Name: Barth 증후군의 신속한 진단을 위해 질량 분광법에 의한 백혈구의 카디오리핀 지문 채취 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-23T13:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: 배우세요 MALDI-TOF 질량 분석법을 이용한 백혈구 카디오리핑 지문 채취로 Barth 증후군을 신속 진단하는 방법입니다. 단 한 번의 분석으로 높은 민감도와 특이도를 제공합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

우리는 우리의 연구에 참여한 BTHS와 그 가족들에게 감사드립니다. 우리는 Barth Syndrome Foundation U와 Barth Syndrome UK Trust가 브리스톨에서 열린 연례 회의에서 혈액 샘플 수집을 지원하고 도움을 주신 것에 감사드립니다. 이 연구는 Barth Syndrome Foundation US, Barth Italia Onlus 및 Apulia Region이 자금을 지원했습니다.

건강한 기증자 및 심부전 환자의 혈액 샘플은 바리 (이탈리아)의 폴리 클리닉 병원에서 수집되었으며, BTHS 환자의 샘플은 브리스톨 왕립 아동 병원 (영국)의 국립 보건 서비스 영국 BTHS 클리닉에서 수집되었습니다. 건강한 기증자, 환자 및 부모 (적절한 경우)의 서면 동의와 각 윤리위원회의 승인을 받았습니다.
참고 : 즉시 사용하지 않으면 혈액 (K-EDTA 젤 튜브)을 4 °C에서 최대 24-48 시간 동안 저장할 수 있습니다.
1. 적혈구(RBCs)의 덱스트란 침강에 의한 백혈구의 분리
<ol><li>혈액 샘플 (K-EDTA)을 궤도 쉐이커에 10 분 동안 넣어 혈액을 혼합하십시오.</li>
	<li>1.5 mL 튜브에서 전혈 0.9 mL에, 0.1 mL의 20% 덱스트란 용액(분자 질량 > 100 kDa, 0.9% NaCl 중)을 첨가한다. 피펫을 착용하고 서스펜션을 부드럽게 20회 분산시키면서 튜브 상단에 RBC를 유지하는 기포를 피하십시오. RBCs를 실온에서 약 1 시간 동안 침전시킨다.</li>
	<li>주사기를 사용하여, 황색 상청액을 수집하여 15 mL 튜브로 옮긴 다음, 실온에서 15분 동안 400 x g 에서 원심분리한다(브레이크 없음, 스윙-버킷 로터 없음).</li>
	<li>상청액을 버리고 주로 백혈구 및 잔류 RBCs를 함유하는 펠렛을 빙냉 바이증류수 (ddH2O) 0.6 mL에 재현탁시킨다.</li>
	<li>∼15초 후, 0.2 mL의 0.6 M KCl을 세포 현탁액에 첨가하여 정확한 삼투압을 회복시킨다. 짧은 삼투압 쇼크는 RBC를 용해시키고 백혈구를 그대로 유지합니다. 최종 부피를 1x PBS로 2.5 mL로 조정한다.</li>
	<li>현탁액을 실온에서 15분 동안 400 x g 에서 원심분리한다(브레이크 없음, 스윙-버킷 로터 없음). 상청액을 버리고 백혈구 펠렛을 다시 2.5 mL의 1x PBS로 세척한다.</li>
	<li>단계 1.6에서와 같이 원심분리하여 상층액을 버린다. 백혈구를 함유하는 펠렛을 200 μL의 멸균된ddH2O에 재현탁시킨다. 참고 : 저자의 경험에서 이것은 200 μg에서 400 μg까지의 단백질 함량에 해당합니다.</li>
	<li>현탁액을 -80°C에서 동결시키거나 다음과 같이 지질 추출을 직접 수행한다.</li>
</ol>2. 분리된 백혈구로부터의 지질의 "미니 추출"
<ol><li>20 μL의 백혈구 현탁액 (약 20-40 μg 단백질)을 1.5 mL 튜브로 옮기고 16,000 x g 에서 30 초 동안 스핀한다.</li>
	<li>상청액을 버리고, 나머지 펠렛에CHCl3 10 μL를 첨가하고, 지질 추출을 촉진하기 위해 반복적으로 피펫을 첨가한다.</li>
	<li>마지막으로,CHCl3의 펠렛에 10μL의 9-아미노아크리딘(9-AA) 매트릭스 용액(2-프로판올/아세토니트릴 중 10mg/mL 9-AA, 60:40 v/v)을 첨가한다. 피펫과 혼합을 위해 반복적으로 분산시킨다.</li>
	<li>CHCl3 및 9-AA의 지질을 함유하는 용액을 30초 동안 16,000 x g에서 회전시키고, 이어서 상청액을0.35 μL의 액적으로서 침전시키고(각 샘플에 대해 3번의 반복실험) MALDI 표적(샘플 플레이트) 상에 분석한다('건조된 액적' 증착 방법).</li>
	<li>물방울 공기를 적어도 10-15 분 동안 말리십시오.</li>
</ol>3. MALDI-TOF/MS에 의한 지질 분석
<ol><li>MALDI-TOF 질량 분광계에서 삼중으로 샘플의 질량 스펙트럼을 획득합니다.</li>
	<li>지질 표준으로 교정 한 후 ( 재료 표 참조) 음이온 모드에서 분석을 설정하고 소분자 분석을 위해 200 Th ~ 2,000 Th의 검출 m / z 범위를 최적화하십시오.</li>
	<li>레이저 플루언스를 임계치(CL 및 MLCL의)보다 5% 높게 유지하여 S/N(최소 2개)을 확보하십시오.</li>
	<li>지연된 펄스 추출을 사용하여 반사기 모드에서 스펙트럼을 획득합니다. 각 질량 스펙트럼에 대해 평균 2,000개의 단일 레이저 샷(합계 4 x 500)이 있습니다. 검출기 포화를 방지하기 위해 게이트 매트릭스 억제를 400 Th에 적용하십시오.</li>
</ol>4. (MLCL + CLi) / CLm 비율을 계산하는 방법
<ol><li>MALDI-TOF/MS 계측기 소프트웨어( 자료표 참조)를 실행하여 획득한 스펙트럼을 분석합니다.</li>
	<li>열기 명령을 사용하여 관심 스펙트럼을 선택하고 로드할 수 있는 스펙트럼 브라우저 대화상자를 엽니다.</li>
	<li>메뉴 막대에서 부드러운 질량 스펙트럼 아이콘을 클릭하고 질량 스펙트럼 기준선을 뺍니다.</li>
	<li>파일 > > 내보내기를 질량 스펙트럼으로 클릭하고 스펙트럼을 m / z (x) 및 intensity (y) 쌍이있는 두 개의 열 테이블로 내보낼 ASCII 형식을 선택하십시오. 좌표를 복사하여 스프레드시트 프로그램에 붙여넣습니다(*.xls).</li>
	<li>분석된 각 샘플의 트리플라이케이트에 대해 4.2~4.4단계를 반복하여 그림 1과 같이 동일한 스프레드시트 프로그램 파일에 좌표를 붙여 넣습니다( 1 단계).</li>
	<li>나열된 각 종에 대해 도 1(단계 2)에 도시된 x 범위에 이어서, SUM 함수에 의해y1,y2 및y3 값(triplicates)의 합을 계산하여 피크 면적을 구한다(도 1; 단계 3).</li>
	<li>AVERAGE 함수로 삼중 영역 값의 평균 을 수행합니다(그림 1; 단계 3).</li>
	<li>그림 1과 같이 각 종에 대한 평균 면적 값을 열에 놓습니다(단계 2).</li>
	<li>도28에서와 같이 CLm 72:7 종의 제1 동위원소만을 고려하기 위하여, 도 1 에 도시된 바와 같이 CLm 72:8의 M+2 동위원소와 CLm 72:7의 단일동위원소 피크 사이의 중첩에 대한 동위원소 보정을 계산한다(단계 4).</li>
	<li>마지막으로 그림 1 (5단계)과 같이 (MLCL + CLi)/CLm 비율을 계산합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Barth, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-linked+cardioskeletal+myopathy+and+neutropenia+%28Barth+syndrome%29%3A+respiratory-chain+abnormalities+in+cultured+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inherited+Metabolic+Disease%22%5BJournal%5D)">X-linked cardioskeletal myopathy and neutropenia (Barth syndrome): respiratory-chain abnormalities in cultured fibroblasts.</a> Journal of Inherited Metabolic Disease. 19 (2), 157-160 (1996).</li>
<li>Steward, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((syndrome+%28X+linked+cardiac+and+skeletal+myopathy%2C+neutropenia%2C+and+organic+aciduria%29%3A+rarely+recognised%2C+frequently+fatal+%5Babstract%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Disease+in+Childhood%22%5BJournal%5D)">syndrome (X linked cardiac and skeletal myopathy, neutropenia, and organic aciduria): rarely recognised, frequently fatal [abstract].</a> Archives of Disease in Childhood. 89, 48(2004).</li>
<li>Clarke, S. L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barth+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Orphanet+Journal+of+Rare+Diseases%22%5BJournal%5D)">Barth syndrome.</a> Orphanet Journal of Rare Diseases. 8, 23(2013).</li>
<li>Zegallai, H. M., Hatch, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barth+syndrome%3A+cardiolipin%2C+cellular+pathophysiology%2C+management%2C+and+novel+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Barth syndrome: cardiolipin, cellular pathophysiology, management, and novel therapeutic targets.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 476 (3), 1605-1629 (2021).</li>
<li>Taylor, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+presentation+and+natural+history+of+Barth+Syndrome%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inherited+Metabolic+Disease%22%5BJournal%5D)">Clinical presentation and natural history of Barth Syndrome: An overview.</a> Journal of Inherited Metabolic Disease. 45 (1), 7-16 (2022).</li>
<li>Miller, P. C., Ren, M., Schlame, M., Toth, M. J., Phoon, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bayesian+analysis+to+determine+the+prevalence+of+Barth+syndrome+in+the+pediatric+population%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Bayesian analysis to determine the prevalence of Barth syndrome in the pediatric population.</a> The Journal of Pediatrics. 217, 139-144 (2020).</li>
<li>Bione, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+X-linked+gene%2C+G4.5.+is+responsible+for+Barth+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">A novel X-linked gene, G4.5. is responsible for Barth syndrome.</a> Nature Genetics. 12 (4), 385-389 (1996).</li>
<li>Whited, K., Baile, M. G., Currier, P., Claypool, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seven+functional+classes+of+Barth+Syndrome+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Seven functional classes of Barth Syndrome mutation.</a> Human Molecular Genetics. 22 (3), 483-492 (2013).</li>
<li>Schlame, M., Ren, M., Xu, Y., Greenberg, M. L., Haller, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+symmetry+in+mitochondrial+cardiolipins%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+and+Physics+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">Molecular symmetry in mitochondrial cardiolipins.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 138 (1-2), 38-49 (2005).</li>
<li>Schlame, M., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+function+of+Tafazzin%2C+a+mitochondrial+phospholipid-lysophospholipid+acyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The function of Tafazzin, a mitochondrial phospholipid-lysophospholipid acyltransferase.</a> Journal of Molecular Biology. 432 (18), 5043-5051 (2020).</li>
<li>Schlame, M., Rua, D., Greenberg, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biosynthesis+and+functional+role+of+cardiolipin%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">The biosynthesis and functional role of cardiolipin.</a> Progress in Lipid Research. 39 (3), 257-288 (2000).</li>
<li>Mileykovskaya, E., Dowhan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiolipin+membrane+domains+in+prokaryotes+and+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Cardiolipin membrane domains in prokaryotes and eukaryotes.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1788 (10), 2084-2091 (2009).</li>
<li>Claypool, S. M., Koehler, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complexity+of+cardiolipin+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The complexity of cardiolipin in health and disease.</a> Trends in Biochemical Sciences. 37 (1), 32-41 (2011).</li>
<li>Ren, M., Phoon, C. K., Schlame, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+and+function+of+mitochondrial+cardiolipin%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Metabolism and function of mitochondrial cardiolipin.</a> Progress in Lipid Research. 55, 1-16 (2014).</li>
<li>Paradies, G., Paradies, V., Ruggiero, F. M., Petrosillo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+cardiolipin+in+mitochondrial+function+and+dynamics+in+health+and+disease%3A+Molecular+and+pharmacological+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Role of cardiolipin in mitochondrial function and dynamics in health and disease: Molecular and pharmacological aspects.</a> Cells. 8 (7), 728(2019).</li>
<li>Acoba, M. G., Senoo, N., Claypool, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+ebb+and+flow+makes+mitochondria+go%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Phospholipid ebb and flow makes mitochondria go.</a> The Journal of Cell Biology. 219 (8), 03131(2020).</li>
<li>Schlame, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+abnormalities+in+children+with+Barth+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Phospholipid abnormalities in children with Barth syndrome.</a> Journal of the American College of Cardiology. 42 (11), 1994-1999 (2003).</li>
<li>Wortmann, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inborn+errors+of+metabolism+with+3-methylglutaconic+aciduria+as+discriminative+feature%3A+proper+classification+and+nomenclature%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inherited+Metabolic+Disease%22%5BJournal%5D)">Inborn errors of metabolism with 3-methylglutaconic aciduria as discriminative feature: proper classification and nomenclature.</a> Journal of Inherited Metabolic Disease. 36 (6), 923-928 (2013).</li>
<li>Ikon, N., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+origin+of+3-methylglutaconic+acid+in+disorders+of+mitochondrial+energy+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inherited+Metabolic+Disease%22%5BJournal%5D)">On the origin of 3-methylglutaconic acid in disorders of mitochondrial energy metabolism.</a> Journal of Inherited Metabolic Disease. 39 (5), 749-756 (2016).</li>
<li>Kulik, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bloodspot+assay+using+HPLC-tandem+mass+spectrometry+for+detection+of+Barth+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Bloodspot assay using HPLC-tandem mass spectrometry for detection of Barth syndrome.</a> Clinical Chemistry. 54 (2), 371-378 (2008).</li>
<li>Vaz, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+functional+assay+in+blood+spot+to+diagnose+Barth+syndrome+using+the+monolysocardiolipin%2Fcardiolipin+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inherited+Metabolic+Disease%22%5BJournal%5D)">An improved functional assay in blood spot to diagnose Barth syndrome using the monolysocardiolipin/cardiolipin ratio.</a> Journal of Inherited Metabolic Disease. 45 (1), 29-37 (2022).</li>
<li>Bowron, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+Barth+syndrome+using+a+novel+LC-MS%2FMS+method+for+leukocyte+cardiolipin+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inherited+Metabolic+Disease%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of Barth syndrome using a novel LC-MS/MS method for leukocyte cardiolipin analysis.</a> Journal of Inherited Metabolic Disease. 36 (5), 741-746 (2013).</li>
<li>Sun, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+assisted+laser+desorption%2Fionization+time-of-flight+mass+spectrometric+analysis+of+cellular+glycerophospholipids+enabled+by+multiplexed+solvent+dependent+analyte-matrix+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometric analysis of cellular glycerophospholipids enabled by multiplexed solvent dependent analyte-matrix interactions.</a> Analytical Chemistry. 80 (19), 7576-7585 (2008).</li>
<li>Leopold, J., Popkova, Y., Engel, K. M., Schiller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+of+useful+MALDI+matrices+for+the+mass+spectrometric+characterization+of+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Recent developments of useful MALDI matrices for the mass spectrometric characterization of lipids.</a> Biomolecules. 8 (4), 173(2018).</li>
<li>Angelini, R., Babudri, F., Lobasso, S., Corcelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI-TOF%2FMS+analysis+of+archaebacterial+lipids+in+lyophilized+membranes+dry-mixed+with+9-aminoacridine%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">MALDI-TOF/MS analysis of archaebacterial lipids in lyophilized membranes dry-mixed with 9-aminoacridine.</a> The Journal of Lipid Research. 51 (9), 2818-2825 (2010).</li>
<li>Angelini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidomics+of+intact+mitochondria+by+MALDI-TOF+MS%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Lipidomics of intact mitochondria by MALDI-TOF MS.</a> The Journal of Lipid Research. 53 (7), 1417-1425 (2012).</li>
<li>Angelini, R., Vormieter, G., Corcelli, A., Fuchs, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast+method+for+the+determination+of+PC%2FLPC+ratio+in+intact+horse+serum+by+MALDI-TOF-MS%3A+an+easy-to-follow+lipid+biomarker+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+and+Physics+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">A fast method for the determination of PC/LPC ratio in intact horse serum by MALDI-TOF-MS: an easy-to-follow lipid biomarker of inflammation.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 183, 169-175 (2014).</li>
<li>Angelini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiolipin+fingerprinting+of+leukocytes+by+MALDI-TOF%2FMS+as+a+screening+tool+for+Barth+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiolipin fingerprinting of leukocytes by MALDI-TOF/MS as a screening tool for Barth syndrome.</a> The Journal of Lipid Research. 56 (9), 1787-1794 (2015).</li>
<li>Lobasso, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lipidomic+approach+to+identify+potential+biomarkers+in+exosomes+from+melanoma+cells+with+different+metastatic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">A lipidomic approach to identify potential biomarkers in exosomes from melanoma cells with different metastatic potential.</a> Frontiers in Physiology. 12, 748895(2021).</li>
<li>Angelini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+cholesterol+in+the+brain+by+on-tissue+derivatization+and+quantitative+mass+spectrometry+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Visualizing cholesterol in the brain by on-tissue derivatization and quantitative mass spectrometry imaging.</a> Analytical Chemistry. 93 (11), 4932-4949 (2021).</li>
<li>Greco, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+MALDI-TOF+mass+spectrometry+in+clinical+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical proteomics.</a> Expert Review of Proteomics. 15 (8), 683-696 (2018).</li>
<li>Duncan, M., DeMarco, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI-MS%3A+Emerging+roles+in+pathology+and+laboratory+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Mass+Spectrometry+%28Del+Mar%2C+Calif%29%22%5BJournal%5D)">MALDI-MS: Emerging roles in pathology and laboratory medicine.</a> Clinical Mass Spectrometry (Del Mar, Calif). 13, 1-4 (2019).</li>
</ol>

모든 저자들은 잠재적 인 이해 상충으로 해석 될 수있는 상업적 또는 재정적 관계가없는 상태에서 연구가 수행되었다고 선언합니다.

바르트 증후군은 신진 대사의 선천적 인 오류이며 과소 진단 될 가능성이있는 삶을 변화시키는 상태입니다 2,6. 앞서 언급했듯이, 기여 요인은 간단한 진단 테스트의 부족 일 수 있습니다. 여기에서는 BTHS 스크리닝을 위해 백혈구에서 MALDI-TOF/MS에 의한 MLCL/CL 비율을 측정하는 간단하고 빠른 방법이 설명되었다. 또한, MALDI-TOF 질량 분광계는 전 세계 임상 실험실에 널리 분포되어 있으며 높은 분석 전문 지식31,32을 필요로하지 않습니다.
현재의 방법은 단리된 백혈구의 총 지질 프로파일에서 CL 및 MLCL 종을 MS 분석의 단일 실행에서 동시에 검출할 수 있고, HPLC를 통한 표준 지질 추출 및 분리의 시간이 많...

바르트 증후군 (BTHS)은 조기 발병 심근병증, 골격근 근병증, 성장 지연, 호중구 감소증, 가변 미토콘드리아 호흡 사슬 기능 장애 및 비정상적인 미토콘드리아 구조 1,2,3,4,5를 특징으로 하는 드문 X 연결 질환이다. BTHS는 현재 전 세계적으로 250 건 미만의 알려진 사례가있는 백만 명의 남성 당 한 건의 사례가 유병률을 보였지만 2,6 건의 과소 진단이 가능하다는 것은 널리 받아 들여지고 있습니다. BTHS는 염색체 Xq28.127,8에 국한된 타파진(TAFAZZIN) 유전자의 기능 상실 돌연변이로 인해 미토콘드리아 인지질 카디오리핀(CL)의 결핍된 리모델링을 야기하며, 이는 일반적으로 고도로 대칭적이고 불포화된 아실 조성물 9,10으로 이어지는 과정이다. CL은 미토콘드리아의 시그니처 지질로 간주되어 왔으며, 내막의 중요한 구성 요소이며 산화 인산화 (즉, 미토콘드리아 에너지 대사), 초복합체 형성, 단백질 수입 및 미토콘드리아 역학, 미토파지 및 아폽토시스에 관여합니다 11,12,13,14,15,16 . TAFAZZIN 기능 상실시, CL 리모델링이 실패하고 BTHS 환자의 미토콘드리아에서 특정 인지질 이상이 발생한다: 성숙한 CL 수준(CLm)은 감소하는 반면, 모노리소카디오리핀(MLCL) 및 변경된 CL 아실 조성물(즉, 미성숙 CL 종, CLi)의 증가된 수준이 발생한다. 이것은 MLCL / CL 비율17의 극적인 증가를 가져옵니다.
BTHS의 진단은 장애가 매우 다양한 임상 및 생화학 적 특징을 나타내며 동일한 가족의 영향을받는 개인과 시간 3,5에 따른 환자 내에서 다를 수 있기 때문에 종종 어렵습니다. 많은 BTHS 소년들은 3-메틸글루타콘산(3-MGCA)의 매우 높은 수준의 요로 배설을 보이지만, 소변 수치는 정상이거나 시간이 지남에 따라 환자에서 경미하게 증가할 수 있습니다3. 그러나, 증가된 3-MGCA는 다양한 다른 미토콘드리아 및 비-미토콘드리아 장애, 예컨대 3-메틸글루타코닐-CoA 히드라타제 결핍 (AUH 결함), 3-메틸글루타콘산뇨증, 근긴장 이상-난청, 뇌병증, 레이-유사 (MEGDEL) 증후군, 코스테프 증후군, 및 실조실조증 (DCMA) 증후군을 갖는 확장 심근병증18,19의 특징이다. . 따라서, BTHS에 대한 마커로서 3-MCGA의 불량한 특이성과 환자의 엄청난 가변성은 생화학적 진단을 모호하게 만든다.
더욱이, 120개 이상의 상이한 TAFAZZIN 돌연변이가 장애5 를 야기하는 것으로 기술되었으며, 따라서, 유전자 진단은 복잡하고, 느리고, 비용이 많이 들 수 있다. 더욱이, TAFAZZIN 유전자의 분자 분석은 비코딩 또는 조절 서열3에서 돌연변이의 존재하에 위음성 결과를 초래할 수 있다. BTHS는 (monolyso-)CL 종의 상대적 양 및 분포를 결정함으로써 명확하게 시험될 수 있고, TAFAZZIN 유전자 시퀀싱에 의해 확인되거나 또는 그 반대의 경우도 마찬가지이다.
진단을위한 실용적인 테스트는 혈액 반점20,21에서 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 및 전기 스프레이 이온화 / 질량 분광법 (ESI / MS) 분석에 의한 MLCL / CL 비율의 측정입니다. CL 수준만 측정하는 것은 일부 환자가 CL 수치가 거의 정상에 가깝지만 MLCL/CL 비율이 변경되었기 때문에 진단에 적합하지 않습니다. 따라서, MLCL/CL 비율의 측정은 BTHS 진단(21)에 대한 100% 민감도 및 특이성을 갖는다. HPLC 및 ESI/MS 분석에 기초한 또 다른 검증된 방법이 백혈구22에 설정되었지만, 이전에 추출된 지질을 분리하기 위한 복잡한 크로마토그래피 기술과 장비의 고가성으로 인해 이 분석이 몇몇 임상 실험실로 제한된다. 이러한 모든 요인은 간단한 진단 검사의 부족과 함께 상태의 과소 진단에 기여했습니다.
MALDI-TOF/MS는 지질 분석23,24에서 더 유효한 도구입니다. 이러한 분석 기술은 다양한 생물학적 샘플의 지질 프로파일을 직접 획득하는데 사용될 수 있으며, 따라서 MS 이미징 응용(30)을 위한 조직 절편을 포함하여 추출 및 분리 단계(25,26,27,28,29)를 건너뜁니다. 이러한 이점을 감안할 때, MALDI-TOF/MS를 사용하여 손상되지 않은 백혈구에서 미토콘드리아 CL을 프로파일링하여 BTHS를 진단하는 간단하고 빠른 방법이 개발되었습니다28. 적혈구 침강 및 용해에 의한 전혈 1mL의 백혈구로부터 백혈구 분리는 간단하며 특별한 장비나 시약이 필요하지 않습니다. 더욱이, 미량의 백혈구에 적용 가능한 빠른 지질 "미니-추출" 프로토콜이 무손상 백혈구(28)로부터 수득된 것보다 더 높은 신호-대-잡음비(S/N)를 갖는 더 깨끗한 MS 신호를 갖는 스펙트럼의 성공적인 획득을 보증하기 위해 기술되었다. 이 추가 단계는 시간이 거의 걸리지 않으며 감도가 낮은 MS 장비에서 수행 된 경우에도 분석을 재현 할 수 있습니다. 요약하면, 여기에 설명 된 분석 방법은 시간이 많이 걸리고 노동 집약적 인 크로마토그래피 지질 분리를 건너 뛸 수 있기 때문에 최소한의 샘플 준비가 필요하므로 테스트 속도가 빨라집니다.

<table><tbody><tr><td>1,1&prime;,2,2&prime;-tetratetradecanoyl cardiolipin</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>750332</td><td>MALDI-TOF 보정을 위한 지질 표준</td></tr>물 <tr><td>1,1&prime; 2,2&prime;-tetra-(9Z-octadecenoyl) cardiolipin</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>710335</td><td>MALDI-TOF 보정을 위한 지질 표준</td></tr>물 <tr><td>1,2-di-(9Z-hexadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanolamine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>878130</td><td>MALDI-TOF 보정을 위한 지질 표준물</td></tr><tr><td>1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phosphate</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>830845</td><td>MALDI-TOF 보정을 위한 지질 표준물</td></tr><tr><td>1,2-ditetradecanoyl-snglycero-3-phospho-(1&prime;-rac-glycerol)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840445</td><td>MALDI-TOF 보정을 위한 지질 표준물</td></tr><tr><td>1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840033</td><td>MALDI-TOF 보정을 위한 지질 표준물</td></tr><tr><td>2-Propanol, ACS 시약, &ge; 99.5%</td><td>머크 생명과학 S.r.l.</td><td></td><td></td>190764</tr><tr><td>9-Aminoacridine hemihydrate, 98%</td><td>Acros 유기물</td><td>134410010</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile, ACS 시약, &ge; 99.5%</td><td>머크 생명과학 S.r.l.</td><td></td><td></td>360457</tr><tr><td>클로로포름, ACS 시약, &ge; 99.8%</td><td>머크 생명과학 S.r.l.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>319988 Leuconostoc spp. Mr 450,000-650,000</td><td>Merck Life Science S.r.l.</td>의 덱스트란<td>31392</td><td></td></tr><tr><td>플렉스 분석 3.3</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td>소프트웨어</td></tr><tr><td>MALDI-TOF 질량 분석기 Microflex LRF</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft Office</td><td></td><td>소프트웨어</td></tr><tr><td>OmniPur 10X PBS 액체 농축액</td><td>Merck Life Science Srl.</td><td>6505-OP</td><td></td></tr><tr><td>염화칼륨, ACS 시약, 99.0-100.5%</td><td>Merck Life Science Srl</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨, ACS 시약, &ge; 99.0%</td><td>머크 생명과학 무역</td><td>S9888</td><td></td></tr></tbody></table>

barth 증후군의 신속한 진단을 위해 질량 분광법에 의한 백혈구의 카디오리핀 지문 채취

Fingerprinting Cardiolipin in Leukocytes by Mass Spectrometry for a Rapid Diagnosis of Barth Syndrome

카디오리핀 (CL)은 그 구조에서 네 개의 지방산 사슬을 운반하는 이량체 인지질로, 미토콘드리아의 지질 마커이며, 여기서 내막의 기능에 중요한 역할을합니다. 그것의 대사 산물 monolysocardiolipin (MLCL)는 생리 학적으로 동물 세포의 지질 추출물에 거의 존재하지 않으며 그 외관은 유아기에 심각한 심근 병증을 일으키는 희귀하고 종종 잘못 진단 된 유전 질환 인 Barth 증후군 (BTHS)의 특징입니다. 여기에 기술된 방법은 "카디오리핀 지문"을 생성하고, 세포 지질 프로파일에서 CL 및 MLCL 종의 상대적 수준에 대한 간단한 검정을 허용한다. 백혈구의 경우, 혈액 철수로부터 2 시간 이내에 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 (비행 시간 / 질량 분광법 (MALDI-TOF / MS) 를 통해 MLCL / CL 비율을 측정하기 위해 1 mL의 혈액 만 필요합니다. 이 분석은 간단하며 BTHS를 스크리닝하기 위해 임상 생화학 실험실의 일상적인 작업에 쉽게 통합 될 수 있습니다. 이 검사는 BTHS에 대한 100 % 민감도와 특이성을 보여 주므로 적합한 진단 테스트입니다.

이 연구에서는 1mL의 전혈에서 백혈구를 분리하고 MALDI-TOF/MS에 의한 CL 지문 채취를 얻는 간단하고 신속한 방법이 설명되었습니다( 그림 2 참조). 도 3 은 CL 및 MLCL 질량(m/z) 범위에서 대조군 피험자와 BTHS 어린 소년으로부터 수득된 백혈구의 대표적인 CL 핑거프린팅의 비교를 보여준다. 표 1은 이들 질량 스펙트럼에서 검출된 CL 및 MLCL 종을 열거한다.
TAFAZZIN 유전자의 결함은 전형적으로 BTHS에 특이적인 지질 프로파일, 즉 CL 지문에서 CLm 형태의 감소와 함께 MLCL 및 CLi 형태의 출현을 결정한다. 대조군 피험자의 백혈구의 지질 프로파일은 전형적으로 CLm의 단지 두 개의 분자 종만을 나타낸다(도 3의 상부 패널). 이 질...

이 프로토콜은 Barth 증후군의 진단을 위해 백혈구 카디오리핀의 질량 분광법 "지문"을 얻는 방법을 보여줍니다. 모노리소카디오리핀과 카디오리핀 비율의 상승된 평가는 바르트 증후군 환자를 100% 민감도와 특이성을 가진 대조군 심부전 환자와 구별합니다.

Barth 증후군의 신속한 진단을 위해 질량 분광법에 의한 백혈구의 카디오리핀 지문 채취

Cardiolipin (CL), a dimeric phospholipid carrying four fatty acid chains in its structure, is the lipid marker of mitochondria, wherein it plays a crucial ...

이 방법은 MALDI-TOF 질량 분광법에 의해 백혈구의 카디오리핀 핑거 프린팅을 생성하고 Barth 증후군의 신속한 진단을 위해 모노리소카디오리핀과 카디오리핀 사이의 비율을 측정 할 수있게합니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 한 밀리리터의 혈액에서 백혈구를 분리 한 직후에 단일 질량 분광법에 의한 진단 지질 종의 검출입니다. 이들 및 안구 민감도 및 특이성은 이 검정을 Barth 증후군을 스크리닝하기 위해 임상 실험실의 일상적인 작업에 통합하기에 적합한 진단 시험으로 만든다.혈액 샘플을 궤도 쉐이커에 10 분 동안 올려 놓음으로써 시작하십시오. 다음으로, 1.5 밀리리터 튜브에 전혈 0.9 밀리리터에 0.1 밀리리터의 20 % 덱스트란을 첨가하십시오. 이제 피펫을 하고 기포를 피하면서 서스펜션을 20배 부드럽게 분산시키고 RBCs를 실온에서 약 한 시간 동안 침전시킨다.주사기를 사용하여, 황색 상청액을 수집하고 15 밀리리터 튜브로 옮긴 다음, 실온에서 15분 동안 400배 G에서 원심분리한다. 상청액을 버린 후, 주로 백혈구 및 잔류 RBC를 함유하는 펠렛을 0.6 밀리리터의 얼음 차가운 이중 증류수에 재현탁시킨다. 약 15초 후, 0.2밀리리터의 0.6몰 염화칼륨을 세포 현탁액에 첨가하여 정확한 삼투압을 회복시킨다.짧은 삼투압 쇼크는 RBC를 용해시키고 백혈구를 그대로 유지합니다. 그런 다음 단일 강도 PBS로 최종 부피를 2.5 밀리리터로 조정하십시오. 다음에, 현탁액을 실온에서 15분 동안 400배 G에서 원심분리한다.이어서 상청액을 버리고 백혈구 펠렛을 2.5 밀리리터의 단일 강도 PBS로 재세척하였다. 원심분리를 반복하고 앞서 기술한 바와 같이 상층액을 버리고, 백혈구를 함유하는 펠렛을 멸균된 이중 증류수 200 마이크로리터에 재현탁시킨다. 현탁액을 섭씨 영하 80도에서 동결하거나 지질 추출을 직접 수행하십시오.20 마이크로리터의 백혈구 현탁액을 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고 16, 000 배 G에서 30 초 동안 회전시켜 추출을 시작하십시오. 상청액을 버린 후 나머지 펠렛에 클로로포름 10 마이크로 리터를 넣고 지질 추출을 촉진하기 위해 반복적으로 피펫을 반복하십시오. 이제 10 마이크로 리터의 9- 아미노 아크리딘 매트릭스 용액을 클로로포름의 펠렛에 첨가하십시오.피펫과 혼합을 위해 반복적으로 분산시킨다. 지질 및 클로로포름 및 9-아미노아크리딘 매트릭스 용액을 함유하는 용액을 16, 000배 G에

fingerprinting-cardiolipin-leukocytes-mass-spectrometry-for-rapid

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

면역 기관과 세포의 glycosphingolipid 항원의 표현 프로필에 대한 통찰력을 얻을 수있는 구체적이고 민감한 방법을 설명합니다. 방법은 화학적으로 합성 표준에 비해 구조 분석을위한 glycosphingolipid 분자의 단계 - 현명한 조각을 허용 이온 트랩 질량 분광법을 활용합니다.

Glycosphingolipid 항원의 대량 Spectrometric 분석

이 비디오는 인간의 혈소판에서 근위축성 측삭 경화증(ALS)과 관련된 단백질 바이오마커를 검출하기 위한 모세관 전기영동 면역분석 프로토콜을 보여줍니다. ALS 바이오마커 단백질의 존재 확인은 혈소판 단백질의 크기 기반 분리와 화학발광 검출을 통해 이루어집니다.

단백질 바이오마커 검출을 위한 모세관 전기영동 면역분석

탈착 전기 분무 이온화 질량 분석법 (DESI-MS)는 생체 조직 등의 시료는 최소한의 샘플 준비로 이미징 할 수있는 주위 방법입니다. 이온화 프로브 아래에 샘플을 래스터로,이 스프레이 기반 기술은 조직 섹션에서 관심의 분자 기능을 식별 할 수있는 충분한 공간 해상도를 제공합니다.

탈착 전기 분무 이온화 질량 분석에 의한 생물 조직의 이미지

복잡한 생물학적 시료의 측정 생체 점점 의사 결정 임상 지침입니다. 우리는 동시에 심장 미오신 결합 단백 C, 크레아틴 키나제 MB, 심근 경색 및 건강한 대조군과 과목에서 혈청 샘플에서 심장 트로포 닌 I를 측정하는 매우 민감한 방법을 설명합니다.

Electrochemiluminescence의 면역에 의한 혈청 심장 마이 오신 결합 단백질-C의 결정에 대한 민감하고 구체적인 정량 방법

바이오 마커는 질병이나 건강의 직접 측정 한 생물학적 지표입니다. 인구 및 사회 과학, 바이오 마커, 전송을 쉽게 얻을 수 있으며, 분석 할 필요가있다. 말린 혈액 스팟 (DBS) 컬렉션이이 요구 사항을 충족, 높은 응답 속도로 현장에서 수집하고 생체의 다양한 분석 할 수 있습니다.

건강 바이오 마커의 혈액 스팟 컬렉션 인구 연구에의 참여를 극대화하기 위해 건조

쉬스 다공질 팁 인터페이스 설계를 이용하여 모세관 전기 영동 - 질량 분석법에 의한 생체 시료의 대사 프로파일 링을위한 프로토콜이 제시된다.

생물 시료의 대사 프로파일 링에 대한 쉬스 모세관 전기 영동 - 질량 분석

지질 방울은 C 형 간염 바이러스 (HCV) 등 여러 가지 병원균의 복제에 중요한 소기관이다. 우리는 관련 단백질의 양적 질량 분석에 대한 지질 방울을 분리하는 방법을 설명; 그것은 바이러스 감염, 환경 스트레스, 또는 약물 치료와 같은 조건의 다양한에서 사용할 수 있습니다.

양적 질량 분광법 분석을위한 지질 물방울 절연

신경 퇴행성 질환에 대한 혈액 기반 바이오 마커는 대규모 임상 연구를 구현하는 데 필수적입니다. 신뢰할 수 있고 검증된 혈액 검사는 작은 샘플 부피뿐만 아니라 덜 침습적 샘플링 방법, 저렴하고 재현성이 있어야 합니다. 이 논문은 고처리량 모세관 전기 영동 면역 분석이 잠재적인 바이오마커 개발을 위한 기준을 충족한다는 것을 보여줍니다.

인간 혈소판에서 근위축성 측삭 경화증의 잠재적인 바이오마커를 검색하기 위해 모세관 전기 영동 면역 분석사용

본원에서, 우리는 전체 인간 혈장 또는 혈청에 존재하는 고밀도 지단백질(HDL)에 의해 지질 공여자 입자로부터 특이적으로 제거된 형광 인지질의 양을 측정하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 HDL 기능의 이 지표가 발생 심혈관 질환을 예측한다는 것을 보여주었습니다.

고밀도 지단백질 특이적 인지질 유출 분석

구조적 유연성은 단백질 기능에 중요한 역할을한다. 여기서, 우리는 주문과 무질서 단백질의 기능을 구동 급속한 구조적 변화를 프로빙 수소 - 중수소 교환 결합 시분 전기 분무 이온화 질량 분석법의 사용을 설명합니다.

시간 해결 전기 분무 이온화 수소 - 중수소 교환 질량 분석 단백질 구조와 역학 연구를위한

배우세요 MALDI-TOF 질량 분석법을 이용한 백혈구 카디오리핑 지문 채취로 Barth 증후군을 신속 진단하는 방법입니다. 단 한 번의 분석으로 높은 민감도와 특이도를 제공합니다.

Barth 증후군의 신속한 진단을 위해 질량 분광법에 의한 백혈구의 카디오리핀 지문 채취

더 많은 동영상 탐색