Name: 부신 크로마핀 세포에서 융합 기공 역학의 세 가지 모드를 측정하는 공초점 현미경 검사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: 배우세요 공초점 현미경과 패치 클램프를 결합하여 소 부신 크로마핀 세포에서 융합 기공 역학을 시각화하는 방법을. 세 가지 융합 모드를 구분하고 신경전달물질 방출 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

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이 작업을 지원해 주신 NINDS 교내 연구 프로그램(ZIA NS003009-13 및 ZIA NS003105-08)에 감사드립니다.

<ol><li>Wu, L. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exocytosis+and+endocytosis%3A+modes%2C+functions%2C+and+coupling+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms.</a> Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).</li>
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<li>Jorgacevski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Munc18-1+tuning+of+vesicle+merger+and+fusion+pore+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Munc18-1 tuning of vesicle merger and fusion pore properties.</a> Journal of Neuroscience. 31 (24), 9055-9066 (2011).</li>
<li>Rituper, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+cholesterol+controls+exocytotic+fusion+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Vesicle cholesterol controls exocytotic fusion pore.</a> Cell Calcium. 101, 102503(2021).</li>
<li>Gucek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dominant+negative+SNARE+peptides+stabilize+the+fusion+pore+in+a+narrow%2C+release-unproductive+state%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Dominant negative SNARE peptides stabilize the fusion pore in a narrow, release-unproductive state.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3719-3731 (2016).</li>
<li>Grabner, C. P., Moser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+synaptic+vesicles+mediate+stimulated+exocytosis+from+cochlear+inner+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Individual synaptic vesicles mediate stimulated exocytosis from cochlear inner hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 12811-12816 (2018).</li>
<li>Wen, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+dynamics+provides+membrane+tension+to+merge+fusing+vesicles+into+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Actin dynamics provides membrane tension to merge fusing vesicles into the plasma membrane.</a> Nature Communications. 7, 12604(2016).</li>
<li>Shin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+Membrane+Pore+in+Live+Cells+Reveals+a+Dynamic-Pore+Theory+Governing+Fusion+and+Endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualization of Membrane Pore in Live Cells Reveals a Dynamic-Pore Theory Governing Fusion and Endocytosis.</a> Cell. 173 (4), 934-945 (2018).</li>
<li>Shin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+Shrinking+and+Enlargement+Play+Opposing+Roles+in+the+Release+of+Exocytotic+Contents%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Vesicle Shrinking and Enlargement Play Opposing Roles in the Release of Exocytotic Contents.</a> Cell Reports. 30 (2), 421-431 (2020).</li>
<li>Ge, L., Shin, W., Wu, L. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+sequential+compound+fusion+and+kiss-and-run+in+live+excitable+cells%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Visualizing sequential compound fusion and kiss-and-run in live excitable cells.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Zhang, Q., Li, Y., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+control+of+kiss-and-run+and+vesicular+reuse+probed+with+single+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The dynamic control of kiss-and-run and vesicular reuse probed with single nanoparticles.</a> Science. 323 (5920), 1448-1453 (2009).</li>
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<li>Androutsellis-Theotokis, A., Rubin de Celis, M. F., Ehrhart-Bornstein, M., Bornstein, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+features+between+chromaffin+and+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Common features between chromaffin and neural progenitor cells.</a> Molecular Psychiatry. 17 (4), 351(2012).</li>
<li>Bornstein, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromaffin+cells%3A+the+peripheral+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Chromaffin cells: the peripheral brain.</a> Molecular Psychiatry. 17 (4), 354-358 (2012).</li>
<li>Park, Y., Kim, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+plasticity+of+small+synaptic+vesicle+%28SSV%29+and+large+dense-core+vesicle+%28LDCV%29+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Signalling%22%5BJournal%5D)">Short-term plasticity of small synaptic vesicle (SSV) and large dense-core vesicle (LDCV) exocytosis.</a> Cellular Signalling. 21 (10), 1465-1470 (2009).</li>
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<li>Shin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preformed+Omega-profile+closure+and+kiss-and-run+mediate+endocytosis+and+diverse+endocytic+modes+in+neuroendocrine+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Preformed Omega-profile closure and kiss-and-run mediate endocytosis and diverse endocytic modes in neuroendocrine chromaffin cells.</a> Neuron. 109 (19), 3119-3134 (2021).</li>
<li>O'Connor, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+bovine+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Primary culture of bovine chromaffin cells.</a> Nature Protocols. 2 (5), 1248-1253 (2007).</li>
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<li>Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P., Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+vesicles+from+frog+neuromuscular+junctions+by+prolonged+tetanic+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Depletion of vesicles from frog neuromuscular junctions by prolonged tetanic stimulation.</a> Journal of Cell Biology. 54 (1), 30-38 (1972).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Fish, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+fluorescence+%28TIRF%29+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy.</a> Current Protocols in Cytometry. , Chapter 12 Unit12 18(2009).</li>
<li>Schmidt, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MINFLUX+nanometer-scale+3D+imaging+and+microsecond-range+tracking+on+a+common+fluorescence+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">MINFLUX nanometer-scale 3D imaging and microsecond-range tracking on a common fluorescence microscope.</a> Nature Communications. 12 (1), 1478(2021).</li>
</ol>

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

공초점 현미경 이미징 방법은 융합 기공 및 송신기 방출의 역학뿐만 아니라 소 부신 크로마핀 세포4,24에서 세 가지 융합 모드, 근접 융합, 체류 융합 및 수축 융합을 검출하기 위해 설명됩니다. 세포를 탈분극시키고 이에 의해 엑소사이토시스 및 엔도사이토시스를 불러일으키는 전기생리학적 방법이 기재되어 있다. 체계적인 공초점 이미지 처리는 융합 및 분열 사건에 대한 다양한 기공 행동 모드에 대한 정보를 제공합니다.
전체 세포 구성과 동일한 세포에서의 칼슘 전류 및 커패시턴스 변화의 동시 모니터링은 엑소- 및 엔도사이토시스에 대한 추가 정보를 제공하며, 이는 임의의 주어진 시간에 전체 세포 수준에서 기공 개방 및 폐쇄의 비율을 암시한다. 이들 방법은, 원칙적으로, 1차 배양 또는 ∼200-1,600 nm15의 소포를 함유하는 세포주에서 다...

막 융합은 시냅스 전달, 혈당 항상성, 면역 반응 및 바이러스 진입 1,2,3을 포함한 많은 생물학적 기능을 매개합니다. 원형질막에서 소낭 융합을 포함하는 외세포증은 신경 전달 물질과 호르몬을 방출하여 신경 네트워크 활동과 같은 많은 중요한 기능을 수행합니다. 퓨전은 수포 내용물을 방출하기 위해 기공을 열고, 그 후에 기공은 키스 앤 런 1,4라고 불리는 융합 소포를 회수하기 위해 닫힐 수 있습니다. 비가역적 및 가역적 융합 기공 개방 둘 모두는 단일 소포 융합의 융합 공극 전도도 기록과 결합된 셀 부착 커패시턴스 기록으로 측정될 수 있다.
이것은 종종 융합 소포의 평탄화까지 융합의 팽창을 포함하는 완전 붕괴 융합을 반영하는 것으로 해석되며, 융합 기공 개폐를 포함하는 키스 앤 런은 각각 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . 최근 크로마핀 세포에서의 공초점 및 자극 방출 고갈(STED) 영상 연구는 융합 기공 개폐(키스 앤 런(kiss-and-run, close-fusion이라고도 함), 오랜 시간 동안 열린 기공으로 Ω 형태를 유지하는 융합 기공 개구, 체류-융합(stay-fusion)이라 불리우며, 융합된 소포가 원형질막과 완전히 병합될 때까지 융합된 소포의 축소를 직접 관찰하였으며, 이는 원형질막과 융합된 소포를 병합하기 위한 완전 붕괴 융합을 대체한다4, 8,14,15,16,17.
뉴런에서, 융합 기공 개폐는 융합 기공보다 큰 소포에 미리 로딩된 양자점의 방출을 보여주는 이미징과 신경 말단의 방출면에서의 융합 기공 전도도 측정(5,18,19)으로 검출되었다. 부신 크로마핀 세포는 exo- 및 엔도사이토시스20,21의 연구를 위한 모델로서 널리 사용된다. 크로마핀 세포에는 큰 조밀 코어 소포가 포함되어 있지만 시냅스에는 작은 시냅스 소포가 포함되어 있지만 크로마핀 세포와 시냅스의 엑소 사이토시스 및 엔도 사이토시스 단백질은 10,11,12,20,21,22,23과 매우 유사합니다.
여기에서, 소 부신 크로마핀 세포에서 전기생리학과 결합된 공초점 이미징 방법을 이용하여 이들 세 가지 융합 모드를 측정하는 방법이 설명된다(도 1). 이 방법은 형광 거짓 신경 전달 물질 (FFN511)을 소포에 로딩하여 외세포증을 검출하는 것을 포함합니다. 합착 용액에 Atto 655(A655)를 첨가하여 융해-생성된 Ω형 프로파일을 채우고, 원형질막 8,15,24에서 PtdIns(4,5)P2에 결합하는 포스포리파제 C δ(PH)의 PH 도메인으로 원형질막의 표지를 채운다. 융합 기공 역학은 상이한 형광 강도의 변화를 통해 검출될 수 있다. 크로마핀 세포에 대해 기술되었지만, 여기에 기술된 이 방법의 원리는 크로마핀 세포를 훨씬 넘어서는 많은 분비 세포에 널리 적용될 수 있다.

<table><tbody><tr><td>아데노신 5'-트리포스페이트 마그네슘 염</td><td>Sigma</td><td>A9187-500MG</td><td>ATP 내부 용액 제조용</td></tr><tr><td>Atto 655</td><td>ATTO-TEC GmbH</td><td>AD 655-21</td><td>Atto 염료 라벨 수조 용액</td></tr><tr><td>기본 뉴런용 Nucleofector</td><td>Lonza</td><td>VSPI-1003</td><td>Electroporation transfection buffer along with with kit</td></tr><tr><td>Boroscilicate capillary glass pipette</td><td>Warner 악기</td><td>64-0795</td><td>필라멘트가있는 표준 벽 OD = 2.0 mm ID = 1.16 mm 길이 = 7.5 cm</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마</td><td>A2153-50G</td><td>글 랜드 소화 용 시약</td></tr><tr><td>염화칼슘 2 M</td><td>품질 생물학</td><td>351-130-721</td><td>수조 용액 준비용 시</td></tr><tr><td>약 세포 스트레이너, 100 &micro; m</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td>크로마핀 세포 현탁액 여과용 재료</td></tr><tr><td>수산화세슘 용액</td><td>시그마</td><td>232041</td><td>내부 용액 및 Cs-글루타메이트/Cs-EGTA 원료 완충액 제조용 시약</td></tr><tr><td>콜라겐분해효소 P</td><td>시그마</td><td>11213873001</td><td>글랜드 소화용 효소</td></tr><tr><td>커버슬립</td><td>호중생체</td><td>GG-14-라미닌</td><td>GG-14-라미닌, 14mm 직경 #1 두께 60개 라미닌 코팅 된 독일 커버 슬립</td></tr><tr><td>D-(+) - 포도당</td><td>시그마</td><td>G8270-1KG</td><td>로크 제조용 시약 ' s 용액 및 수조 용액</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11885092</td><td>배양 배지 준비를 위한 시약</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>324626-25GM</td><td>Cs-EGTA 배양 용액 준비를 위한 저장 버퍼</td></tr><tr><td>전기천공법 및 Nucleofector</td><td>Amaxa Biosystems</td><td>Nucleofector II</td><td>플라스미드를 세포에 Transfection</td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10082147</td><td>배양 배지 제조용 시약</td></tr><tr><td>FFN511</td><td>Abcam</td><td>ab120331</td><td>소포 라벨을 붙이는 형광 거짓 신경전달물질</td></tr><tr><td>구아노신 5'-트리포스페이트 나트륨 염 수화물</td><td>시그마</td><td>G8877-250MG</td><td>내부 용액 제조용 GTP</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375-500G</td><td>Locke 제조용 시약 ' </td></tr><tr><td>Igor pro</td><td>WaveMetrics</td>, <td>패치 클램프 분석 및 이미징 데이터 프리젠테이션을 위한 Igor</td><td>pro</td> 소프트웨어</tr>, <tr><td>Leica Application Suite X 소프트웨어</td>, <td>Leica</td><td>LAS X 소프트웨어</td>, <td>이미징 데이터 수집 및 분석을 위한 컨포칼 소프트웨어</td></tr><tr><td>, Leica TCS SP5 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경,</td><td>라이카</td><td>Leica TCS SP5</td>, <td>이미징 데이터 수집</td></tr><tr><td>을 위한 컨포칼 현미경L-글루탐산</td><td>Sigma</td><td>49449-100G</td><td>수조 용액 제조용 Cs-글루타메이트 저장 완충액</td></tr><tr><td>락인 증폭기 Heka</td><td></td><td>정전</td><td>용량 기록용 소프트웨어</td></tr><tr><td>염화마그네슘 1 M</td><td>Quality Biological</td><td>351-033-721EA</td><td>내부 용액 및 수조 용액 제조용 시약</td></tr><tr><td>Metallized Hemacytometer Hausser Bright-Line</td><td>Hausser Scientific</td><td>3120</td><td>카운팅 챔버</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td>폴란드어 피펫으로 기가 옴 씰의 형성 및 안정성 향상</td></tr><tr><td>Millex-GP 주사기 필터 장치, 0.22 &마이크로; m</td><td>Millipore</td><td>SLGPR33RB</td><td>땀샘 세척 및 소화 용 재료</td></tr><tr><td>mng (mNeonGreen)</td> <td>대립 유전자 생명 공학</td><td>ABP-FP-MNEONSB</td><td>PH-MNeonGreen 구조</td></tr><tr><td>용 템플릿 나일론 메쉬 필터링 스크린 100 미크론</td><td>EIKO 필터링 co</td><td>03-100 / 32</td><td>수질 서스펜션 필터링 용 재료</td></tr><tr><td>패치 클램프 EPC-10</td><td>Heka</td><td>EPC-10</td><td>증폭기 패치 클램프 데이터 컬렉션</td></tr><tr><td>PH-EGFP</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #51407</td><td>PH-m용 백본NeonGreen 구조</td></tr><tr><td>피펫 풀러</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td>패치 클램프 기록용 피펫 제조</td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>시그마</td><td>P5404-500G</td><td>Locke 제조용 시약 ' s 솔루션 및 수조 솔루션</td></tr><tr><td>Pulse 소프트웨어</td><td>패치 클램프 데이터 수집을 위한</td><td>Heka</td><td>Pulse</td> 소프트웨어</tr><tr><td>녹음 챔버</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1943/QR-40LP</td><td>커버슬립 챔버, 라이브 셀에 패치 클램프 피펫 적용</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Sigma</td><td>S7653-1KG</td><td>Locke 준비를 위한 시약 ' s 용액, 수조 용액 및 내부 용액</td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>시그마</td><td>S5881-500G</td><td>로크 제조용 시약 s 용액</td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성</td><td>시그마</td><td>S0876-500G</td><td>로크 제조용 시약 s 용액</td></tr><tr><td>인산나트륨 일염기성</td><td>시그마</td><td>S8282-500G</td><td>로크 제조용 시약 s 용액</td></tr><tr><td>교반 열판</td><td>Barnsted/Thermolyne</td><td>유형 10100</td><td>왁스 주사기로 피펫 코팅용 히터</td></tr><tr><td>, 30mL</td><td>Becton Dickinson</td><td>302832</td><td>땀샘 세척 및 소화용 재료</td></tr><tr><td>Tetraethylammonium chloride</td><td>Sigma</td><td>T2265-100G</td><td>TEA 수조 용액 준비용</td></tr><tr><td>TEA 트립신 억제제</td><td>Sigma</td><td>T9253-5G</td><td>샘 소화용 시약</td></tr><tr><td>F형 침수 액체</td><td>라이카</td><td>195371-10-9</td><td>라이카 컨포칼 마운팅 오일</td></tr></tbody></table>

부신 크로마핀 세포에서 융합 기공 역학의 세 가지 모드를 측정하는 공초점 현미경 검사

Confocal Microscopy to Measure Three Modes of Fusion Pore Dynamics in Adrenal Chromaffin Cells

동적 융합 공극 개방 및 폐쇄는 엑소사이토시스 및 엔도사이토시스를 매개하고 이들의 동역학을 결정한다. 여기에서, 공초점 현미경이 일차 배양 소 부신 크로마핀 세포에서 세 가지 융합 모드를 검출하기 위해 패치-클램프 기록과 함께 어떻게 사용되었는지를 상세히 입증한다. 세 가지 융합 모드에는 1) 융합 기공 개폐 및 폐쇄를 포함하는 근접 융합 (키스 앤 런이라고도 함), 2) 융합 기공 개방 및 개방 된 기공 유지를 포함하는 체류 융합, 3) 원형질막에서 완전히 병합 될 때까지 융합 생성 된 Ω 형상 프로파일의 수축을 포함하는 수축 융합이 포함됩니다.
이들 융합 모드를 검출하기 위해, 원형질막은 포스포리파제 C δ(PH-mNG)의 PH 도메인과 부착된 mNeonGreen을 과발현시킴으로써 표지하였고, 이는 원형질막의 시토졸 대향 전단지에서 포스파티딜이노시톨-4,5-비스포스페이트(PtdIns(4,5)P2)에 결합하고; 수포 함량 방출을 검출하기 위해 형광 거짓 신경전달물질 FFN511로 로딩된 소포; 및 Atto 655를 융합 기공 폐쇄를 검출하기 위해 욕조 용액에 포함시켰다. 이 세 개의 형광 프로브를 라이브 크로마핀 세포에서 프레임당 ~20-90ms로 동시에 이미징하여 융합 기공 개방, 함량 방출, 융합 기공 폐쇄 및 융합 소포 크기 변화를 검출하였다. 분석 방법은 이러한 형광 측정으로부터 세 가지 융합 모드를 구별하기 위해 설명된다. 여기에 기술된 방법은 원칙적으로 크로마핀 세포를 넘어 많은 분비 세포에 적용할 수 있다.

도 1 및 도 2에 도시된 실험 절차에 따라, 소 부신으로부터 크로마핀 세포를 PH-mNG로 형질감염시켜 원형질막을 표지하였다; A655를 융합 기공 폐쇄를 검출하기 위해 욕조 용액에 첨가하였고; 형광 거짓 신경전달물질 FFN511을 방출의 검출을 위해 소포에 로딩하였다. 다음으로, FFN511, PH-mNG 및 A655의 XY 평면 공초점 타임랩스 이미징을 세포 바닥에서 20-90 ms마다 수행하였다(Z-초점면∼100-200 nm 세포막 위). 전체 세포 패치-클램프 기록 및 -80 mV에서 +10 mV까지의 1s 탈분극의 적용은 엑소- 및 엔도사이토시스를 유발하기 위해 수행되었다 (도 3A-C). 이러한 탈분극은 내측 칼슘 전류, 엑소사이토시스를 나타내는 커패시턴스 점프, 및 엔도사이토시스를 나타내는 점프 ...

이 프로토콜은 소 부신 크로마핀 세포에서 세 가지 융합 모드를 검출하기 위한 공초점 이미징 기술을 기술한다. 이러한 융합 모드에는 1) 융합 기공 개폐 및 폐쇄를 포함하는 근접 융합 (키스 앤 런이라고도 함), 2) 융합 기공 개방 및 개방 된 기공 유지를 포함하는 체류 융합, 3) 융합 된 소낭 수축을 포함하는 수축 융합이 포함됩니다.

Dynamic fusion pore opening and closure mediate exocytosis and endocytosis and determine their kinetics. Here, it is demonstrated in detail how confocal ...

막 융합은 많은 생물학적 기능을 매개한다. 이 프로토콜은 융합 기공 개방 및 송신기 방출 역학을 감지하고 세 가지 융합 모드, 즉 근접 융합, 융합 유지 및 수축 융합을 구별하는 방법을 설명합니다. 공초점 현미경과 패치 클램프 기록의 조합은 융합 기공 개방 및 폐쇄의 시각화 및 동역학의 결정을 용이하게합니다.크로마핀 세포에 대해 기술되었지만, 여기에 기술된 방법의 원리는 크로마핀 세포를 훨씬 넘어서는 많은 분비 세포에 널리 적용될 수 있다. 이 방법의 성공적인 구현은 건강한 일차 크로마핀 세포 배양, 충분한 플라스미드 형질감염 효율 및 높은 전기생리학적 기록 성공률을 생성하는 것과 같은 몇 가지 일반적인 단계에 의존한다. 표면에 상처 나 출혈이없는 세 개의 손상되지 않은 땀샘을 선택하고 가위로 지방 조직을 제거하십시오.피가 나오지 않을 때까지 로크의 용액으로 관류하여 땀샘을 씻으십시오. 소화를 위해 땀샘이 부풀어 오르기 시작할 때까지 0.22 마이크로 미터 필터가 부착 된 30 밀리미터 주사기를 사용하여 부신 정맥을 통해 효소 용액을 주입하십시오. 그런 다음 땀샘을 섭씨 37도에서 10 분 동안 그대로 두십시오.다시 주사하고 땀샘을 섭씨 37도에서 10 분 동안 그대로 두십시오. 소화 후, 땀샘을 부신 정맥에서 다른 쪽 끝으로 세로 자르고 가위로 선을 펼치십시오. 흰색 수질을 조각으로 묶어서 로크의 용액이 들어있는 10 센티미터 페트리 접시에 넣으십시오.가위로 수질을 자르고 다듬습니다. 수질 현탁액을 80 ~ 100 마이크로미터 나일론 메쉬로 비이커에 걸러냅니다. 여액을 50 밀리리터 원뿔형 튜브로 옮기고 48 x g 실온에서 3 분 동안 원심분리하여 세 가지 감속으로 삼십시.원심분리 후, 상층액을 제거하고 피펫팅에 의해 로크의 용액으로 세포 펠릿을 재현탁시킨다. 세포 현탁액을 80 내지 100 마이크로미터 스트레이너로 여과하고, 감속 세 개로 3분 동안 48 x g 실온에서 원심분리한다. 상청액을 제거하고 세포 펠릿을 30 밀리리터의 배양 배지로 재현탁시켰다.혈구계 계수 챔버를 사용하여 세포 번호를 결정하십시오. 2, 800, 000 세포를 15 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 세 개의 감속과 함께 두 분 동안 48 x g에서 원심분리하여 세포를 펠릿화한다.제조업체가 제공 한 100 마이크로 리터의 transection 버퍼를 세포 펠렛에 첨가하십시오. 이어서, 두 마이크로그램의 PH-mNG 플라스미드를 첨가한다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리는 공촛점 현미경을 검색 레이저를 사용하여 살아있는 세포에 느리게 fluxes에서 신속하게 (마이크로초) 칼슘 이벤트를 분리하는 방법을 제시한다. 방법은 세포에 수백 픽셀의 기록 선 검사에 의한 칼슘 지표의 형광 강도 변화를 측정합니다. 히스토그램 분석은 우리가 다른 칼슘 fluxes의 시간 스케일을 분리 할 수​​ 있습니다.

Cardiomyocytes의 빠른 칼슘 Fluxes 측정

Mitochondrial 융합은 시간이 지남에 mitochondrial 네트워크 photoconverted 매트릭스 타겟 GFP의 평균 추적에 의해 측정되었다. 지금까지 하나의 세포는 한 번에 한 시간 동안 운동 분석을 받다 수 있습니다. 우리는 동시에이를 통해 데이터 수집 과정을 속도, 여러 개의 세포를 측정하는 방법을 제시한다.

병렬 공촛점 현미경을 사용하여 여러 세포의 운동 데이터를 취득 빠르고 높은 해상도, mtPA-GFP 기반 Mitochondrial 퓨전 분석

우리는 단일 세포의 세 차원 공 촛점 형광에서 가져 정의되지 않은 형태의 형태학의 변화를 측정하기 Imaris 신경 과학, ImarisXT 및 MATLAB을 사용하는 소프트웨어 플랫폼을 개발했습니다. 이 새로운 접근 방식은 수용체 활성화에 따라 세포 모양의 변화를 수량화하는 데 사용되므로 약물 발견을위한 가능한 추가 도구를 나타냅니다 할 수 있습니다.

3 차원 형광 이미지에서 세포 형태학의 변경 사항 단정 지을 분석 도구

우리는 생리 학적 및 병리학 관련 자극에 포상 세포 칼슘 신호와 세포의 손상을 검사의 목적을 위해 마우스에서 마우스의 췌장 포상 세포를 제조하는 재생 방법을 설명합니다. 이러한 세포의 아데노 바이러스 감염 방법도 제공됩니다.

칼슘 이미징의 목적, 세포 상해 측정 및 아데노 바이러스 감염 췌장 포상 세포의 준비

편광 기반의 전반사 형광 현미경 (pTIRFM)은 세포막 역학의 실시간 감지를 할 수 있습니다. 이 문서는 규제 세포 외 유출 동안 막 리모델링의 연구 pTIRFM의 구현을 설명합니다. 기술은 직접적으로 또는 간접적으로 막 형상의 변화를 수반 세포 생물학의 다른 프로세스에 일반화이다.

pTIRFM와 이미징 플라즈마 막 변형

세포외이입 후, 융합된 원형질막은 세포내이입(endocytosis)으로 알려진 과정을 통해 회수됩니다. 이 메커니즘은 다음 방출을 위해 새로운 시냅스 소포를 형성합니다. 개별 내포성 이벤트는 마우스 부신 크로마핀 세포에서 세포 부착 커패시턴스 기록을 사용하여 캡처되고 분석됩니다.

마우스 부신하는 chromaffin 세포에서 세포 부착 된 정전 용량 측정을위한 방법

이 논문은 synaptobrevin2-pHluorin 구조체 및 전반사 형광 현미경을 사용하여 신경모세포종 세포의 신경전달물질 소포 역학을 조사하는 방법을 제공합니다. 이미지 처리 및 데이터 분석을 위해 개발된 전략도 보고됩니다.

TIRFM과 pH 민감성 GFP - 프로브는 SH-SY5Y 신경 모세포종 세포에서 신경 전달 물질 소포 역학을 평가하기 : 세포 이미징 및 데이터 분석

여기에서 우리는 안지오텐신 II 치료에 의해 시작 엔도 시토 시스 동안 녹색 형광 단백질 태그 안지오텐신 형 1A 수용체를 발현하는 이미지 세포에 대한 프로토콜을 제시한다. 이 기술은 시간이 지남에 따라 입체적 수용체 리소좀의 공동 현지화를 분석하는 소프트웨어를 이용하여 다음 라벨링 제 형광 마커 리소좀 등을 포함한다.

공 초점 현미경을 사용하여 트랜 인간 배아 신장 세포의 라이브 셀 이미징 및 3D 분석 안지오텐신 수용체의 유형 (1A)의 인신 매매

여기 이미지 칼슘 murine neuromuscular 접속점에 개별 셀 종류의 인구에 있는 신호 프로토콜 선물이.

전 비보 마우스 다이어 프 램의 같은 시 냅 스에서 신호 세포 특정 칼슘의 이미징

이러한 프로토콜은 면역학적 시냅스 형성및 면역학적 시냅스를 향한 후속 편광 분비 트래픽을 모두 이미지화한다. 세포 접합체는 초항원 펄스 라지 세포 (항원 제시 세포역할을 함)와 Jurkat 클론 (이펙터 도우미 T 림프구로 작용)사이에 형성되었습니다.

인간 면역학적 시냅스 이미징

Fónster 공명 에너지 전송 (FRET) 기반 센서의 내재 된 낮은 신호 대 잡음 비율 (SNR)으로 인해, 특히 세 공간 차원에서 cAMP 신호의 측정이 도전하고있다. 여기서는 3개의 공간 차원에서 cAMP 분포를 측정할 수 있는 하이퍼스펙트럼 FRET 이미징 및 분석 방법론을 설명합니다.

4차원(x, y, z 및 λ) 하이퍼스펙트럼 FRET 이미징 및 분석을 사용하여 살아있는 세포에서 3차원 cAMP 분포 측정

배우세요 공초점 현미경과 패치 클램프를 결합하여 소 부신 크로마핀 세포에서 융합 기공 역학을 시각화하는 방법을. 세 가지 융합 모드를 구분하고 신경전달물질 방출 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

부신 크로마핀 세포에서 융합 기공 역학의 세 가지 모드를 측정하는 공초점 현미경 검사

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