Name: 생리학적 조건에서 세포하막 리모델링을 조사하기 위해 마우스 피부의 호중구 이동을 이미징합니다. (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: 배우세요 마우스 피부에서 호중구 이동 시 세포막 리모델링을 실시간으로 관찰하는 생체 내 미세현미경 기법을. 이 방법은 면역세포 역할과 조직 상호작용을 연구하는 데 활용됩니다.

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이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health), 국립암연구소(National Cancer Institute), 암연구센터(Center for Cancer Research)의 교내 연구 프로그램의 지원을 받았습니다.

<ol><li>Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cell migration.</a> Comprehensive Physiology. 2 (4), 2369-2392 (2012).</li>
<li>Oudin, M. J., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+and+chemical+gradients+in+the+tumor+microenvironment+regulate+tumor+cell+invasion%2C+migration%2C+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Symposia+on+Quantitative+Biology%22%5BJournal%5D)">Physical and chemical gradients in the tumor microenvironment regulate tumor cell invasion, migration, and metastasis.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 81, 189-205 (2016).</li>
<li>Devreotes, P., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+networks+that+regulate+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Signaling networks that regulate cell migration.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), 005959(2015).</li>
<li>Alexandrova, A. Y., Chikina, A. S., Svitkina, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+cytoskeleton+in+mesenchymal-to-amoeboid+transition+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Actin cytoskeleton in mesenchymal-to-amoeboid transition of cancer cells.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 356, 197-256 (2020).</li>
<li>Masedunskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Bioarchitecture%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy.</a> Bioarchitecture. 2 (5), 143-157 (2012).</li>
<li>Wagner, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWagner%2C+R+%22Explanatory+panels+on+physiology+and+development+history+1839%22">Explanatory panels on physiology and development history 1839</a>. , Leopold Voss. Leipzig, Germany. (1839).</li>
<li>Yaniv, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+lymphatic+development+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Live imaging of lymphatic development in the zebrafish.</a> Nature Medicine. 12 (6), 711-716 (2006).</li>
<li>Vinegoni, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesoscopic+fluorescence+tomography+for+in-vivo+imaging+of+developing+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mesoscopic fluorescence tomography for in-vivo imaging of developing Drosophila.</a> Journal of Visualized Experiments. (30), e1510(2009).</li>
<li>Sack, F. -U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+of+pulmonary+microcirculation+after+single+lung+transplantation+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy of pulmonary microcirculation after single lung transplantation in pigs.</a> Transplantation Proceedings. 38 (3), 737-740 (2006).</li>
<li>Rehberg, M., Krombach, F., Pohl, U., Dietzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+3D+visualization+of+cellular+and+tissue+structures+in+intact+muscle+with+second+and+third+harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Label-free 3D visualization of cellular and tissue structures in intact muscle with second and third harmonic generation microscopy.</a> PloS One. 6 (11), 28237(2011).</li>
<li>Weigelin, B., Bakker, G. -J., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+third+harmonic+generation+microscopy+of+collective+melanoma+cell+invasion%3A+Principles+of+interface+guidance+and+microvesicle+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Intravital%22%5BJournal%5D)">Intravital third harmonic generation microscopy of collective melanoma cell invasion: Principles of interface guidance and microvesicle dynamics.</a> Intravital. 1, 32-43 (2012).</li>
<li>Poole, J. J. A., Mostaço-Guidolin, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+microscopy+and+the+extracellular+matrix+structure%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Optical microscopy and the extracellular matrix structure: A review.</a> Cells. 10 (7), 1760(2021).</li>
<li>Weigelin, B., Bakker, G. -J., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Third+harmonic+generation+microscopy+of+cells+and+tissue+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Third harmonic generation microscopy of cells and tissue organization.</a> Journal of Cell Science. 129 (2), 245-255 (2016).</li>
<li>Ebrahim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+polyhedral+actomyosin+lattices+remodel+micron-scale+curved+membranes+during+exocytosis+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic polyhedral actomyosin lattices remodel micron-scale curved membranes during exocytosis in live mice.</a> Nature Cell Biology. 21 (8), 933-939 (2019).</li>
<li>Shitara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdc42+negatively+regulates+endocytosis+during+apical+membrane+maintenance+in+live+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Cdc42 negatively regulates endocytosis during apical membrane maintenance in live animals.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (3), 324-332 (2019).</li>
<li>Masedunskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+the+actomyosin+complex+in+regulated+exocytosis+revealed+by+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13552-13557 (2011).</li>
<li>Subramanian, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+LTB4-BLT1+axis+regulates+actomyosin+and+%CE%B22-integrin+dynamics+during+neutrophil+extravasation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The LTB4-BLT1 axis regulates actomyosin and β2-integrin dynamics during neutrophil extravasation.</a> The Journal of Cell Biology. 219 (10), 201910215(2020).</li>
<li>Yan, S. L. S., Hwang, I. -Y., Kamenyeva, O., Kehrl, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+F-Actin+filament+organization+during+lymphocyte+transendothelial+and+interstitial+migration+revealed+by+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">In vivo F-Actin filament organization during lymphocyte transendothelial and interstitial migration revealed by intravital microscopy.</a> iScience. 16, 283-297 (2019).</li>
<li>Porat-Shliom, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+tissue-wide+synchronization+of+mitochondrial+metabolic+oscillations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">In vivo tissue-wide synchronization of mitochondrial metabolic oscillations.</a> Cell Reports. 9 (2), 514-521 (2014).</li>
<li>Takihara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+axonal+transport+of+mitochondria+in+the+diseased+and+aged+mammalian+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of axonal transport of mitochondria in the diseased and aged mammalian CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10515-10520 (2015).</li>
<li>Calvo-Rodriguez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+mitochondrial+calcium+levels+associated+with+neuronal+death+in+a+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Increased mitochondrial calcium levels associated with neuronal death in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Nature Communications. 11, 2146(2020).</li>
<li>Lämmermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+swarms+require+LTB4+and+integrins+at+sites+of+cell+death+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo.</a> Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).</li>
<li>Li, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+multiphoton+imaging+of+immune+responses+in+the+mouse+ear+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Intravital multiphoton imaging of immune responses in the mouse ear skin.</a> Nature Protocols. 7 (2), 221-234 (2012).</li>
<li>Swamydas, M., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+purification+and+labeling+of+mouse+bone+marrow+neutrophils+for+functional+studies+and+adoptive+transfer+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3AJoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (77), e50586(2013).</li>
<li>Rose, S., Misharin, A., Perlman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+Ly6C%2FLy6G-based+strategy+to+analyze+the+mouse+splenic+myeloid+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A%3A+The+Journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">A novel Ly6C/Ly6G-based strategy to analyze the mouse splenic myeloid compartment.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81 (4), 343-350 (2012).</li>
<li>Lakschevitz, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+neutrophil+surface+marker+changes+in+health+and+inflammation+using+high-throughput+screening+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of neutrophil surface marker changes in health and inflammation using high-throughput screening flow cytometry.</a> Experimental Cell Research. 342 (2), 200-209 (2016).</li>
<li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+Isolation+Protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3AJoVE%22%5BJournal%5D)">Neutrophil Isolation Protocol.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (17), e745(2008).</li>
<li>MATLAB - Bio-Formats 6.1.0 documentation. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://docs.openmicroscopy.org/bio-formats/6.1.0/users/matlab/index.html">https://docs.openmicroscopy.org/bio-formats/6.1.0/users/matlab/index.html</a> (2022).</li>
<li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Threshold+selection+method+from+gray-level+histograms%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Systems%2C+Man%2C+and+Cybernetics%22%5BJournal%5D)">A Threshold selection method from gray-level histograms.</a> IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9, 62-66 (1979).</li>
<li>Crocker, J. C., Grier, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+digital+video+microscopy+for+colloidal+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Methods of digital video microscopy for colloidal studies.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 179, 298-310 (1996).</li>
<li>Xu, C., Prince, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snakes%2C+shapes%2C+and+gradient+vector+flow%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Image+Processing%3A+A+Publication+of+the+IEEE+Signal+Processing+Society%22%5BJournal%5D)">Snakes, shapes, and gradient vector flow.</a> IEEE Transactions on Image Processing: A Publication of the IEEE Signal Processing Society. 7 (3), 359-369 (1998).</li>
<li>Driscoll, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+image+analysis+of+nuclear+shape%3A+what+can+we+learn+from+a+prematurely+aged+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">Automated image analysis of nuclear shape: what can we learn from a prematurely aged cell.</a> Aging. 4 (2), 119-132 (2012).</li>
<li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li>
<li>Tauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+and+risks+of+multiphoton+microscopy+in+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">Advantages and risks of multiphoton microscopy in physiology.</a> Experimental Physiology. 87 (6), 709-714 (2002).</li>
<li>Débarre, D., Olivier, N., Supatto, W., Beaurepaire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitigating+phototoxicity+during+multiphoton+microscopy+of+live+Drosophila+embryos+in+the+1.0-1.2+%C2%B5m+wavelength+range%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Mitigating phototoxicity during multiphoton microscopy of live Drosophila embryos in the 1.0-1.2 µm wavelength range.</a> PloS One. 9 (8), 104250(2014).</li>
<li>Masedunskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy%3A+a+practical+guide+on+imaging+intracellular+structures+in+live+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Bioarchitecture%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy: a practical guide on imaging intracellular structures in live animals.</a> Bioarchitecture. 2 (5), 143-157 (2012).</li>
<li>Ng, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+neutrophil+response+to+sterile+tissue+injury+in+mouse+dermis+reveals+a+three-phase+cascade+of+events%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 131 (10), 2058-2068 (2011).</li>
<li>Wu, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanoregulin+regulates+a+shedding+mechanism+that+drives+melanosome+transfer+from+melanocytes+to+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Melanoregulin regulates a shedding mechanism that drives melanosome transfer from melanocytes to keratinocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 2101-2109 (2012).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없음을 선언합니다.

세포 이동 및 막 리모델링 분야에서 수십 년 동안 발전했음에도 불구하고 살아있는 동물의 세포 내 특징을 시각화하기 위해 IVM을 사용한 연구는 거의 없습니다. 이 프로토콜에 설명된 절차는 살아있는 동물의 호중구 이동, 특히 이 과정 중 원형질막 리모델링에 대한 새로운 통찰력을 얻을 수 있는 강력한 도구를 제공합니다. 이 접근법은 조직 미세환경의 고유한 복잡성을 고려하여 생리학적 조건에서 호중구 이동을 조사할 수 있게 합니다. 실제로, MPM을 사용하면 선택된 형광 마커를 발현하는 마우스 균주, 외인성 조직 라벨링, 내인성 형광의 여기 및 SHG 또는 THG12,13을 통해 생성된 신호의 조합을 사용하여 숙주 조직 내의 여러 기능을 시각화할 수 있습니다.
이 절차에서 고려해야 할 한 가지 잠재적인 문제는 광손상입니다. MPM이 일반적으로 광표백 및 광독성과 관련하여 컨포칼 현미경보다 안전하지만, 살아있는 조직을 이미징할 때 주의를 기울여야 한다34. 광독성은 작고 밝은 반점에서 손상된 조직의 더 넓은 영역에 이르기까지 다양한 이미징 아티팩트를 생성하거나 다양한 세포 내 경로를 억제/자극함으로써 결과를 크게 방해할 수 있습니다. 광독성을 방지하기 위해 레이저 출력을 최소한으로 유지해야 하며 생리적 조건(예: 혈류 측정, 산화 스트레스 프로브)이 유지되는지 확인할 수 있도록 적절한 제어를 설계해야 합니다35,36. 더욱이, 피부와 관련된 이 특정 절차에서는 어두운 코팅 동물에 존재하는 멜라닌이 광독성에 더 민감하기 때문에 알비노 균주가 적극 권장됩니다 36,37,38.
이 절차의 주요 제한 사항 중 하나는 사용된 현미경 시스템과 호중구의 특성입니다. MPM을 사용하면 다른 광학 현미경 기술(예: 공초점, 회전 디스크)과 비교할 때 조직 이미징의 깊이가 크게 증가하지만 귀에서 세포 내 역학을 시각화하는 능력은 조직의 가장 바깥층(80-100μm)으로 제한됩니다. 이는 두꺼운 ECM 층에 의해 생성되는 강렬한 광 산란으로 인해 더 깊은 층에서의 이동을 조사하기 어렵기 때문입니다. 또 다른 한계는 호중구는 수명이 매우 짧고 유전자 편집 기술을 수행할 수 있을 만큼 충분히 오래 배양할 수 없다는 사실입니다. 이는 특정 유전자가 없거나 선택된 돌연변이를 품고 있는 호중구를 생산하도록 마우스를 엔지니어링함으로써 극복할 수 있으며, 이는 물론 연구 비용과 기간을 증가시킵니다.
여기에 설명된 절차는 막 역학을 조사하기 위해 고안되었지만, 호중구뿐만 아니라 다른 면역 세포 유형 및 이동 세포의 모든 세포 생물학적 문제를 해결하도록 조정할 수 있습니다. 세포 행동(예: 이동 표현형, 세포 속도 및 방향성22)에 대한 저배율 IVM을 통해 수집된 정보는 세포 기관 재배치, 단백질 분비, 세포내이입, 핵 역학, 칼슘 역학, 세포골격 조직 및 네토시스에 대한 ISMic을 통해 얻은 기계론적 정보와 보완되고 상관될 수 있습니다. 약리학적 및/또는 유전자 조작의 사용은 관심 과정에서 특정 분자 경로의 역할을 강조할 수 있으므로 이는 독특하고 매우 강력한 접근 방식입니다.

지시된 세포 이동은 발달, 면역 반응, 조직 복구, 종양 시작, 진행 및 전파를 포함한 다양한 생리학적 및 병리학적 과정에서 발생하는 중요한 사건입니다 1,2. 이 과정은 원형질막에서 동족 수용체가 감지한 다음 복잡한 세포 내 신호로 변환되는 특정 세포외 화학주성 신호에 의존합니다. 이러한 경로는 차례로 세포골격의 국소 활성화, 막 이동 및 리모델링, 세포 분극을 포함한 일련의 반응을 통해 세포 이동을 활성화합니다3. 세포 이동의 두 가지 뚜렷한 유형, 즉 중간엽(mesenchymal)과 아메바이드(amoeboid)가 잘 규명되어 있다4. 중간엽 이동은 상대적으로 느리고(<1μm/min), 세포와 세포외 기질(ECM) 사이의 강력한 접착력에 의존하며, 메탈로프로테아제에 의한 기질 분해에 의존합니다. 대조적으로, 염증 신호에 빠르게 반응하는 면역 세포의 특성인 아메보이드 이동은 더 빠르고(>10μm/min) 약한 접착력을 사용하여 ECM을 탐색합니다. 양상에 관계없이, 세포 이동은 원형질막의 지속적인 리모델링을 필요로 하며, 그 결과 세포의 전방 가장자리에 돌출 구조가 생성되며, 이는 후방1에서 막의 수축과 긴밀하게 조정됩니다.
이러한 sub-cellular process의 기저에 있는 분자 메커니즘을 밝히기 위해서는 이동하는 세포에서 막의 역학을 적절한 시간적, 공간적 해상도로 시각화하는 것이 필수적입니다. 더욱이, 막 리모델링은 이동하는 세포를 둘러싼 조직 미세환경의 특성에 큰 영향을 받기 때문에 이 과정을 살아있는 동물 내의 네이티브 조직에서 직접 이미지화하는 것이 중요합니다. 이는 생체 내 현미경(IVM)을 사용하여 수행됩니다5. 최초의 IVM 이미징은 ~200년 전에 수행되었으며, 이때 간단한 투광 현미경6을 사용하여 백혈구 유출을 시각화했으며 그 후 IVM은 주로 제브라피시 및 초파리 7,8과 같은 반투명 모델 유기체에 사용되었습니다. 지난 20년 동안 IVM은 생쥐, 쥐 및 돼지와 같은 더 큰 포유류의 세포 과정을 조사하는 데 성공적으로 사용되었습니다 5,9. 이는 1) 컨포칼 및 다광자(MP) 현미경의 중요한 발전과 2) CRISPR-Cas9과 같은 유전자 편집 기술의 향상으로 인해 다양한 동물 모델의 신속한 엔지니어링을 통해 형광 태그가 부착된 단백질과 리포터를 발현할 수 있게 되었습니다. 게다가, 종양 시작, 세포 이동 및 면역 반응과 같은 과정 동안 개별 세포 및 그들의 미세환경의 시각화는 혈관 구조10,11을 표지하기 위한 염료의 체계적 도입과 같은 외인성 라벨링의 다른 형태와 SHG(Second Harmonic Generation)10를 통한 콜라겐과 같은 내인성 분자의 여기(excitation)에 의해 가능해졌습니다. 12 및 제 3 고조파 생성 (THG)을 통한 신경 섬유 11,13. 마지막으로, 심장 박동 및 호흡으로 인한 움직임 아티팩트를 최소화하는 기술의 개선으로 생체 내 세포 내 현미경(ISMic)이 개발되었으며, 이를 통해 연구자들은 시험관 내에서 관찰된 것과 유사한 해상도 수준으로 살아있는 동물에서 직접 여러 세포 내 이벤트를 이미지화하고 조사할 수 있게 되었습니다 14,15,16,17 . ISMic의 예로는 exocytosis 14,15,16,17 및 endocytosis15 동안의 세포골격 역학 조사, 세포 이동 중 세포골격 동적 리모델링(17,18), 미토콘드리아 국소화 및 대사(19,20), 뇌의 칼슘 신호전달(21) 등이 있습니다.
이 프로토콜은 ISMic을 사용하여 살아있는 마우스의 귀 피부에서 호중구 이동 중 세포 내 해상도에서 세포막 리모델링을 조사하기 위한 다양한 단계와 절차를 자세히 설명합니다. 이 접근법은 앞서 설명한 프로토콜22,23을 기반으로 하며 더 높은 공간적, 시간적 해상도를 달성하도록 조정됩니다.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 튜브</td><td>USA Scientific</td><td>4036-3204</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 튜브</td><td>Corning</td><td>430766</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 주사기</td><td>Covidien 8881501400</td><td></td><td></td></tr><tr><td>27 G 바늘</td><td>Kendall</td><td>827112</td><td></td></tr><tr><td>27 G 날개 주입 세트</td><td>Terumo</td><td>SV*27EL</td><td></td></tr><tr><td>30x 대물렌즈</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO30XS</td><td>1.05 NA, 실리콘 오일 이멀젼</td></tr><tr><td>40x 대물렌즈</td><td>Olympus</td><td></td><td>UPLSAPO40XS 1.23 NA, 실리콘 오일 이멀젼</td></tr><tr><td>60mm 접시</td><td>Falcon</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>6 mL 주사기</td><td>Kendall</td><td>8881516937</td><td></td></tr><tr><td>Acepromazine (10 mg/mL)</td><td>Vet one</td><td>13985-587-50</td><td></td></tr><tr><td>ACK 용해 완충액</td><td>품질 생물학적</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>밸런스</td><td>및</td><td>EK-1200A</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>시그마 Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>셀 여과기 40 &마이크로; m</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS431750</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>ImageJ</td><td>N/A</td><td>이미지 시각화/분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>Fluoview 소프트웨어</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td>수집 소프트웨어</td></tr><tr><td>FVB 마우스 스트레인</td><td>잭슨</td><td>N/A</td><td>FVB 배경</td></tr><tr><td>가스 마취 시스템</td><td>Patterson 수의학</td><td>07-8915712</td><td>Link 7 모델</td></tr><tr><td>Green Cell tracker</td><td>Thermo</td><td>C2925</td><td>세포 배양 등급 DMSO에 용해되어 1mM 농도에 도달(1000x)제</td></tr><tr><td>모 크림</td><td>Nair</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (w/o Ca2+, Mg2+)</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1M pH 7.3</td><td>Quality Biological</td><td>118-089-721</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1077</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10771-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1991</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11191-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td>N/A</td><td>이미지 시각화/분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Vet</td><td>one 13985-528-40</td><td></td></tr><tr><td>케타민 (100 mg/mL)</td><td>Vet one</td><td>13985-584-10</td><td></td></tr><tr><td>LyzM-cre x mT/mG</td><td>실험실에서 생성</td><td>N/A</td><td>C57BL/6J 배경</td></tr><tr><td>수동 micromanipulator</td><td>WPI</td><td>M3301R</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MatWorks</td><td>N/A</td><td>분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>mtomato 실험실</td><td>에서 생성된</td> 마우스 변형 <td>N/A</td><td>mT/mG, FVB 배경</td></tr><tr><td>다광자 레이저</td><td>Spectra Physics</td><td>Insight DS+</td><td></td></tr><tr><td>다광자 현미경</td><td>Olympus</td><td>MPE-RS</td><td></td></tr><tr><td>Nanofil 10 &micro; L 주사기</td><td>WPI</td><td>NANOFIL</td><td></td></tr><tr><td>나노필 33G 바늘</td><td>WPI</td><td>NF33BV-2</td><td></td></tr><tr><td>대물 히터</td><td>Bioptechs</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>대물 히터 컨트롤러</td><td>Bioptechs</td><td>150803</td><td></td></tr><tr><td>안과 연고</td><td>주요</td><td>NDC 0904-6488-38</td><td></td></tr><tr><td>산소 발생기</td><td>Caire</td><td>VisionAire 5</td><td></td></tr><tr><td>PBS (w/o Ca2+, Mg2+)</td><td>품질 생물학</td><td>114-058-131</td><td></td></tr><tr><td>식염수</td><td>품질 생물학</td><td>114-055-101</td><td></td></tr><tr><td>스테이지 히터</td><td>Okolab</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>스테이지 히터 컨트롤러</td><td>Okolab</td><td>H401-T</td><td></td></tr><tr><td>수술용 테이프</td><td>3M</td><td>1538-1</td><td>저자극성</td></tr><tr><td>주사기 드라이버</td><td>하버드 장치</td><td>PHD Ultra</td><td></td></tr><tr><td>온난화 패드</td><td>Parkland Scientific</td><td>A2789B</td><td></td></tr><tr><td>온난화 펌프</td><td>Parkland Scientific</td><td>TP-700</td><td></td></tr><tr><td>자일라진(100mg/mL)</td><td>수의사</td><td>13985-704-10</td><td></td></tr></tbody></table>

생리학적 조건에서 세포하막 리모델링을 조사하기 위해 마우스 피부의 호중구 이동을 이미징합니다.

Imaging Neutrophil Migration in the Mouse Skin to Investigate Subcellular Membrane Remodeling Under Physiological Conditions

조직에서의 면역 세포 모집 및 기능에 대한 연구는 지난 20년 동안 매우 활발한 분야였습니다. 호중구는 염증 부위에 도달하고 감염 또는 조직 손상 시 선천성 면역 반응에 참여하는 첫 번째 면역 세포 중 하나입니다. 지금까지 호중구 이동은 균일한 자극 또는 아가로스 또는 미세유체 채널 하에서의 제한된 이동을 기반으로 하는 다양한 시험관 내 실험 시스템을 사용하여 성공적으로 시각화되었습니다. 그러나 이러한 모델은 호중구가 생체 내에서 만나는 복잡한 미세환경을 재현하지 않습니다. 생체 내 세포 내 현미경(ISMic)과 같은 다광자 현미경(MPM) 기반 기술의 개발은 생리학적 조건에서 세포 내 해상도에서 호중구 역학을 시각화하고 조사할 수 있는 고유한 도구를 제공합니다. 특히, 살아있는 마취된 쥐의 귀는 접근성이 용이하고 외과적 노출이 없기 때문에 호중구 간질 이동을 실시간으로 추적할 수 있는 실험적 이점을 제공합니다. ISMic은 시간이 지남에 따라 세포 및 더 중요하게는 세포 내 과정을 3D(4D)로 추적하는 데 필요한 광학 해상도, 속도 및 획득 깊이를 제공합니다. 또한, 간질 미세환경(즉, 혈관, 상주 세포, 세포외 기질)의 다중 모드 이미징은 선별된 형광 마커를 발현하는 형질전환 마우스, 형광 프로브를 통한 외인성 라벨링, 조직 고유 형광 및 2차/3차 고조파 생성 신호의 조합을 사용하여 쉽게 달성할 수 있습니다. 이 프로토콜은 1) 마우스 귀로의 입양 전달을 위한 호중구 준비, 2) 최적의 세포 내 이미징을 위한 다양한 설정, 3) 생리적 반응을 유지하면서 모션 아티팩트를 최소화하는 전략, 4) ISMic을 사용하여 호중구에서 관찰된 막 리모델링의 예, 5) 생체 내 호중구 이동에서 멤브레인 리모델링의 정량 분석을 위한 워크플로우를 설명합니다.

여기에서는 각각 셀룰러 및 서브셀룰러 분해능을 제공하는 고전적인 IVM 및 ISMic을 설명하기 위해 두 가지 다른 결과 세트가 제시됩니다. 첫 번째 예에서는, 야생형(WT) 마우스에서 호중구를 정제하고, 세포질을 염색하기 위해 Cell Tracker Green으로 라벨링한 다음, 원형질막을 표적으로 하는 형광 단백질을 발현하는 형질전환 마우스(mTomato 마우스, mT/mG33, 그림 1 및 영화 1 및 영화 2)에 주입했습니다. 이 수용 마우스는 IVM 기반 접근 방식(단계 6.8.1)을 통해 혈관, 상주 세포 및 모낭(그림 1C 및 동영상 1)과 같은 귀 조직의 구조적 특징을 시각화할 수 있었습니다. SHG(여기 파장의 절반에서 감지됨)를 통해 드러난 콜라겐 섬유는 호중구가 주입되는 진피의 복잡한 네트워크에 배열되었습니다. 모낭(HF)의 가장자리를 따라 상피 세포층(즉, 각질 형성 세포)이 관찰되었습니다. 때때로, 피부의 국부적 함몰을 초래하는 잔여 모발의 아티팩트가 시각화되었습니다(H). 레이저로 인한 손상은 모든 채널에서 감지되는 강력한 자동 형광과 콜라겐 배열의 변화로 인해 쉽게 시각화되었습니다(그림 1D). 피부의 3D 구조와 주입된 호중구의 위치 파악에 대한 보다 완전한 관점은 외부 레이어에서 내부 레이어까지 피부의 Z 스택과 3D 볼륨 렌더링을 묘사하는 영화 1에서 감상할 수 있습니다. 타임랩스 이미징은 호중구가 귀 피부를 샘플링하고 ECM 및 숙주 조직과 상호 작용하는 것을 보여주었습니다(영화 2). 이 해상도에서 이미징하고 30초마다 Z 스택을 획득하면 세포 추적을 수행하고 운동성 매개변수(즉, 속도 및 방향성)를 측정할 수 있지만 이 해상도에서는 멤브레인 리모델링을 정확하고 상세하게 분석하기가 어렵습니다.
두 번째 예에서는 LyzM-cre mT/mG 마우스에서 정제하고 WT 동물에 주입한 mGFP 발현 호중구를 사용하여 ISMic 접근법(단계 6.8.2)을 통해 멤브레인 리모델링을 평가했습니다(그림 2A, 실험 순서도). ISMic 프로토콜(그림 3 및 그림 2B의 정지 이미지)을 사용하고 레이저 손상 시 이동 중에 원형질막의 동적 리모델링이 관찰되고 앞쪽 가장자리의 막 돌출부 형성과 세포 뒤쪽의 수축이 명확하게 시각화됩니다(그림 2 및 동영상 3). 영화 3에서 강조된 타임랩스 시퀀스는 ECM과의 상호 작용의 복잡성을 보여줍니다. 실제로, 호중구는 섬유를 따라 또는 섬유와 섬유 사이의 공간을 이동하면서 틈새 공간을 통해 이동했습니다. 마지막으로, 곡률의 변화와 세포의 전면과 후면의 면적 변화와 같은 정량적 측면을 각 시점에 대해 정량화했습니다. 그림 2B에 설명된 세포를 예로 들면, 세포 표면 아래에 있는 100개의 경계점 식별을 기반으로 알고리즘 파이프라인(7단계 참조)을 사용하여 원형질막의 국소 역학을 분석했습니다(그림 3A). 국부 곡률(그림 3B)과 원형질막 돌출부에 의해 밑줄이 그어진 영역(그림 3C)의 변화는 각 경계점에 대해 계산되고 각 시간 프레임에 대해 카이모그래프(그림 3D,E)로 보고되었습니다. 셀의 앞면과 뒷면 모두 셀의 측면보다 더 높은 곡률을 유지합니다(그림 3D). 음의 영역 변화(수축, 파란색 영역)는 양의 영역 변화(돌출부, 빨간색 영역)가 더 두드러지는 선행 가장자리보다 셀 뒤쪽에서 더 뚜렷합니다(그림 3E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63581/63581fig01.jpg"> 그림 1: 쥐 귀 피부의 호중구 IVM. (A) 현미경 스테이지의 귀 설정의 개략도. (B) 실험 순서도. (C) 형광 표지된 호중구를 주입한 mTomato 마우스의 귀 피부의 대표적인 이미지. 모낭(HF), 혈관(BV), 표피(E), 진피(D), 기저세포층(BCL) 및 모발 인공물(피부 표면의 잔여 모발, H로 인해). (D) 멸균 레이저 손상 후 마우스 피부의 대표 이미지: 파란색 채널(오른쪽), 녹색 및 빨간색 채널(가운데), 병합된 이미지(왼쪽). 녹색 및 적색 채널 모두에서 강력한 자가형광 방출과 콜라겐-I 섬유에 구멍이 형성되어 관찰되는 ECM의 중단으로 인해 이미지 왼쪽에서 부상을 볼 수 있습니다. C 와 D에서 녹색: 호중구; 빨간색: 마우스 숙주 조직; 시안: 콜라겐-I SHG. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/63581fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63581/63581fig02.jpg"> 그림 2: WT 마우스 귀에서 이동하는 mGFP 호중구의 타임랩스. (A) 실험 순서도. (B) 영화 3의 대표 정지 이미지. (C) 멤브레인 3D 조직을 시각화하기 위한 동일한 셀의 부피 렌더링. 높은 멤브레인 역학 영역은 화살표(수축을 나타내는 빨간색, 돌출을 나타내는 파란색)로 표시됩니다. (D) 렌더링된 셀 볼륨의 클로즈업 및 기울어진 시각화. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/63581fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63581/63581fig03.jpg"> 그림 3: ISMic을 사용하여 수집된 막 역학의 정량화를 위한 분석 파이프라인. (A) 그림 2B에 설명된 mGFP 호중구에 대한 두 개의 연속적인 프레임 간에 세포 윤곽 측정 및 경계 지점 재분할(100 경계 지점). (B) 색상이 지정된 경계는 모든 경계 점에 대해 결정된 로컬 멤브레인 곡률을 나타냅니다. (C) 두 개의 연속된 프레임 사이의 로컬 영역 변경(현재: 파란색, 다음: 빨간색). 초록색 영역은 로컬 멤브레인 운동의 추적 결과를 나타냅니다. 노란색 화살표는 멤브레인 변위의 일반적인 방향을 나타냅니다. (D) 시간 경과에 따른 셀의 경계 곡률 키모그래프. 세로축은 경계점 인덱스를 나타내며, 여기서 1과 100은 이동 방향에 따른 셀의 뒤쪽을 나타냅니다. (E) 시간 경과에 따른 세포의 막 돌출(빨간색)과 막 수축(파란색)을 반영하는 국소 면적 변화 키모그래프. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/63581fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
영화 1: IVM을 사용하여 mTomato 마우스 귀에서 시각화된 녹색 표지 호중구. 빨간색: mTomato 숙주 쥐 조직. 청록색: 콜라겐-I SHG; 녹색: 호중구. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/Movie1_Jove_final.mp4" target="_blank">이 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
영화 2: mTomato 쥐의 귀 피부에서 이동하는 호중구의 IVM. 비디오는 5프레임/초의 프레임 속도로 ͂27분 동안 획득한 이미지 스택의 최대 강도 투영입니다. 빨간색: mTomato 숙주 쥐 조직. 청록색: 콜라겐-I SHG; 녹색: 호중구. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/Movie2_Jove_final.mp4" target="_blank">이 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
영화 3: WT 마우스 귀에서 호중구 이동 중 막 리모델링의 ISMic. 비디오는 10프레임/초의 프레임 속도로 ͂8분 동안 획득한 이미지 스택의 최대 강도 투영입니다. 빨간색: mTomato 숙주 쥐 조직. 청록색: 콜라겐-I SHG; 녹색: mGFP 호중구; 연한 녹색: 렌더링된 호중구. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/Movie3_Jove_final.mp4" target="_blank">이 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

호중구 이동은 화학 유인 물질 및 세포 외 미세 환경과의 상호 작용에 대한 반응으로 원형질막의 빠르고 지속적인 리모델링에 의존합니다. 본원에서는 마취된 마우스의 귀에 주입된 호중구에서 막 리모델링의 역학을 조사하기 위한 Intravital Subcellular Microscopy에 기초한 절차가 설명됩니다.

The study of immune cell recruitment and function in tissues has been a very active field over the last two decades. Neutrophils are among the first ...

이 방법은 생체 내 세포하 현미경을 사용하여 살아있는 동물에서 호중구 이동 중 막 리모델링을 연구하는 기술을 설명합니다. 이 프로토콜은 물리적 조건에서 동물이 이동하는 동안 막 역학을 연구하고 조직 미세환경을 포함하지 않는 고유한 접근 방식을 제공합니다. 이 기술은 다양한 세포 유형 및 이동 세포에서 막 재모델링 및 세포골격 동적 장기 재배치 및 막 이동을 해결하기 위해 맞춤화할 수 있습니다.먼저, 야생형 마우스에서 정제한 호중구 현탁액에 녹색 형광 염료를 첨가하고 1.5ml의 BSA 코팅 튜브에 넣습니다. 튜브 로테이터에서 부드럽게 교반하면서 실온에서 30분 동안 배양합니다. HBSS를 사용하여 3회 세척한 다음 실온에서 400배 G로 5분 동안 원심분리하고 펠릿을 1밀리리터의 Hanks'Balanced Salt Solution에 재현탁시킵니다.이 현탁액을 BSA 코팅 튜브의 튜브 로테이터에 넣고 주입 절차까지 부드럽게 교반합니다. 주입하기 전에, 20 마이크로리터 당 2백만에서 5백만 세포의 조밀도를 도달하기 위하여 세포 펠릿을 식염수 속에 다시 현탁시키십시오. 마취된 동물을 체온을 유지하기 위해 섭씨 37도의 보온 패드로 옮깁니다.발 철수 반사를 테스트한 후 미세 트리머를 사용하여 귀에서 털을 제거하여 이미지 품질을 최적화합니다. 동물을 옆으로 눕히고 귀 가장자리를 잡고 수술용 테이프를 사용하여 보온 패드를 따라 평평하게 한 다음 33 게이지 바늘이 장착된 주사기에 호중구 현탁액을 채우고 미세 매니퓰레이터에 장착합니다. 바늘을 귀 쪽으로 부드럽게 움직여 천천히 피부를 뚫습니다.바늘이 피부 안쪽에 들어가면 피스톤을 천천히 밀어 넣고 2-3 마이크로 리터의 세포 현탁액을 전달합니다. 귀의 2-3 개 다른 부위에 조심스럽게 주사를 반복 한 후 수술 테이프를 조심스럽게 제거하고 동물이 감독하에 의식을 회복하도록하십시오. 조직과 세포가 주사 절차에서 회복될 수 있도록 이미징하기 전에 동물을 1시간 동안 쉬게 하십시오.현미경이 켜져 있고 stage와 렌즈가 s를 섭씨 37도로 예열한 후 마취된 동물을 현미경 s에 놓습니다.tag이자형. 유리로 된 커버슬립으로 스테이지의 구멍을 덮습니다. 마취된 동물을 조심스럽게 무대 위로 옮깁니다.한 시간 이상 영상 촬영이 계획된 경우 안과 연고를 바르고 날개 달린 주입 기반 관류 시스템을 고정합니다. 커버슬립 중앙에 식염수 한 방울을 떨어뜨리고 그 위에 호중구 주입 귀를 놓습니다. 커버슬립 중앙을 가로질러 멸균 면봉을 사용하여 귀를 부드럽게 평평하게 펴서 공기 주머니를 제거합니다.동물의 머리에 가까운 귀 옆으로 나무 막대기를 부드럽게 누르고 테이프로 잠궈 귀를 고정합니다. 그런 다음 현미경 접안렌즈를 사용하여 관심 영역을 찾고 다광자 획득 모드로 전환합니다. 레이저 여기 파장을 900 - 930 나노미터로 설정하여 녹색 형광 염료, mTomato, collagen-I를 동시에 획득할 수 있습니다.그런 다음 방출된 빛을 수집하기 위해 감지기에서 적절한 미러 세트와 필터 조합을 설정합니다. 하드웨어 구성에 가장 적합한 설정을 결정합니다. 이동하는 세포를 30초에서 1분 간격으로 추적할 수 있더라도 최소 10초 미만의 더 빠른 속도로 세포 내 이벤트를 이미징합니다.기존의 생체 내 현미경 접근 방식에서는 30X 렌즈와 이미지 크기가 512 x 512 픽셀인 Galvo 스캐너를 사용하여 세포 이동을 추적하고 숙주 마우스 조직을 조사한 다음 2마이크로미터의 단계 크기를 가진 전동 스테이지를 사용하여 Z축 변위를 설정하여 30초마다 30마이크로미터 깊이의 부피를 이미징할 수 있습니다. intravital subcellular microscopy 접근 방식에서는 40X 렌즈와 3배 평균을 내는 공명 스캐너를 사용하여 더 높은 배율과 해상도로 매우 동적인 멤브레인 리모델링을 이미지화합니다. 또한 단계 크기가 1마이크로미터인 피에조를 사용하여 Z축 변위를 설정하여 4-5초마다 20마이크로미터 깊이의 볼륨 이미징을 허용합니다.10초 동안 20 x 20마이크로미터의 좁은 영역에 고출력 여기 레이저를 집중시켜 호중구 이동을 유발하는 멸균 레이저 손상을 유도합니다. 모든 채널에서 나타나는 강력한 자가형광 신호와 그에 따른 콜라겐 배열의 변화로 인해 레이저로 인한 부상을 식별합니다. 추가 분석을 위해 실험이 끝날 때 데이터를 저장합니다.수용 마우스는 생체 내 현미경 기반 접근 방식을 통해 혈관, 거주 세포 및 모낭과 같은 귀 조직의 구조적 특징을 시각화할 수 있었습니다. 레이저로 인한 부상은 모든 채널에서 감지된 강력한 자가형광과 콜라겐 배열의 변화로 인해 쉽게 시각화되었습니다. 피부의 3차원 구조와 주입된 호중구의 국소화에 대한 완전한 보기는 3차원 볼륨 렌더링에서 외부 층에서 내부 층까지 피부의 Z 스택을 묘사합니다.타임랩스 이미징은 호중구가 귀 피부를 샘플링하고 세포 내 기질 및 숙주 조직과 상호 작용하는 것을 보여주었습니다. intravital subcellular microscopy를 사용하여 이동 중 원형질막의 동적 리모델링, 앞쪽 가장자리의 막 돌출부 형성 및 세포 뒤쪽의 수축을 명확하게 시각화합니다. 타임랩스 염기서열은 세포 내 기질과의 상호 작용의 복잡성을 보여줍니다.원형질막의 국소 역학은 세포 표면의 기저에 있는 100개의 경계 지점 식별을 기반으로 하는 알고리즘 파이프라인을 사용하여 분석되었습니다. 원형질막 돌출부에 의해 밑줄이 그어진 영역과 국소 곡률의 변화는 각 경계점에 대해 계산되었고, 각 시간대에 대해 카이모그래프로 보고되었습니다. 셀의 앞면과 뒷면 모두 셀의 측면보다 더 높은 곡률을 유지합니다.음의 영역 변화는 양의 영역 변화가 더 두드러지는 선행 가장자리보다 셀의 뒤쪽에서 더 뚜렷합니다. 이미징 후 조직을 수집, 고정 및 염색을 위해 처리하여 관심 대상을 추가로 평가하고 메커니즘을 규명할 수 있습니다. 멤브레인 역학을 이미지화하도록 설계된 이 절차는 다양한 세포 유형과 각각의 환경에서 세포를 이동하는 데 있어 더 광범위한 세포 생물학 문제를 해결하도록 조정할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

여기, 우리는 마우스 노상 강도의 백혈구가 추적 연구 비침습 두 개의 광자 (2P) 현미경의 접근 방식을 설명합니다. 우리는 조직 이미징 준비의 기술적 측면을 논의하고 실행 및 데이터를 수집하도록 설정 초기의 전형적인 실험을 통해 독자를 걸어보세요.

백혈구 호밍 및 마이 그 레이션의 비침습 영상 생체내에</em

우리는 생체내에서 호중구 chemoattractant의 근원에 대한 응답으로 호중구 모집 중에 동적으로 호중구 - 내피 세포 상호 작용을 측정하기위한 brightfield intravital 현미경의 프로토콜을 설명합니다. 호중구 intraluminal 크롤링, 마우스 cremaster 근육 조직에 transendothelial 마이 그 레이션 및 chemotaxis 시간은 타락한 동영상 사진 및 ImageJ와 추적과 시각입니다.

추적 호중구 Intraluminal 크롤링, Intravital 비디오 현미경에 의한 조직의 Transendothelial 마이 그 레이션 및 Chemotaxis

이 비디오는 GFP 발현 호중구를 가진 면역 저하 형질전환 마우스의 감염 부위에서 호중구 모집 역학을 연구하기 위한 생체 내 이미징을 보여줍니다. 발광 박테리아를 주입하여 감염을 일으키는 것과 관련이 있습니다. 이는 감염 부위에 호중구가 동원되도록 유도하며, 이미징을 통해 추적이 이루어집니다.

Murine 모델에서 감염 부위의 호중구 모집 역학 및 박테리아 부담 모니터링

백혈구는 세포층 또는 세포 횡단 경로를 사용하여 내피 세포 단일 층을 교차. 우리는 내생 접합부의 분포가 VE-cadherin의 및 PECAM-1 백혈구 transendothelial 이주 중에 생리 흐름에 따라이 윤회 노선을 구별하기 위해 수행하는 간단한 분석을 개발했다.

호중구 윤회에서 생리 흐름 중 내피 세포 - 세포 접합의 실시간 영상

마취된 마우스에서 생체 내 컨포칼 현미경을 사용하여 정상 상태 및 염증 상태에서 장간막 정맥의 호중구 및 단핵구의 거동을 모니터링하는 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다.

실시간으로 마취 마우스에 생체 내에 현미경으로 장간막 혈관에서 호중구와 단핵구 이미징

염증 부위에서 이펙터 CD4 T 세포의 삽입 운동을 제어하는​​ 메카니즘은 상대적으로 알려져 있지 않다. 우리는 시각화 현장에서 이러한 세포의 동적 거동의 연구를 허용 염증 귀 진피의 시험 관내 -primed CD4 T 세포에서 조작하는 비 침습적 방법을 제시한다.

염증이 진피의 이미징 CD4 T 세포 간질 마이그레이션

이 현재 프로토콜은 형광 리포터, 생체 내 라벨링 및 생체 내 이미징 기술을 사용하여 살아있는 동물의 호중구 프라이밍의 동적 과정을 모니터링할 수 있습니다.

IL-1β의 발기인 기반을 DsRed 기자 마우스를 사용 호중구 초벌의 생체 내에 영상

여기에서, 우리는 마우스 cremaster 근육의 포스트 모세관 정맥에 intravital 현미경 검사법을 수행하는 방법을 보여줍니다. 일반적으로 염증과 패혈증의 다른 모델, 특히 케모카인과 사이토 카인에 의해 유도 된 모델에 적용, 우리는 과장 된 근육 백혈구 침투를 포함하는 muscolopathies의 연구에서 그 관련성을 강조.

Intravital 현미경 검사법에 의해 평가된 마우스에 있는 Cremaster 근육의 백혈구 침투

여기에서, 우리는 생체외 및 시험관내 둘 다 호중구 이동 및 침투를 평가하는 3개의 방법을 제시합니다. 이 방법은 호중구 이동을 표적으로 하는 유망한 치료법을 발견하기 위하여 이용될 수 있습니다.

마우스에서 호중구의 이동 및 침투 감지

여기서 우리는 제브라피쉬 호중구에서 화학유인성 수용체 역학의 라이브 이미징 및 정량적 분석을 수행하는 프로토콜을 설명합니다.

상처 반응 중 제브라피쉬 호중구의 케모카인 수용체의 라이브 이미징

관절의 생체 영상 촬영은 염증이 생긴 관절 내 백혈구의 이동 행동과 분자 역학을 밝히는 데 매우 유용한 기법입니다. 여기서는 제2형 콜라겐 유발 관절염(CIA) 마우스 모델을 사용한 관절의 생체 내 영상 검사에 대한 상세한 프로토콜을 제시합니다.

생체 내 영상 검사는 관절 내 백혈구의 이동 행동을 밝혀냅니다

배우세요 마우스 피부에서 호중구 이동 시 세포막 리모델링을 실시간으로 관찰하는 생체 내 미세현미경 기법을. 이 방법은 면역세포 역할과 조직 상호작용을 연구하는 데 활용됩니다.

생리학적 조건에서 세포하막 리모델링을 조사하기 위해 마우스 피부의 호중구 이동을 이미징합니다.

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