눈물샘 줄기세포를 위한 삼차원, 무혈청 배양 시스템

이 프로토콜은 눈물샘의 재생 및 재건을 위해 눈물샘 줄기 세포를 풍부하게하기위한 유리한 전략을 제공합니다. 눈물샘 줄기세포는 장기적인 확장 능력과 분화 가능성을 보여줍니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 눈물샘 줄기 세포의 배양 배지가 혈청이 없다는 것입니다.이 배지는 안락사 된 여섯 ~ 여덟 주 된 BALB / c 수컷 마우스를 얻고 귀 뒤의 피부를 절단하여 눈물샘과 그 주변의 결합 조직을 노출시킴으로써 눈물샘 복구에 엄청난 가치를 보여줍니다.

핀셋의 도움으로 무딘 해부로 결합 조직을 벗겨 내고 눈물샘을 제거하십시오. 눈물샘을 75%에탄올 네 밀리리터와 함께 6센티미터 접시에 담그고 즉시 10밀리몰 PBS 용액으로 두 번 헹구십시오. 눈물샘을 약 한 밀리미터 입방체의 작은 조각으로 자릅니다.

이들을 멸균 15 밀리리터 원심분리 튜브로 옮기고 섭씨 37도에서 1 시간 동안 밀리리터 디스파제 당 25 단위의 500 마이크로리터와 0.1 % 콜라게나제 I 500 마이크로리터로 조직을 처리한다. 눈물샘 절편을 섭씨 37도에서 10분 동안 0.05%트립신 EDTA 1밀리리터로 처리하고 반복적으로 피펫팅하여 단편을 단일 세포로 해리시킨다. 현탁액을 70마이크로미터 필터를 통해 여과하고, 필터를 멸균된 15밀리리터 원심분리 튜브에 넣고, 5분 동안 150배 G에서 원심분리한다.

원심분리 후, 상층액을 제거하고, 세포 펠릿을 세척하기 위해 10 밀리리터의 10-밀리몰 PBS 용액을 첨가하고, 현탁액을 5분 동안 150배 G에서 원심분리한다. 세포 펠릿의 세척을 반복한다. 그런 다음 상층액을 제거하고 Dulbecco의 Modified Eagles Medium과 Ham's F-12의 1:1 비율의 1 밀리리터를 추가하여 세포 펠릿을 재현탁시킵니다.

20 마이크로리터의 매트릭스 겔 눈물샘 줄기 세포 배지 매트릭스를 24-웰 플레이트의 웰 중앙에 첨가한다. 피펫 팁을 사용하여 직경이 약 여섯 ~ 8 밀리미터 인 원으로 확장하고 섭씨 37도에서 20 분 동안 혼합물을 인큐베이션하여 웰을 미리 코팅하십시오. 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 결정하고 40 마이크로 리터의 눈물샘 줄기 세포 배지 또는 LGSCM을 매트릭스 젤의 40 마이크로 리터에 총 10, 000 개의 세포와 함께 첨가하십시오.

피펫으로 부드럽게 섞으십시오. 피펫을 사용하여 24-웰 플레이트의 각 웰에 있는 예비코팅된 영역 위에 80 마이크로리터의 혼합물을 조심스럽게 떨어뜨린다. 혼합물을 섭씨 37도에서 20 분 동안 인큐베이션하고 600 마이크로리터의 LGSCM을 첨가한다.

각 웰의 배양액을 이틀에 한 번씩 바꿉니다. 7일간 배양한 후, 거꾸로 현미경으로 직경이 100 내지 300 마이크로미터인 LGSC 구체를 찾아본다. 이 프로토콜을 사용하여 Rosa26 및 NOD 마우스의 일차 눈물샘 줄기 세포를 분리하고 배양하십시오.

칠일 배양 후, 배양구에서 배양액을 잘 제거하였다. LGSC 구체를 섭씨 37도에서 30분 동안 밀리리터 디스파제 및 100 마이크로리터의 10-밀리몰 PBS 당 10 단위의 20 마이크로리터에서 인큐베이션하여 분해한다. 현탁액을 15-밀리리터 원심분리 튜브로 옮기고 4분 동안 150배 G에서 원심분리한다.

상층액을 제거하십시오. 섭씨 37도에서 5 분 동안 0.05 % 트립신 EDTA의 한 밀리리터로 구체를 처리하십시오 0.05 % 트립신 억제제와 피펫 한 밀리리터를 반복적으로 추가하여 트립신을 중화시키고 구체를 단일 세포로 해리시킵니다. 5분 동안 150배 G에서 원심분리하고 상층액을 제거하여 LGSCs를 펠릿화하였다.

LGSCM의 한 밀리리터를 추가하여 눈물샘 줄기 세포 펠릿을 재현탁시키고 이전에 입증 된 바와 같이 세포를 플레이트하십시오. 절차 1을 수행하는 경우, 무작위 분화를 위한 눈물샘 줄기세포 배양 시스템으로 LGSCs의 배양 시간을 7일에서 14일로 연장한다. 절차 2의 경우, 덕트 세포의 분화를 위해 눈물샘 줄기세포 배양의 시작 부분에서 LGSCM에 대한 매트릭스 겔의 비율을 1:1에서 1:2로 변경한다.

눈물샘 줄기 세포를 14일 동안 유도를 위해 매트릭스에 시드한다. 세 번째 절차의 경우, 계대 후, LGSCM을 LGSCM 10% FBS로 교체하여 아시나 세포의 분화를 한다. 14일 동안 분화를 유도하였다.

배양 일주일 후, Kr14 및 Ki67은 눈물샘 줄기 세포에 의해 형성된 모든 구체에서 발현되었다. 구체는 100 마이크로 미터의 직경에 도달했습니다. 헤마톡실린 및 에오신 염색은 일곱째 날에 세포성을 나타내었다.

일차 배양 및 계대 배양 칠일 후에 수득된 눈물샘 줄기 세포의 농축 인자는 이 방법에 의해 농축된 세포가 강한 증식 능력을 가졌다는 것을 나타내었다. 이 시스템에서 눈물샘 줄기 세포는 40 배 이상 계대 될 수 있으며 여전히 줄기 세포 특성을 유지할 수 있습니다. 눈물샘 줄기 세포는 우태아 혈청 및 매트릭스 겔의 낮은 비율에 의해 더 많은 새싹을 형성하도록 유도되었다.

헤마톡실린 및 에오신 염색은 태아 소 혈청이 구체가 더 많은 캐비테이션 구조를 생성하도록 유도할 수 있음을 나타내었다. NOD 마우스에 Rosa lacrimal gland stem cells의 동위원소 주사 후, 눈물샘에 인접한 새로운 눈물샘이 형성되었다. 대부분의 소엽은 AQP5의 높은 발현을 갖는 성숙한 acinar 세포로 구성되었고, 낮은 AQP5 발현을 갖는 소낭내 덕트 형성이 있었다.

로사 눈물샘 줄기세포 주입측에서의 눈물분비량은 대조군 측보다 높았지만 야생형 마우스보다 낮았으나 매트릭스 젤과 그 관련 혼합물은 사용 전에 항상 얼음 위에 보관해야 하며 매트릭스 겔과 접촉하는 미세원심분리기 튜브 및 팁은 미리 냉각되어야 한다. 이 시스템은 눈물샘 줄기 세포, 눈물샘 복구 및 눈물샘 질환에 대한 약물 스크리닝에 대한 추가 연구에 이상적인 모델을 제공합니다.