 10분이다.

<table><tbody><tr><td>16% 파라포름알데히드, EM 등급</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>&알파;-튜불린</td><td>Abcam</td><td>ab18251</td><td>1차 항체</td></tr><tr><td>&알파;-튜불린</td><td>BioLegend</td><td>625902</td><td>1차 항체</td></tr><tr><td>&베타;-III-튜불린</td><td>BioLegend</td><td>657402</td><td>1차 항체</td></tr><tr><td>&베타;-III-튜불린</td><td>Abcam</td><td>ab41489</td><td>Primary antibodies</td></tr><tr><td>&beta;-tubulin</td><td>Abcam</td><td>ab131205</td><td>Primary antibodies</td></tr><tr><td>Agarose, low gellling temperature</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9414</td><td>For brain embedding</td></tr><tr><td>Anti-a-tubulin antibody produced in rabbit (&alpha;-tubulin)</td><td>Abcam</td><td>ab52866</td><td>Primary antibodies</td></tr><tr><td>one antibody produced in mouse (Calbindin)</td><td>Abcam</td><td>ab82812</td><td>1차 항체</td></tr><tr><td>Anti-GABA B receptor R2&nbsp; 기니피그에서 생산된 항체 (GABA B 수용체 R2)</td><td>Millipore Sigma</td><td>AB2255</td><td>1차 항체</td></tr><tr><td>Anti-GFAP 항체 염소에서 생산된 항체 (GFAP)</td><td>Thermo Scientific</td><td>PA5-18598</td><td>1차 항체</td></tr><tr><td>Anti-Glucagon&nbsp; 마우스 (Glucagon)에서 생성된 항체</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-514592</td><td>1차 항체</td></tr><tr><td>기니피그에서 생성된 항인슐린 항체(insulin)</td><td>DAKO</td><td>IR00261-2</td><td>1차 항체</td></tr><tr><td>쥐(MBP)에서 생성된 항체 MBP 항체Abcam</td><td></td> <td>ab7349</td><td>1차 항체</td></tr><tr><td>토끼(NeuN)에서 생성된 항체</td><td>Thermo Scientific</td><td>PA5-78639</td><td>1차 항체</td></tr><tr><td>염소에서 생산된 항췌장 폴리펩티드(PP) 항체- 췌장 폴리펩티드(PP)</td><td>시그마 알드리치(Sigma Aldrich</td><td>) SAB2500747</td><td>1차 항체</td></tr><tr><td>토끼(Pdx1)에서 생성된 항-Pdx1 항체밀리</td><td>포어</td><td>06-1379</td><td>1차 항체</td></tr><tr><td>쥐(소마토스타틴)에서 생성된 항-소마토스타틴 항체</td><td>Abcam</td><td>ab30788</td><td>1차 항체</td></tr><tr><td>닭에서 생산된 항-비멘틴 항체( Vimentin)</td><td>Abcam</td><td>ab24525</td><td>1차 항체</td></tr><tr><td>대역 통과 필터</td><td>KR Electronics</td><td>KR2724</td><td>8MHz</td></tr><tr><td>BNC 50옴 터미네이터</td><td>미니 회로</td><td>STRM-50</td><td></td></tr><tr><td>BNC 케이블</td><td>Thorlabs</td><td>2249-C</td><td>동축 케이블, BNC 수/수</td></tr><tr><td>광대역 유전체 미러</td><td>Thorlabs</td><td>BB1-E03</td><td>750 - 1100nm</td></tr><tr><td>C57BL/6J 마우스</td><td>Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>콘덴서</td><td>Olympus</td><td></td><td>오일 이멀젼, 1.4 N.A.</td></tr><tr><td>Cytokeratin 18</td><td>Abcam</td><td>ab7797</td><td>1차 항체</td></tr><tr><td>Cytokeratin 18</td><td>Abcam</td><td>ab24561</td><td>1차 항체</td></tr><tr><td>DC 전원 공급 장치</td><td>TopWard</td><td>6302D</td><td>바이어스 전압은 64V</td></tr><tr><td>Dichroic 마운트</td><td>Thorlabs</td><td>KM100CL</td><td>Kinematic 마운트로 최대 1.3" (33 mm) 높이의 직사각형 광학, 왼손잡이용</td></tr><tr><td>당나귀 안티 치킨 IgY (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>703-005-155</td><td>Secondary antibodies for MARS conjugation</td></tr><tr><td>Donkey anti-Goat IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-005-147</td><td>Secondary antibodies for MARS conjugation</td></tr><tr><td>Donkey anti-Guinea Pig IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>706-005-148</td><td>Secondary antibodies for MARS conjugation</td></tr><tr><td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-005-151</td><td>MARS conjugation</td></tr><tr><td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)</td>에 대한 2차 항체<td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-005-152</td><td>MARS conjugation</td></tr><tr><td>Donkey anti-Rat IgG (H+L)</td>에 대한 2차 항체<td>Jackson ImmunoResearch</td><td>712-005-153</td><td>MARS conjugation</td></tr><tr><td>Donkey anti-Sheep IgG (H+L)</td>에 대한 2차 항체<td>Jackson ImmunoResearch</td><td>713-005-147</td><td>Secondary MARS conjugation</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-190-250</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM</td><td>Abcam</td><td>ab71916</td><td>1차 항체</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>443611</td><td></td></tr><tr><td>Fast-speed look-in amplifier</td><td>취리히 인스트루먼트</td><td>HF2LI</td><td>DC - 50 MHz</td></tr><tr><td>FFPE 신장 샘플</td><td>USBiomax</td><td>HuFPT072</td><td></td></tr><tr><td>Fibrillarin</td><td>Abcam</td><td>ab5821</td><td>1차 항체</td></tr><tr><td>Giantin</td><td>Abcam</td><td>ab24586</td><td>1차 항체</td></tr><tr><td>Glucagon</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-514592</td><td>1차 항체</td></tr><tr><td>H2B</td><td>Abcam</td><td>ab1790</td><td>1차 항체</td></tr><tr><td>HeLa</td><td>ATCC</td><td>ATCC CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>High O.D. bandpass filter</td><td>Chroma 기술</td><td>ET890 / 220m</td><td>스톡스 빔을 필터링하고 펌프 빔을 전달하십시오</td></tr><tr><td>소수성 펜</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1384846</td><td></td></tr><tr><td>인슐린</td><td>ThermoFisher</td><td>701265</td><td>1 차 항체</td></tr><tr><td>통합 SRS 레이저 시스템</td><td>응용 물리학 및 ... 전자, Inc.</td><td>picoEMERALD</td><td>picoEMERALD는 1,064ps의 펄스 폭과 6MHz 반복률로 80nm에서 출력 펄스 트레인을 제공하며, 이는 스톡스 빔 역할을 합니다. 532nm에서 주파수 이중 빔은 피코초 광학 파라메트릭 발진기(OPO)를 동기식으로 시드하여 5~6ps 펄스 폭의 모드 잠금 펄스 트레인을 생성하는 데 사용됩니다(OPO의 아이들러 빔은 간섭계 필터로 차단됨). OPO의 출력 파장은 720&ndash에서 조정할 수 있습니다. 950nm, 펌프 빔 역할을 합니다. 1,064nm 스톡스 빔의 강도는 90% 이상의 변조 깊이로 8MHz에서 내장 EOM에 의해 정현파로 변조됩니다. 펌프 빔은 picoEMERALD 내부의 이색성 거울을 사용하여 Stokes 빔과 공간적으로 겹칩니다. 펌프와 스톡스 펄스 트레인 사이의 시간적 중복은 내장 지연 스테이지를 통해 달성되며 현미경에서 순수 D2O의 SRS 신호에 의해 최적화됩니다.</td></tr><tr><td>반전 레이저 스캐닝 현미경</td><td>Olympus</td><td>FV1200MPE</td><td></td></tr><tr><td>Kinematic 미러 마운트</td><td>Thorlabs</td><td>POLARIS-K1-2AH</td><td>2 저프로필 육각 조정기</td></tr><tr><td>Lectin from Triticum vulgaris (wheat)Sigma</td> <td>Aldrich</td><td>L0636-5 mg</td><td></td></tr><tr><td>롱패스 이색성 빔 스플리터</td><td>Semrock</td><td>Di02-R980-25x36</td><td>980 nm 레이저 BrightLine&nbsp; single-edge laser-flat dichroic beamsplitter</td></tr><tr><td>MAP2</td><td>BioLegend</td><td>801810</td><td>1차 항체</td></tr><tr><td>현미경 이미징 소프트웨어</td><td>Olympus</td><td>FluoView</td><td></td></tr><tr><td>NanoQuant Plate</td><td>Tecan</td><td></td><td>플레이트 리더에서 흡광도 기반의 소량 분석용.</td></tr><tr><td>Normal donkey serum</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R37606</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 4-Well Dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-566-300</td><td></td></tr><tr><td>대물 렌즈</td><td>Olympus</td><td>XLPlan N</td><td>x25, 1.05-NA, MP, working distance&thinsp; 2&thinsp; mm</td></tr><tr><td>페인트 브러시</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>잠망경 어셈블리</td><td>Thorlabs</td><td>RS99</td><td>는 상단 및 하단 유닛을 포함하며, &Oslash; 1" 포스트 및 클램핑 포크.</td></tr><tr><td>pH 측정기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>플레이트 리더</td><td>Tecan</td><td>Infinite 200 PRO</td><td>사용하기 쉬운 멀티모드 플레이트 리더. 230&ndash의 스펙트럼 범위에 걸친 흡광도 측정 기능; 1000 nm의</td></tr><tr><td>ProLong Gold antifade reagent</td><td>Thermo Scientific</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>PSD95</td><td>Invitrogen</td><td>51-6900</td><td>Primary Antibody</td></tr><tr><td>Sephadex G-25 Medium</td><td>GE Life Sciences</td><td>17-0033-01</td><td>탈염 및 완충액 교환용 겔 여과 수지</td></tr><tr><td>BNC 커넥터가 있는 차폐 상자</td><td>Pomona Electronics</td><td>2902</td><td>알루미늄 상자 커버, BNC 암/암</td></tr><tr><td>Si 포토다이오드</td><td>Thorlabs</td><td>FDS1010</td><td>350&ndash; 1100 nm, 10 mm x 10 mm 활성 영역</td></tr><tr><td>Synapsin 2</td><td>ThermoFisher</td><td>OSS00073G</td><td>일차 항체</td></tr><tr><td>Tissue Path Superfrost Plus Gold Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-035813</td><td>신선하거나 포르말린으로 고정된 조직 절편을 슬라이드 표면에 단단히 끌어당기고 화학적으로 결합하는 접착 슬라이드(tiisue 바인딩 유리 슬라이드)</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin</td><td>Abcam</td><td>ab8069</td><td>1차 항체</td></tr><tr><td>Xylenes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>214736</td><td></td></tr></tbody></table>

라만 염료를 이용한 고도의 다중화 조직 이미징

Highly-Multiplexed Tissue Imaging with Raman Dyes

조직에서 특정 바이오마커의 광대 한 범위를 시각화하는 것은 복잡한 생물학적 시스템의 복잡한 조직을 탐구하는 데 중요한 역할을합니다. 따라서 고도로 다중화된 이미징 기술이 점점 더 높이 평가되고 있습니다. 여기에서, 우리는 무지개와 같은 라만 염료의 전자 사전 공명 자극 라만 산란 (epr-SRS) 이미징을 통해 표준 면역 형광에 필적하는 감도를 가진 특정 단백질의 고도로 다중화 된 진동 이미징의 새로운 플랫폼을 설명합니다. 이 방법은 종래의 면역형광에서 분광적으로 분해가능한 채널의 한계를 우회하고, 아세포 분해능을 갖는 조직에서 다중 마커를 심문하기 위한 원샷 광학 접근법을 제공한다. 일반적으로 파라포름알데히드-고정 조직, 동결 조직, 및 포르말린-고정 파라핀 포매(FFPE) 인간 조직을 포함하는 표준 조직 제제와 양립가능하다. 우리는이 플랫폼이 생물학적 표본의 단백질 상호 작용, 특히 두꺼운 손상되지 않은 조직에 대한보다 포괄적 인 그림을 제공 할 것으로 기대합니다. 이 프로토콜은 항체 준비에서 조직 샘플 염색, SRS 현미경 어셈블리, epr-SRS 조직 이미징에 이르는 워크플로우를 제공합니다.

도 3은 고정된 세포(도 3A), 파라포름알데히드(PFA)-고정된 마우스 조직(도 3B), 및 포르말린-고정 파라핀 포매(FFPE) 인간 표본(도 3C)을 포함하는 상이한 샘플에서의 epr-SRS의 예시적인 이미지를 도시한다. SRS 현미경의 공간 분해능은 회절 제한이며, 일반적인 측방향 분해능은 ~ 300nm이며, 축 분해능은 여기를 위해 근적외선을 사용하는 1-2 μm입니다. 그 결과, HeLa 세포에서 미세소관과 같은 미세한 세포내 구조는 α-튜불린의 면역-eprSRS 영상화로 충실하게 밝혀졌다(도 3A). 더욱이, epr-SRS는 일반적으로 FFPE 조직과 양립할 수 있으며(도 3C), 이는 임상 진단 및...

무지개 유사 라만 염료의 전자 사전 공명 자극 라만 산란 (epr-SRS) 이미징은 고도로 다중화 된 에피토프 기반 단백질 이미징을위한 새로운 플랫폼입니다. 여기에서는 항체 준비, 조직 샘플 염색, SRS 현미경 어셈블리 및 epr-SRS 조직 이미징을 포함한 실용적인 가이드를 제시합니다.

Visualizing a vast scope of specific biomarkers in tissues plays a vital role in exploring the intricate organizations of complex biological systems. ...

고도로 다중화된 진동 이미징은 세포 내 분해능을 가진 조직에서 여러 단백질 마커를 조사하는 원샷 광학 접근법을 제공합니다. 이 플랫폼은 생물학적 시스템의 단백질 상호 작용에 대한 포괄적 인 그림을 제공합니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 사이클이 없는 멀티플렉시입니다.이 기술은 두꺼운 조직 절편에서와 같이 사이클링 전략이 잘 작동하지 않는 응용 분야에 특히 적합합니다. 이 방법은 조직 아틀라스 구축, 종양 미세 환경 표현형 및 프로파일링 뇌 회로와 같은 복잡한 시스템의 구조를 이해하기 위한 계내에서 개별 세포 특성화를 가능하게 한다. 시작하기 위해, 콘쥬게이션 완충제로 사용될 PHA 0.3에서 PBS 완충액에 대략 0.1몰 중탄산나트륨을 준비하고 섭씨 4도에 저장한다.그 다음 무수 디메틸설폭사이드에서 세밀리몰 n-하이드록시숙신이미드 에스테르 함수화 MARS 프로브 용액을 준비한다. 항체 고체를 콘쥬게이션 완충액에 용해시켜 밀리리터당 두 밀리그램의 농도로 용해시킨다. 다른 완충액에 용해된 항체의 경우, 이들을 원심 필터에 농축시킨 다음, 밀리리터당 하나 내지 두 밀리그램의 농도로 콘쥬게이션 완충액에 첨가한다.이차 항체에 대한 콘쥬게이션 반응을 수행하기 위해, 15배 몰 과량의 염료 용액을 유리 바이알에 첨가하고 교반하면서 천천히 첨가하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 교반하면서 실온에서 인큐베이션한다. 정제를 수행하기 위해, 겔 여과 수지 분말 10 밀리리터를 50 밀리리터 튜브의 PBS 버퍼 40 밀리리터에 첨가하여 슬러리를 제조하였다. 용액을 섭씨 90도의 수조에 한 시간 동안 보관하십시오.그런 다음 상청액을 데칸트하고, PBS를 최대 40 밀리리터까지 첨가하고, 슬러리를 섭씨 4도에서 저장한다. 크기 배제 컬럼을 슬러리 용액으로 10 내지 15 센티미터의 높이로 팩킹한 다음, 컬럼을 헹구고 대략 10 밀리리터의 PBS로 세척하여 수지를 추가로 패킹한다. 이어서, 콘쥬게이션 반응 혼합물을 컬럼에 피펫팅한다.반응 혼합물을 로딩한 후, 즉시 용출 완충제로서 PBS 한 밀리리터를 첨가한다. 그 후, 컬럼 상의 색상을 보거나 280 나노미터에서 흡광도를 측정하여 콘쥬게이트 용액의 용리액을 수집한다. 원심 필터를 사용하여 수집 된 용액을 밀리리터 당 하나 ~ 두 밀리그램으로 농축하십시오.소수성 펜을 사용하여 슬라이드의 조직 섹션 주위에 경계를 그립니다. 그 다음 조직을 10분 동안 0.3 내지 0.5%PBST로 인큐베이션

highly-multiplexed-tissue-imaging-with-raman-dyes

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

출처: Espinoza, R., et al. 조직 진단을 위한 마우스 뇌의 실시간 2색 자극 라만 산란 영상. J. Vis. Exp. (2022).  이 비디오는 쥐의 뇌 조직 절편에 대한 2색 자극 라만 산란(SRS) 이미징을 보여줍니다. 두 개의 동기화된 레이저 빔이 조직 부분으로 향하여 분자 진동을 여기시켜 빔의 상대적인 강도 변화를 초래합니다. 조직의 지질과 단백질은 레이저 빔의 고유한 주파수 쌍을 사용하여 검출됩니다. 그런 다음 결과 신호에 별도의 색상이 할당되어 조직의 단백질과 지질을 식별하는 데 도움이 되는 2색 이미지를 생성합니다.

마우스 뇌 조직의 2색 자극 라만 산란 이미징

우리는 냉동 된 조직에 다중 스펙트럼 이미징을 수행하는 빠른 염색 방법을 설명합니다.

냉동 조직 섹션의 다스펙트럼 형광 이미징을위한 신속한 방법

자극된 라만 산란(SRS) 현미경은 특정 화학 결합의 고유 진동을 기반으로 생체 분자의 라벨 없는 이미징을 가능하게 합니다. 이 프로토콜에서, 통합 SRS 및 이광자 형광 현미경의 도구 셋업은 살아있는 마우스의 척수에서 세포 구조를 시각화하기 위해 기술된다.

생체 내 결합 된 이광자 형광 및 자극 된 라만 산란 현미경을 사용한 생물학적 조직 이미징

자극된 라만 산란(SRS) 현미경은 강력하고 비파괴적이며 라벨이 없는 이미징 기술입니다. 한 가지 새로운 응용 분야는 자극 라만 조직학이며, 여기서 단백질과 지질 라만 전이에서 두 가지 컬러 SRS 이미징이 의사 헤마톡실린 및 에오신 이미지를 생성하는 데 사용됩니다. 여기에서는 조직 진단을 위한 실시간 이색 SRS 이미징을 위한 프로토콜을 시연합니다.

조직 진단을 위한 마우스 뇌의 실시간 두 가지 색상 자극 라만 산란 영상

이 기사에서는 스펙트럼 초점 모듈과 이중 출력 펄스 레이저의 통합을 제시하여 금 나노 입자와 암세포의 신속한 초분광 이미징을 가능하게 합니다. 이 작업은 표준 레이저 스캐닝 현미경에서 다중 모드 비선형 광학 기술의 세부 사항을 시연하는 것을 목표로 합니다.

다중 모드 비선형 광학 현미경을 사용한 나노 입자의 세포 흡수의 생체 분자 이미징

우리는 광대역 자극 라만 산란 (SRS) 현미경으로 화학 이미지를 획득하기위한 프로토콜을 제시합니다. 차등 다중 채널 잠금 검출로 작동하는 SRS 현미경을 기반으로 하는 프로토콜은 시료 준비, SRS 장치의 조정 및 화학적으로 이질적인 샘플의 서로 다른 구성 요소를 분리하기 위한 화학측정법을 설명합니다.

광대역 자극 라만 산란 현미경을 기반으로 한 멀티플렉스 화학 이미징

다중화 바코드 이미지 분석은 최근 종양 미세 환경의 특성을 개선하여 세포 구성, 기능 상태 및 세포-세포 상호 작용에 대한 포괄적인 연구를 가능하게 했습니다. 본 명세서에서는 올리고뉴클레오티드 접합 항체의 바코딩을 사용하는 염색 및 이미징 프로토콜과 고차원 이미지 분석 기술을 사용할 수 있는 사이클 이미징을 설명합니다.

파라핀 조직 샘플의 단일 세포 분석에서 면역 프로파일링 및 공간 매핑 특성 분석을 위한 멀티플렉스 바코드 이미지 분석

label-free 광학 이미징 방식을 결합한 멀티모달 플랫폼을 활용하여 세포 역학 및 신진대사를 시각화하고 정량화하기 위한 프로토콜을 개발했습니다. 다광자 형광, 2차 고조파 생성 및 유도 라만 산란 현미경을 통한 이미징을 통해 세포 및 분자 환경에 대한 전체적인 개요를 생성할 수 있습니다.

세포 대사 연구를 위한 멀티모달 광학 이미징 플랫폼

이 프로토콜은 살아있는 인간 유방암 세포의 무표지, 비침습적 표현형을 위해 라만 분광법과 단층촬영상 현미경을 결합한 다중 모드 접근 방식을 제시합니다. 여기에는 신속하고 정량적인 형태 화학 분석을 위한 사용자 친화적이고 인간 편견이없는 분석 파이프라인이 포함되어 있으며, 암 연구 및 세포 생물학에 응용하여 상세한 분자 및 구조적 통찰력을 제공합니다.

살아있는 무표지 유방암 세포의 표현형 분석을 발전시키기 위한 다중 모드 이미징 프레임워크

IBEX(Spectral Iterative Bleaching Extends Multiplexity)는 헤파린 차단을 추가하여 비특이적 결합을 최소화하고 스펙트럼 검출과 전산 혼합 해제를 활용하여 자가형광을 억제함으로써 기본 IBEX 기술을 기반으로 합니다. 이 접근 방식은 배경 소스를 줄이면서 이미지 획득을 가속화하여 강력한 다라운드, 고파라미터 공간 단백질체 분석을 가능하게 합니다.

비특이적 조직 형광을 최소화하기 위해 스펙트럼 공초점 현미경을 사용한 하이플렉스 이미징

배우세요 epr-SRS 라만 염료 이미징을 활용한 다중화 단백질 분석 기법으로 두꺼운 조직에서 세포 수준 단백질 상호작용을 관찰하는 방법입니다. 이 기술은 신경과학 및 종양 미세환경 연구에 활용됩니다.

라만 염료를 이용한 고도의 다중화 조직 이미징

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