Name: 포유동물 세포 용해물에서 E3 유비퀴틴-리가아제에 의한 기질 유비퀴틸화의 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: 학습하세요 포유동물 세포 용해물에서 면역침전과 면역블로팅을 이용한 E3 유비퀴틴-리가아제에 의한 기질 유비퀴틸화 평가 방법을. 이 기술은 암과 신경계 질환 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

F.R.T는 FAPESP 보조금 번호 2020/15771-6 및 CNPq 유니버설 405836/2018-0에서 지원됩니다. P.M.S.P 및 V.S는 CAPES에서 지원됩니다. C.R.S.T.B.C는 FAPESP 장학금 번호 2019/23466-1의 지원을 받았습니다. 재료 지원에 대한 Sandra R. C. Maruyama (FAPESP 2016/20258-0)에게 감사드립니다.

참고: 포유동물 세포에서 유비퀴틸화 분석 프로토콜의 개요는 도 1에 표시되어 있다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63561/63561fig01.jpg"> 그림 1. 유비퀴틸화 분석 절차의 개요. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63561/63561fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
1. 세포 배양
<ol><li>HEK293T 세포주를 100mm TC 처리 배양 접시에서 성장 배지에서 80%-90% 합류로 성장시킨다(둘베코 변형 이글 배지(DMEM) 고포도당 10% 태아 소 혈청(FBS) 및 페니실린(100 단위), 스트렙토마이신(100 μg) 및 L-글루타민(0.292 mg/mL)으로 보충됨). 배양물을 5%CO2의 가습된 세포 배양 인큐베이터에서 37°C에서 인큐베이션한다.</li>
	<li>세포를 통과시키기 위해, 혈청학적 피펫을 사용하여 배양 접시로부터 배지를 흡인한다. 세포를 멸균된 1x 포스페이트 완충 식염수 1 mL(PBS 1x)로 1회 세척한다.</li>
	<li>트립신/EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 용액 1mL를 첨가하여 세포를 분리합니다. 접시를 37°C에서 5분 동안 인큐베이션한다. 세포를 2 mL의 성장 배지에 혈청학적 피펫을 사용하여 재현탁시킨다.</li>
	<li>세포 현탁액을 신선하고 깨끗한 15 mL 튜브에 옮기고 실온에서 5분 동안 500 x g 에서 원심분리기(RT)한다. 상층액을 조심스럽게 부어 제거하십시오. 세포 펠릿을 3 mL의 성장 배지에 부드럽게 재현탁시켜 위아래로 피펫팅하여 균질한 세포 현탁액을 얻었다.</li>
	<li>세포 현탁액 1 mL를 9 mL의 성장 배지를 함유하는 100 mm TC 처리 배양 접시로 옮긴다. 참고 : 세포가 양호한 조건에있는 경우, 합류율이 80 % -90 % 인 HEK293T의 각 배양 접시는 계대 2 일 후에 80 % 합류로 세 가지 배양 접시를 생성 할 수 있습니다.</li>
</ol>2. 세포 형질감염
참고: 합류율에 도달한 것이 80% 미만인 경우 세포 배양물을 형질감염시키는 것은 권장되지 않습니다.
<ol><li>형질감염 전에, 세포가 오염으로부터 자유롭고 일시적인 형질감염에 대한 적절한 합류에 있는지 인증하십시오.</li>
	<li>각 트랜스펙션 샘플에 대해 DNA-Polyethylenimine (pH 7.2에서 PEI 1 μg/μL) 복합체를 다음과 같이 준비하십시오.<ol>
<li>각 플라스미드 3 μg을 100 μL의 opti-MEM I 환원 혈청 배지에 보충 없이 희석하고, 용액을 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합한다. 참고: 여기에서, 세포를 4 μg의 각 플라스미드로 형질감염시켰다: 빈 벡터 (pcDNA3) 또는 FLAG-Fbxo7 구축물 및 UXT-V2-HA, 6xHis-myc-유비퀴틴을 포함하거나 포함하지 않는. 총 DNA 함량은 12 μg이었다.</li>
		<li>RT에서 PEI를 해동하고 DNA 1 μg 당 PEI의 3 μL의 비율에 따라 용액에 첨가한다. 위아래로 피펫팅하여 용액을 균질화하십시오. 그런 다음 DNA-PEI 복합체의 형성을 허용하기 위해 RT에서 15 분 동안 인큐베이션하십시오. 참고: DNA 양당 PEI 부피의 최적 비율은 선택된 세포주에 따라 다릅니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>DNA-PEI 복합체의 총 부피를 세포 배양물이 들어있는 각 접시에 넣고 플레이트를 앞뒤로 흔들어 부드럽게 혼합합니다. 세포를 5%CO2의 가습된 세포 배양 인큐베이터에서 37°C에서 인큐베이션한다.</li>
	<li>5시간 후에 성장 배지를 교체하면, PEI 노출이 길어지면 HEK293T 세포에 독성이 있을 수 있기 때문이다. 세포를 37°C에서 36시간 동안 5%CO2 의 가습된 세포 배양 인큐베이터에서 인큐베이션한다.</li>
</ol>3. 세포 용해 및 면역 침전
<ol><li>인큐베이션 기간 및 세포 용해 전에 6시간 후, 형질감염된 세포를 10 μM의 프로테아좀 억제제 MG-132로 처리한다. 다시 한번, 세포를 5%CO2의 가습된 세포 배양 인큐베이터에서 37°C에서 인큐베이션한다.</li>
	<li>혈청학적 피펫을 사용하여 각 배양 접시로부터 배지를 흡인하고, 이를 1 mL의 1x PBS로 1회 세척한다. 트립신 1 mL를 첨가하여 세포를 분리하고, 디쉬를 37°C에서 5분 동안 인큐베이션한다. 세포를 1 mL의 성장 배지에 재현탁시킨다.</li>
	<li>세포 현탁액을 신선하고 깨끗한 15 mL 튜브로 옮기고 RT에서 5분 동안 500 x g 에서 원심분리한다.</li>
	<li>상층액을 조심스럽게 부어 제거하십시오. 세포 펠렛을 200 μL의 빙냉 NP-40 용해 완충액 (50 mM Tris-HCl pH 7.2, 225 mM KCl, 및 1% NP-40)에 부드럽게 재현탁시키고, 프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일 (10 mM NaF 및 1 mMNa3VO4)로 보충하고, 용액을 깨끗한 1.5 mL 마이크로튜브 내로 옮겼다.</li>
	<li>세포 용해물을 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 세포 용해물을 4°C에서 20분 동안 16,900 x g 에서 원심분리한다.</li>
	<li>한편, 아가로스-항-HA 비드를 빙냉 NP-40 용해 완충액으로 평형화시킨다. 각 샘플에 대해 15 μL의 아가로스 항-HA 비드를 사용한다. 비드를 200 μL의 NP-40 용해 완충액으로 세척하고, 이를 4°C에서 1분 동안 3,000 x g 의 마이크로원심분리 튜브에서 펄싱한다. 피펫으로 상층액을 매우 조심스럽게 흡인하고 버리십시오. 이 과정을 세 번 반복하십시오. 그 후, 사용할 때까지 구슬을 얼음 위에 평형으로 유지하십시오.</li>
	<li>세포 용해물을 원심분리한 후, 상층액을 회수한다. 브래드포드 방법16을 사용하여 총 용해물 중의 단백질 함량을 정량화한다.</li>
	<li>면역침전을 실시한 각 샘플이 동일한 양의 단백질을 제시하는지 확인하십시오. 필요한 부피의 세포 용해물을 평형화된 아가로스 항-HA 비드와 함께 4시간 동안 인큐베이션하고, 4°C의 회전 인큐베이터에서 부드럽게 회전시켜 UXT-V2-HA가 아가로스-항-HA 비드에 결합할 수 있게 한다.</li>
	<li>아가로스 항-HA 비드를 4°C에서 1분 동안 3,000 x g 의 마이크로원심분리 튜브에서 펄싱하여 수집한다. 조심스럽게 상층액을 흡인하고 버리십시오. 빙냉 NP-40 세포 용해 완충액으로 비드를 세 번, 얼음처럼 차가운 FLAG/HA 완충액(10mM Hepes pH 7.9, 15mM MgCl2, 225mM KCl 및 0.1% NP-40)으로 두 번 세척합니다.</li>
	<li>최종 세척 후, 피펫을 사용하여 모든 상층액을 조심스럽게 제거하고 FLAG/HA 완충액에 희석된 HA 펩티드(300 μg/mL)로 폴리유비퀴틸화된 단백질을 용출시킨다. 아가로스 항-HA 비드를 HA 펩티드와 함께 4°C에서 1시간 동안 락킹 진탕기 플랫폼에서 인큐베이션한다.</li>
	<li>비드를 4°C에서 2분 동안 3,000 x g 으로 스핀다운하고, 폴리유비퀴틴화 단백질을 함유하는 상등액을 조심스럽게 피펫팅한다. 필요한 경우, 용출액을 -20°C의 신선하고 깨끗한 마이크로튜브에 보관한다.</li>
	<li>용출액 및 세포 용해물을 10% SDS-PAGE (소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동)17로 해결하고 면역블롯팅한다.</li>
	<li>본 연구에서, 습식 전달 WB가 수행되었다. 이러한 종류의 전송을 위해 젤을 여과지 - 젤 - 멤브레인 - 필터 페이퍼로 구성된 전사 샌드위치에 넣고 패드로 쿠션하고 지지대로 함께 누르십시오. 이 시스템을 이송 버퍼로 채워진 탱크와 스테인리스강/백금 와이어 전극 사이에 수직으로 배치합니다. 전달은 습식 전달 완충액 (글리신 192 mM, 트리스-염기 25 mM, 0.025% SDS, 20% 메탄올)에서 150 V에서 90분 동안 발생한다. 참고: 세포 추출물이 정량화되었기 때문에(단계 3.7), 각 샘플에 대해 동일한 양의 단백질로 SDS-PAGE를 실행한다. 또한 용출액을 해결하려면 각 샘플의 동일한 볼륨을 실행하십시오.</li>
	<li>선택된 항체 11을 사용하여 면역블롯 막을 프로브한다. 야생형 E3 리가아제, 기질, 및 myc-ub를 함유하는 샘플에서 항myc 항체를 사용하여 IP 공정에서 뽑아낸 폴리유비퀴틸화된 기질로부터의 용출액에서 도말 신호가 검출되는지 확인한다. 세포 용해물(input)에서, 선택된 기질, Fbxo7 단백질, 유비퀴틸화 단백질, 및 하우스키핑 단백질(예를 들어, GAPDH 및 β-액틴)으로부터의 신호가 검출되어 각 레인에서 동일한 양의 단백질을 보장하는지 확인한다. 주: 사용된 각 항체에 대한 희석은 제조자의 지시에 따라 제조되었다.</li>
</ol>

<ol><li>Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitination+in+disease+pathogenesis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment.</a> Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).</li>
<li>Callis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitination+machinery+of+the+ubiquitin+system%5BTitle%5D)+AND+%22The+Arabidopsis+Book%22%5BJournal%5D)">The ubiquitination machinery of the ubiquitin system.</a> The Arabidopsis Book. 12, 0174(2014).</li>
<li>Koegl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+ubiquitination+factor%2C+E4%2C+is+involved+in+multiubiquitin+chain+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel ubiquitination factor, E4, is involved in multiubiquitin chain assembly.</a> Cell. 96 (5), 635-644 (1999).</li>
<li>French, M. E., Koehler, C. F., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+functions+of+branched+ubiquitin+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Discovery%22%5BJournal%5D)">Emerging functions of branched ubiquitin chains.</a> Cell Discovery. 7 (1), 6(2021).</li>
<li>Komander, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+discrimination+of+structurally+equivalent+Lys+63-linked+and+linear+polyubiquitin+chains%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Molecular discrimination of structurally equivalent Lys 63-linked and linear polyubiquitin chains.</a> EMBO Reports. 10 (5), 466-473 (2009).</li>
<li>Clague, M. J., Urbé, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin%3A+Same+molecule%2C+different+degradation+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin: Same molecule, different degradation pathways.</a> Cell. 143 (5), 682-685 (2010).</li>
<li>Davies, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vps9p+CUE+domain+ubiquitin+binding+is+required+for+efficient+endocytic+protein+traffic%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Vps9p CUE domain ubiquitin binding is required for efficient endocytic protein traffic.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 19826-19833 (2003).</li>
<li>Raasi, S., Wolf, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+receptors+and+ERAD%3A+A+network+of+pathways+to+the+proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin receptors and ERAD: A network of pathways to the proteasome.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 18 (6), 780-791 (2007).</li>
<li>Pan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+Ubr1-mediated+N-degron+polyubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural insights into Ubr1-mediated N-degron polyubiquitination.</a> Nature. 600 (7888), 334-338 (2021).</li>
<li>Raducu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCF+%28Fbxl17%29+ubiquitylation+of+Sufu+regulates+Hedgehog+signaling+and+medulloblastoma+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">SCF (Fbxl17) ubiquitylation of Sufu regulates Hedgehog signaling and medulloblastoma development.</a> The EMBO Journal. 35 (13), 1400-1416 (2016).</li>
<li>Spagnol, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+E3+ubiquitin+ligase+SCF%28Fbxo7%29+mediates+proteasomal+degradation+of+UXT+isoform+2+%28UXT-V2%29+to+inhibit+the+NF-%CE%BAB+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+General+Subjects%22%5BJournal%5D)">The E3 ubiquitin ligase SCF(Fbxo7) mediates proteasomal degradation of UXT isoform 2 (UXT-V2) to inhibit the NF-κB signaling pathway.</a> Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1865 (1), 129754(2021).</li>
<li>Teixeira, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gsk3%CE%B2+and+Tomm20+are+substrates+of+the+SCFFbxo7%2FPARK15+ubiquitin+ligase+associated+with+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Gsk3β and Tomm20 are substrates of the SCFFbxo7/PARK15 ubiquitin ligase associated with Parkinson's disease.</a> Biochemical Journal. 473 (20), 3563-3580 (2016).</li>
<li>Tan, M. K. M., Lim, H. J., Bennett, E. J., Shi, Y., Harper, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+SCF+adaptor+capture+proteomics+reveals+a+role+for+SCFFBXL17+in+NRF2+activation+via+BACH1+repressor+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Parallel SCF adaptor capture proteomics reveals a role for SCFFBXL17 in NRF2 activation via BACH1 repressor turnover.</a> Molecular Cell. 52 (1), 9-24 (2013).</li>
<li>van Wijk, S. J., Fulda, S., Dikic, I., Heilemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+ubiquitination+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Visualizing ubiquitination in mammalian cells.</a> EMBO Reports. 20 (2), 1-18 (2019).</li>
<li>Kisselev, A. F., Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteasome+inhibitors%3A+From+research+tools+to+drug+candidates%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Proteasome inhibitors: From research tools to drug candidates.</a> Chemistry and Biology. 8 (8), 739-758 (2001).</li>
<li>Bradford, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 228, 726-734 (1970).</li>
<li>Schröer, A., Schneider, S., Ropers, H. -H., Nothwang, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+UXT%2C+a+novel+gene+in+human+Xp11%2C+which+is+widely+and+abundantly+expressed+in+tumor+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of UXT, a novel gene in human Xp11, which is widely and abundantly expressed in tumor tissue.</a> Genomics. 56 (3), 340-343 (1999).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UXT-V1+facilitates+the+formation+of+MAVS+antiviral+signalosome+on+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">UXT-V1 facilitates the formation of MAVS antiviral signalosome on mitochondria.</a> The Journal of Immunology. 188 (1), 358-366 (2012).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UXT-V1+protects+cells+against+TNF-induced+apoptosis+through+modulating+complex+II+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">UXT-V1 protects cells against TNF-induced apoptosis through modulating complex II formation.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (8), 1389-1397 (2011).</li>
<li>Sun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UXT+is+a+novel+and+essential+co-factor+in+the+NF-%CE%BAB+transcriptional+enhanceosome%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">UXT is a novel and essential co-factor in the NF-κB transcriptional enhanceosome.</a> The Journal of Cell Biology. 178 (2), 231-244 (2007).</li>
<li>Huang, X., Dixit, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drugging+the+undruggables%3A+Exploring+the+ubiquitin+system+for+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Drugging the undruggables: Exploring the ubiquitin system for drug development.</a> Cell Research. 26 (4), 484-498 (2016).</li>
<li>Rajkumar, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+myeloma%3A+2020+update+on+diagnosis%2C+risk-stratification+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Multiple myeloma: 2020 update on diagnosis, risk-stratification and management.</a> American Journal of Hematology. 95 (5), 548-567 (2020).</li>
<li>Hideshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proteasome+inhibitor+PS-341+inhibits+growth%2C+induces+apoptosis%2C+and+overcomes+drug+resistance+in+human+multiple+myeloma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The proteasome inhibitor PS-341 inhibits growth, induces apoptosis, and overcomes drug resistance in human multiple myeloma cells.</a> Cancer Research. 61 (7), 3071-3076 (2001).</li>
<li>Tietsche, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+proteasome+inhibitors+in+the+treatment+of+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Hematology%2C+Transfusion+and+Cell+Therapy%22%5BJournal%5D)">New proteasome inhibitors in the treatment of multiple myeloma.</a> Hematology, Transfusion and Cell Therapy. 41 (1), 76-83 (2018).</li>
<li>Vassilev, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+activation+of+the+p53+pathway+by+small-molecule+antagonists+of+MDM2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo activation of the p53 pathway by small-molecule antagonists of MDM2.</a> Science. 303 (5659), 844-848 (2004).</li>
<li>Kuiken, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+F-box+only+protein+7+as+a+negative+regulator+of+NF-kappaB+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Identification of F-box only protein 7 as a negative regulator of NF-kappaB signalling.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (9), 2140-2149 (2012).</li>
<li>Yuan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bafilomycin+A1+targets+both+autophagy+and+apoptosis+pathways+in+pediatric+B-cell+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Bafilomycin A1 targets both autophagy and apoptosis pathways in pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Haematologica. 100 (3), 345-356 (2015).</li>
<li>Iconomou, M., Saunders, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+approaches+to+identify+E3+ligase+Substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Systematic approaches to identify E3 ligase Substrates.</a> Biochemical Journal. 473 (22), 4083-4101 (2016).</li>
<li>Zhang, Z. R., Bonifacino, J. S., Hegde, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deubiquitinases+sharpen+substrate+discrimination+during+membrane+protein+degradation+from+the+ER%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Deubiquitinases sharpen substrate discrimination during membrane protein degradation from the ER.</a> Cell. 154 (3), 609-622 (2013).</li>
<li>Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+age+of+crosstalk%3A+Phosphorylation%2C+ubiquitination%2C+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The age of crosstalk: Phosphorylation, ubiquitination, and beyond.</a> Molecular Cell. 28 (5), 730-738 (2007).</li>
</ol>

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

유비퀴틸화는 여러 단백질의 수준을 조절하고 많은 신호 전달 경로와 생물학적 과정에서 중요한 역할을하여 건강한 세포 내 환경을 보장하는 번역 후 필수적인 변형입니다. 유비퀴틴-프로테아좀 시스템(UPS)은 최근 제약 연구의 주요 초점 중 하나로서, 종양 억제제를 안정화시키거나 종양원성 생성물(22)의 분해를 유도할 수 있는 가능성을 제공한다. 예를 들어, 다발성 골수종 (MM)에서 모노클로날 면역글로불린 분비를 담당하는 혈장 세포 신생물의 비정상적인 증식은 소포체 (ER)23에서 잘못 접히거나 펼쳐진 단백질 축적으로 인한 병리생리학적 경로를 촉진한다. 이 ER 스트레스가 발생하면 유비퀴틴 - 프로테아 좀 시스템의 활성화를 포함한 여러 프로세스를 활성화합니다. 다발성 골수종 치료를 위해 단백질 축적 및 그에 따른 세포 사멸을 유도하기 위해 프로테아좀 억제제 (보르테조맙, 카르필조미브 및 ixazomib)의 사용은 고위험 환자<sup class="xr...

번역 후 변형 (PTMs)은 세포 항상성에 필수적인 단백질 조절과 관련된 중요한 메커니즘입니다. 단백질 유비퀴틸화는 진핵 생물에서 여러 가지 세포 결과를 초래하는 다양한 신호의 구색을 생성하는 역동적이고 복잡한 변형입니다. 유비퀴틸화는 76개의 아미노산을 함유하는 유비퀴틴 단백질을 기질에 부착시키는 것으로 이루어진 가역적 과정으로, 세 가지 별개의 반응으로 구성된 효소적 캐스케이드에서 발생한다1. 첫 번째 단계는 유비퀴틴 활성화를 특징으로 하는데, 이는 E1 효소의 활성 부위에 존재하는 유비퀴틴 C 말단과 시스테인 잔기 사이에 고에너지 티오에스테르 결합 유비퀴틴을 형성하기 위해 ATP 가수분해에 의존한다. 이어서, 유비퀴틴은 E2 효소로 전달되어 유비퀴틴과 티오에스테르-유사 복합체를 형성한다. 그 후, 유비퀴틴은 E2에 의해 기질에 공유적으로 부착되거나, 또는 더 자주, 기질 2,3을 인식하고 상호작용하는 E3 효소에 의해 공유된다. 때때로, E4 효소 (유비퀴틴 사슬 신장 인자)는 다중 유비퀴틴 사슬 조립을 촉진하기 위해필요하다 3.
유비퀴틴은 7개의 리신 잔기(K6, K11, K27, K29, K33, K48 및 K63)를 가지고 있어, 몇몇 이펙터 단백질 4,5에 의해 인식될 상이한 삼차원 구조를 생성하기 위해 별개의 결합을 생성하는 폴리유비퀴틴 사슬의 형성을 허용한다. 따라서, 기질에 도입된 폴리유비퀴틴 사슬의 종류는 그의 세포 운명 6,7,8을 결정하는 데 필수적이다. 더욱이, 기질은 또한 N-데그론(N-degrons)이라고 불리는 그의 N 말단 잔기를 통해 유비퀴틴화될 수 있다. 특정 E3 유비퀴틴-리가아제는 N-데그론 인식을 담당하며, 근처의 리신 잔기9의 폴리유비퀴틸화를 허용한다.
요즘에는 40 개 이상의 SCF 특정 기판이 특징입니다. 그 중에서도 세포 분화 및 발달뿐만 아니라 세포 생존 및 사망을 포함한 여러 생물학적 경로의 주요 조절인자는10,11,12,13을 찾을 수 있습니다. 따라서, 각 E3 유비퀴틴-리가아제의 특정 기질의 확인은 다양한 생물학적 사건에 대한 포괄적인 지도를 설계하는데 필수적이다. 진정한 기질의 확인이 생화학적으로 도전적이더라도, 생화학 기반 방법의 사용은 사슬 특이성과 모노- 및 폴리유비퀴틸화 사이의 구별을 평가하는데 매우 적합하다(14). 본 연구는 E3 유비퀴틴-리가아제 복합체 SCF(Fbxo7)와 함께 기질 UXT-V2(유비쿼터스로 발현된 프리폴딘-유사 샤페론 이소폼 2)를 과발현하는 포유동물 세포주 HEK293T를 이용한 유비퀴틸화 분석을 위한 완전한 프로토콜을 기술한다. UXT-V2는 NF-κB 신호전달에 필수적인 보조인자이며, 일단 이 단백질이 세포에서 녹다운되면, TNF-α-유도된 NF-κB 활성화(11)를 억제한다. 따라서, 폴리유비퀴틸화된 UXT-V2를 검출하기 위해, 프로테아좀 억제제 MG132는 프로테아좀 복합체15의 26S 서브유닛의 단백질 분해 활성을 차단하는 능력을 갖기 때문에 사용된다. 더욱이, 세포 추출물은 기질을 정제하기 위해 소규모 IP에 제출되고, 선택된 항체를 사용하여 WB에 의한 후속 검출을 위해 아가로스 수지에 고정화된 특이적 항체를 이용한다. 이 프로토콜은 세포 환경에서 기질 유비퀴틸화를 검증하는데 매우 유용하며, 또한 상이한 유형의 포유동물 세포 및 다른 E3 유비퀴틴-리가아제 복합체에 적응될 수 있다. 그러나, 시험관내 유비퀴틸화 분석을 통해 시험된 기질을 검증할 필요가 있는데, 이는 두 프로토콜 모두 진정한 기질의 확인과 관련하여 서로를 보완하기 때문이다.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 마이크로튜브</td><td>Axygen</td><td>PMI110-06A</td><td></td></tr><tr><td>100 mm TC 처리 배양 접시</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 튜브</td><td>Corning</td><td>430766</td><td></td></tr><tr><td>96웰 플레이트</td><td>Cralplast</td><td>655111</td><td></td></tr><tr><td>Agarose-anti-HA 비드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6779</td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 항체</td><td>Seracare</td><td>5220-0341</td><td>염소 항-마우스 IgG</td></tr><tr><td>안티 토끼 항체</td><td>Seracare</td><td>5220-0337</td><td>염소 항-토끼 IgG</td></tr><tr><td>안티-액틴 항체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3853</td><td>희석 사용: 1:2000</td></tr><tr><td>Anti-Fbxo7 항체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB1407251</td><td>희석 사용: 1:1000</td></tr><tr><td>Anti-HA 항체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3663</td><td>희석 사용: 1:1000</td></tr><tr><td>Anti-Myc 항체</td><td>Cell Signalling</td><td>2272</td><td>희석 사용: 1:1000</td></tr><tr><td>Bradford 시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6916-500ML</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647-100G</td><td>소 혈청 알부민</td></tr><tr><td>세포 인큐베이터</td><td>Nuaire</td><td>NU-4850</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td>500 x g 5분 동안</td></tr><tr><td>ChemiDoc</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>디지털 pH 측정기</td><td>Kasvi</td><td>K39-2014B</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' 의 변형된 독수리' s 매체</td><td>Corning</td><td>10-017-CRV</td><td>고포도</td></tr>당 <tr><td>태아 소 혈청</td><td>Gibco</td><td>F4135</td><td>여과액 사전 사용</td></tr><tr><td>HA 펩타이드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2149</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T 세포</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>KCl VWR</td><td>생명 과학</td><td>0365-500G</td><td></td></tr><tr><td>Kline rotator</td><td>Global Trade Technology</td><td>GT-2OIBD</td><td></td></tr><tr><td>MG-132</td><td>Boston Biochem</td><td>I-130</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5418R</td><td></td></tr><tr><td>Na3VO4 (Ortovanadato)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaF</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>니트로셀룰로오스 블로팅 멤브레인</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10600016 NP40 (IGEPAL CA-630)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8896-100ML</td><td></td></tr><tr><td>광학 현미경</td><td>OPTIKA 현미경</td><td>SN510768</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3</td><td>Invitrogen</td><td>V79020</td><td>포유류 표현용</td></tr><tr><td>pcDNA3-2xFlag-Fbxo7</td><td>&nbsp; Marcelo Dam&aacute 박사가 친절하게 기부했습니다. rio</td><td></td><td>태그 2xFlag(N-터미널). 제한 효소: EcoRI 및 XhoI</td></tr><tr><td>pcDNA3-2xFlag-Fbxo7-&Delta; F-박스</td><td>&nbsp; Marcelo Dam&aacute 박사가 친절하게 기부했습니다. rio</td><td></td><td>태그 2xFlag(N-터미널). 제한 효소: EcoRI 및 XhoI. &델타; 335-367</td></tr><tr><td>pcDNA3-UXTV2-HA&</td><td>nbsp; Marcelo Dam&aacute 박사가 친절하게 기부했습니다. rio</td><td></td><td>Tag HA(C 터미널). 제한 효소: EcoRI 및 XhoI</td></tr><tr><td>pCMV-6xHis-Myc-유비퀴틴</td><td>&nbsp; Marcelo Dam&aacute 박사가 친절하게 기부했습니다. rio</td><td></td><td>태그 6x-His-Myc(N-터미널). 제한 효소: EcoRI 및 KpnI</td></tr><tr><td>펜 연쇄상구균 글루타민 100x</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 10x</td><td>AccuGENE</td><td>51226</td><td>1x PBS를 얻으려면 10x PBS를 초순수</td></tr><tr><td>폴리에틸렌이민(PEI)</td>으로 희석하십시오.<td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-98-6</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>VWR Life Science</td><td>0860-50G</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일 SIGMAFAST</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>흔들 셰이커</td><td>Kasvi</td><td>19010005</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE 시스템</td><td>BioRad</td><td>165-8004</td><td></td></tr><tr><td>솔루션 균질화 Phoenix</td><td>Luferco</td><td>AP-22</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066-500G</td><td></td></tr><tr><td>트립신(TrypLe Express)</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td></td></tr><tr><td>웨스턴 블로팅 루미놀 시약</td><td>산타크루즈 생명공학</td><td>SC-2048</td><td></td></tr></tbody></table>

포유동물 세포 용해물에서 e3 유비퀴틴-리가아제에 의한 기질 유비퀴틸화의 평가

Evaluation of Substrate Ubiquitylation by E3 Ubiquitin-ligase in Mammalian Cell Lysates

유비퀴틸화는 진핵 세포에서 발생하는 번역 후 변형으로, 세포 생존, 증식 및 분화를 포함한 여러 생물학적 경로의 조절에 중요합니다. E1 (유비퀴틴 활성화 효소), E2 (유비퀴틴 접합 효소) 및 E3 (유비퀴틴 리가아제 효소)로 구성된 적어도 3 가지 효소의 캐스케이드 반응을 통해 기질에 유비퀴틴을 공유적으로 부착하는 가역적 인 과정입니다. E3 복합체는 기질 인식 및 유비퀴틸화에 중요한 역할을 한다. 여기서, 선택된 기질을 코딩하는 플라스미드, E3 유비퀴틴 리가아제, 및 태그된 유비퀴틴의 일시적 공동형질감염을 사용하여 포유동물 세포에서 기질 유비퀴틸화를 평가하기 위한 프로토콜이 기재되어 있다. 용해 전에, 형질감염된 세포는 기질 프로테아좀 분해를 피하기 위해 프로테아좀 억제제 MG132 (카르보벤즈옥시-류-류-류알)로 처리된다. 또한, 세포 추출물은 유비퀴틴 태그에 특이적인 항체를 사용하는 웨스턴 블롯팅(WB)에 의한 후속 검출을 위해 폴리유비퀴틸화된 기질을 정제하기 위해 소규모 면역침전(IP)에 제출된다. 따라서, 포유동물 세포에서 유비퀴틸화 분석을 위한 일관되고 복잡하지 않은 프로토콜이 과학자들이 특정 기질 및 E3 유비퀴틴 리가아제의 유비퀴틸화를 다루는 것을 돕기 위해 기술된다.

UXT (유비쿼터스하게 발현된 전사체)는 마우스와 심장, 뇌, 골격근, 태반, 췌장, 신장 및 간과 같은 인간 조직에서 유비쿼터스하게 발현된 단백질-폴딩 복합체를 형성하는 프리폴딘 유사 단백질이다18. UXT-V1 및 UXT-V2로 명명된 UXT의 두 스플라이싱 이소형이 별개의 기능과 세포하 위치를 수행하는 것으로 설명되었다. UXT-V1은 주로 세포질 및 미토콘드리아 내부에 국소화되며, TNF-α-유도된 아폽토시스 및 항바이러스 신호전달 형성19,20에 연루된다. 대부분의 연구는 주로 핵에 국소화되어 있으며 세포 증식 조절, 분화 및 염증 경로에 관여하는 다중 전사 인자의 보조 인자로 작용하는 UXT-V2에 중점을 두었습니다. UXT-V2는 NF-κB 강화(21)에서 필수적인 코액티베이터로서 작용하는 NF-κB 신호전달 경로에 관여한다. ...

우리는 포유동물 세포에서 특정 기질 및 E3 유비퀴틴 리가아제의 유비퀴틸화 검정을 위한 상세한 프로토콜을 제공한다. HEK293T 세포주는 단백질 과발현을 위해 사용되었고, 폴리유비퀴틸화된 기질은 면역침전에 의해 세포 용해물로부터 정제되고, SDS-PAGE에서 분해되었다. 면역블롯팅은 이러한 번역 후 변형을 시각화하기 위해 사용되었다.

포유동물 세포 용해물에서 E3 유비퀴틴-리가아제에 의한 기질 유비퀴틸화의 평가

Ubiquitylation is a post-translational modification which occurs in eukaryotic cells that is critical for several biological pathways' regulation, ...

이 프로토콜은 E3 리가아제에 의한 특정 기질의 유비퀴틸화를 평가할 수 있게 한다. 우리는 리가아제-기질 상호작용의 특성화가 세포에서의 그들의 기능을 이해하는 데 중요하다는 것을 알고 있다. 이 기술은 값 비싼 시약이나 정교한 장비를 필요로하지 않습니다.플라스미드 및 관심있는 유전자를 코딩하고, 세포 용해물을 사용한 면역 침전 분석법을 개발하고, 기질 유비퀴틸화를 검출하기위한 웨스턴 블롯이 필요합니다. 암 및 신경 장애와 같은 몇몇 인간 질환은 E3 리가아제의 조절 장애와 관련이 있다. 따라서, 특정 E3 리가아제에 의한 기질 유비퀴틸화의 확인은 이러한 질병을 치료하거나 진단하는데 도움이 될 수 있다.절차를 시연하는 것은 발렌타인 스파 놀 (Valentine Spagnol)이 할 것입니다. 시작하기 위해, HEK293T 세포주를 10% 태아 소 혈청 및 100 단위 페니실린, 100 마이크로그램 스트렙토마이신 및 밀리리터 L-글루타민 당 0.292 밀리그램으로 보충된 둘베코 변형된 이글스 배지에서 80 내지 90% 합류로 성장시킨다. 이어서, 이 배양물을 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소의 가습된 세포 배양 인큐베이터에서 인큐베이션한다.혈청학적 피펫을 사용하여 배양 접시로부터 배지를 흡인함으로써 세포를 계대시키고, 이를 멸균된 1X PBS 1밀리리터로 1회 세척한다. 다음으로, 트립신 에틸렌디아민테트라아세트산 용액 한 밀리리터를 첨가하여 세포를 분리하고, 섭씨 37도에서 5분간 배양한 후, 혈청학적 피펫을 사용하여 이들 세포를 두 밀리리터의 성장 배지에 재현탁시킨다. 세포 현탁액을 신선하고 깨끗한 15밀리리터 튜브로 옮기고 실온에서 5분 동안 500배 G에서 원심분리한다.이어서, 상청액을 부드럽게 제거하고, 세포 펠릿을 성장 배지의 세 밀리리터에 재현탁시켜 상하로 피펫팅하여 균질한 세포 현탁액을 얻었다. 이어서, 이 세포 현탁액 1밀리리터를 9밀리리터의 성장 배지를 함유하는 100밀리미터 TC 처리된 배양 접시에 옮긴다. 형질감염 전에, 세포가 오염으로부터 자유롭고 일시적인 형질감염에 대한 적절한 합류에 있는지 인증하십시오.각 형질감염 샘플에 대해, 보충 없이 Opti-MEM 1 환원 혈청 배지 100 마이크로리터에 각 플라스미드의 세 마이크로그램을 희석하고 용액을 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합함으로써 DNA-폴리에틸렌이민 복합체를 제조하였다. 다음으로, 실온에서 DNA-폴리에틸렌이민을 해동시키고 DNA의 한 마이크로그램 당 세 마이크로리터의 DNA-폴리에틸렌이민의 비율에 따라 용액에 첨가한다. 위아래로 피펫팅하여 용액을 균질화하십시오.이어서, DNA-폴리에틸렌이민 복합체의 형성을 허용하도록 실온에서 15분 동안 인큐베이션한다. DNA-폴리에틸렌이민 복합체의 총 부피를 세포 배양물이 들어있는 각 접시에 넣고 플레이트를 앞뒤로 흔들어 부드럽게 혼합합니다. 이어서, 이들 세포를 가습된 세포 배양 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 인큐베이션한다.인큐베이션 및 세포 용해 6시간 전에 배양한 후, 형질감염된 세포를 10-마이크로몰 프로테아좀 억제제 MG132로 처리하고 가습된 세포 배양 인큐베이터에서 세포를 인큐베이션한다. 다음으로, 혈청학적 피펫을 사용하여 각 배양 접시로부터 배지를 흡인하고, 세포를 1X PBS의 1밀리리터로 1회 세척한다. 이어서, 하나의 밀리리터 트립신을 첨가하여 세포를 분리하고, 섭씨 37도에서 5분 동안 디쉬를 인큐베이션한다.세포를 한 밀리리터의 성장 배지에 재현탁시키고 세포 현탁액을 신선하고 깨끗한 두 밀리리터 마이크로튜브로 옮기고 실온에서 5분 동안 500배 G에서 원심분리한다. 원심분리가 끝나면 조심스럽게 부어 상층액을 제거하고 프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일이 보충 된 얼음처럼 차가운 MP40 용해 완충액 200 마이크로 리터에 세포 펠릿을 부드럽게 재현탁하십시오. 그런 다음이 용액을 깨끗한 1.5 밀리리터 마이크로 튜브로 옮깁니다.이 세포 용해물을 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션하고, 인큐베이션한 후, 섭씨 4도에서 20분 동안 16, 900배 G에서 세포 용해물을 원심분리한다. 한편, 아가로스 항-HA 비드를 빙냉 MP40 용해 완충액으로 평형화시킨다. 각 샘플에 대해 15 마이크로리터의 아가로스 항-HA 비드를 사용하십시오.비드를 200 마이크로리터의 MP40 용해 완충액으로 세척하고, 이를 섭씨 4도에서 1분 동안 3, 000배 G의 마이크로 원심분리 튜브에서 펄싱한다. 다음으로, 피펫으로 상층액을 조심스럽게 흡인하고 버리고이 과정을 세 번 반복하십시오. 그 후, 사용할 때까지 구슬을 얼음 위에 평형으로 유지하십시오.세포 용해물을 원심분리한 후, 상층액을 회수하고 브래드포드법을 이용하여 전체 용해물 중의 단백질 함량을 정량화하여 면역침전을 실시한 각 시료가 동일한 양의 단백질을 제시하도록 한다. 필요한 부피의 세포 용해물을 네 시간 동안 평형화된 아가로스 항-HA 비드와 함께 인큐베이션하고, 섭씨 4도에서 회전하는 인큐베이터에서 부드럽게 회전하며, 이는 UXT-V2-HA가 아가로스 항-HA 비드에 결합할 수 있게 한다. 아가로스 항-HA 비드를 섭씨 4도에서 1분 동안 3, 000배 G의 마이크로원심분리 튜브에서 펄싱하여 수집한다.조심스럽게 상층액을 흡인하고 버리십시오. 빙냉 MP40 세포 용해 완충액으로 비드를 세 번, 얼음처럼 차가운 FLAG HA 완충액으로 두 번 씻으십시오. 최종 세척 후, 피펫을 사용하여 모든 상층액을 조심스럽게 제거하고, FLAG HA 완충액 상에 희석된 HA 펩티드의 밀리리터 당 300 마이크로그램으로 폴리유비퀴틸화 단백질을 용출시켰다.아가로스 항-HA 비드를 HA 펩티드와 함께 한 시간 동안 교반 진탕기 플랫폼에서 섭씨 네 도에서 인큐베이션한다. 다음으로, 비드를 섭씨 4도에서 2분 동안 3, 000배 G에서 스핀다운하고, 폴리유비퀴틴화 단백질을 함유하는 상청액을 조심스럽게 제거하였다. 필요한 경우 용리액을 영하 20도의 신선하고 깨끗한 마이크로 튜브에 보관하십시오.용리액과 세포 용해물을 10% 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 면역블롯팅으로 해결한다. 습식 이송 웨스턴 블롯팅을 수행하려면 젤을 여과지, 겔 멤브레인 여과지로 구성된 전사 샌드위치에 넣고 패드로 쿠션한 다음 지지 그리드로 함께 누릅니다. 그런 다음이 시스템을 스테인레스 스틸 또는 백금 와이어 전극 사이의 이송 버퍼로 채워진 탱크에 수직으로 놓습니다.전송은 습식 전달 버퍼의 150V에서 90 분 동안 발생합니다. 마지막으로, 항-myc 항체를 사용하여 면역블롯 막을 프로브한다. 세포에서 F-box 단백질 7에 의해 매개되는 UXT-V2-HA의 특이적 폴리유비퀴틸화는 기질에 접합된 myc-ub를 검출하는 항-myc 항체로 항-HA 면역침전으로부터 용리액을 프로빙한 후에 관찰되었다.폴리유비퀴틸화된 기질에 대한 항-myc의 특이성은 하나 및 두 개의 레인에서 가시화되었고, 여기서 폴리유비퀴틸화된 단백질의 도말은 세포가 UXT-V2-HA 플라스미드의 부재 하에 F-box 단백질 7 및 myc-ub로 공동형질감염되었을 때 검출되지 않았다. 추가적으로, 단백질 폴리유비퀴틴화에 상응하는 도말 없음은 myc-ub 플라스미드가 없는 F-box 단백질 7 및 UXT-V2-HA의 조합에서 가시화되었다. 활성 SCF를 조립할 수 없는 빈 벡터 야생형 F-박스 단백질 7 또는 F-box 단백질 7 돌연변이체가 UXT-V2-HA 및 myc-ub와 결합하여 형질도입되었을 때, 폴리유비퀴틸화된 UXT-V2의 강한 도말 신호는 야생형 F-박스 단백질 7에 대해서만 관찰되었으며, 이는 UXT-V2가 대조군과 비교하여 SCF F-박스 단백질 7 복합체 및 세포에 의해 폴리유비퀴틸화되었음을 시사한다.평형화된 비드를 사용한 세포 용해물의 인큐베이션 및 면역침전된 단백질의 용출을 포함하는 모노침전 단계는 이러한 프로토콜의 목적을 달성하기 위해 필수적이다. 이 절차 후에, E3 리가아제에 의한 기질 유비퀴틸화의 특이성을 확인하기 위해 시험관내 유비퀴틸화 분석이 수행되어야 한다.

evaluation-substrate-ubiquitylation-e3-ubiquitin-ligase-mammalian

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

Ubiquitination 세 효소의 집합으로 실시하는 핵심 posttranslational 수정합니다. 이 수정에 관여 유전자의 돌연변이가 여러 가지 인간의 질병와 관련된 있습니다. 여기, 우리는 교양 세포에 단백질 ubiquitination을 감지 프로토콜...

단백질 Ubiquitination의 감지

이 동영상은 순차 효소 캐스케이드를 사용하여 기질 단백질의 SUMOylation을 위한 in vitro 방법을 보여줍니다. 또한, 단백질의 SUMOylated 상태는 전기영동 및 면역블로팅 기술을 사용하여 식별됩니다.

SUMOylation Assay: 면역블로팅을 통해 기질 단백질의 SUMOylation 상태를 검출하는 In vitro 기술

유비퀴틴 ligases와 달리 몇 E3 스모 ligases가 확인 되었습니다. 이 수정 된 생체 외에서 SUMOylation 프로토콜 생체 외에서 재구성 분석 결과 의해 소설 스모 E3 ligases를 확인 할 수 있다.

생체 외에서 스모 E3 리가 활동 공부 SUMOylation 분석 결과

우리는 복잡한 생물학적 샘플에서 유비퀴틴화 된 단백질에서 유래 한 diGly 펩티드의 정제, 검출 및 식별방법을 제시합니다. 제시된 방법은 유비퀴티노메 분석의 깊이 수준에 대하여 공표된 방법을 재현가능하고 견고하며 능가합니다.

펩타이드 농축 및 질량 분광법에 의한 단백질 유비퀴틴화 부위 검출

유비퀴틴화는 세포 과정에서 중요한 역할을 하는 번역 후 수정이며, 듀비퀴틴화에 의해 긴밀하게 조정됩니다. 두 반응의 결함은 인간의 병리를 뒷받침합니다. 우리는 정제 된 구성 요소를 사용하여 시험관 내에서 유비퀴틴화 및 듀비퀴틴화 반응을 수행하기위한 프로토콜을 제공합니다.

체외 유비퀴틴화 및 뉴클레오소말 히스톤의 이중화 율법의 비퀴틴화 어설션

이 프로토콜은 치료 또는 표현형과 같은 특정 조건과 관련된 이러한 종류의 번역 후 수정 (PTM)의 변경을 식별하기 위해 유비퀴틴 (Ub) 및 유비퀴틴 -좋아요 (Ubls) 특정 프로테오옴을 확립하는 것을 목표로합니다.

유비퀴틴 및 유비퀴틴과 같은 종속 적 번역 후 수정 및 중대한 변경 식별 프로파일링

이 원고의 목표는 RING 형 E3 유비퀴틴 리가제의 포괄적 인 생화학 및 기능 적 연구에 대한 개요를 제시하는 것입니다. 상세한 프로토콜을 갖춘 이 다단계 파이프라인은 테스트된 단백질의 효소 활성을 검증하고 활성을 작동하도록 연결하는 방법을 보여줍니다.

시험관 내 링 타입 E3 유비퀴틴 리가제의 기능적 특성화

이 방법은 유비퀴틴 체인 토폴로지의 글로벌 변화에 대한 평가를 설명합니다. 평가는 질량 분광계 기지를 둔 표적 proteomics 접근의 응용에 의해 수행됩니다.

병렬 반응 모니터링에 의한 유비퀴틴 연쇄 분석

본 연구는 E3 유비퀴틴 리구아제 촉매 활성의 분석을 위한 체외 유비쿼터스 분석 프로토콜에 대한 상세한 제공. 재조합 단백질은 대장균 배양과 같은 원핵계를 사용하여 발현되었다.

시험관 내 E3 유비퀴틴 리가제 기능 분석

유비퀴틴화는 세포 내 단백질 기능의 중요한 조절자입니다. 여기서는 포유류 세포에서 기질 단백질 유비퀴틴화 수준을 검출하는 두 가지 세포 용해 방법을 설명하고, 유비퀴틴화 수준 분석에 미치는 효과를 비교합니다. HEK293T 세포 내 단백질 과발현은 일시적 형질전환에 의해 유도되었고, 유비퀴틴화된 단백질은 웨스턴 블롯 분석을 통해 검출되었습니다.

SMAD2/SMURF2를 모델로 삼은 포유류 세포 용해체에서의 유비퀴틴화 검출 비교 전략

이 프로토콜은 포유류 세포 용해액 또는 순수 유비퀴틴 효소 복합체를 이용해 폐렴 구균을 유비퀴틴화하는 방법을 설명하며, 이후 정제된 VCP/p97-UFD1-NPLOC4 단백질 복합체로 처리하여 박테리오리네이션 활성을 평가하여 유비퀴틴 의존성 면역 효과 연구를 가능하게 합니다.

시험관 내 박테리아 유비퀴틴화 재구성 및 VCP/p97 매개 제거

학습하세요 포유동물 세포 용해물에서 면역침전과 면역블로팅을 이용한 E3 유비퀴틴-리가아제에 의한 기질 유비퀴틸화 평가 방법을. 이 기술은 암과 신경계 질환 연구에 활용됩니다.

포유동물 세포 용해물에서 E3 유비퀴틴-리가아제에 의한 기질 유비퀴틸화의 평가

더 많은 동영상 탐색