Name: 눈물샘 줄기세포를 위한 삼차원, 무혈청 배양 시스템 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: 배우세요 눈물샘 줄기세포의 무혈청 3차원 배양 시스템을 이용한 장기간 증식 및 분화 유도 방법. 이 기술은 눈물샘 재생 및 수술 복원 연구에 필수적인 모델을 제공합니다.

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이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (제 31871413 호)의 보조금과 광동 과학 기술 (2017B020230002 및 2016B030231001)의 두 가지 프로그램에 의해 지원되었습니다. 우리는 연구 기간 동안 우리를 도운 연구원들과 동물 센터에서 일하는 직원들에게 동물 보호에 대한 그들의 지원에 진심으로 감사드립니다.

<ol><li>Zoukhri, D., Macari, E., Kublin, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+injection+of+interleukin-1+induces+reversible+aqueous+tear+deficiency%2C+lacrimal+gland+inflammation%2C+and+acinar+and+ductal+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">A single injection of interleukin-1 induces reversible aqueous tear deficiency, lacrimal gland inflammation, and acinar and ductal cell proliferation.</a> Experimental Eye Research. 84 (5), 894-904 (2007).</li>
<li>Gromova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lacrimal+gland+repair+using+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Lacrimal gland repair using progenitor cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 88-98 (2016).</li>
<li>Buzhor, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-based+therapy+approaches%3A+the+hope+for+incurable+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cell-based therapy approaches: the hope for incurable diseases.</a> Regenerative Medicine. 9 (5), 649-672 (2014).</li>
<li>Tiwari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+human+lacrimal+gland+cultures+with+secretory+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Establishing human lacrimal gland cultures with secretory function.</a> PLoS One. 7 (1), 29458(2012).</li>
<li>You, S., Kublin, C. L., Avidan, O., Miyasaki, D., Zoukhri, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+propagation+of+mesenchymal+stem+cells+from+the+lacrimal+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Isolation and propagation of mesenchymal stem cells from the lacrimal gland.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (5), 2087-2094 (2011).</li>
<li>Ackermann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+investigation+of+presumptive+murine+lacrimal+gland+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Isolation and investigation of presumptive murine lacrimal gland stem cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (8), 4350-4363 (2015).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Lugli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R-spondin+1+and+noggin+facilitate+expansion+of+resident+stem+cells+from+non-damaged+gallbladders%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">R-spondin 1 and noggin facilitate expansion of resident stem cells from non-damaged gallbladders.</a> EMBO Reports. 17 (5), 769-779 (2016).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1), 299-312 (2015).</li>
<li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1), 324-338 (2015).</li>
<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5%2B%28ve%29+stem+cells+drive+self-renewal+in+the+stomach+and+build+long-lived+gastric+units+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Lgr5+(ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).</li>
<li>Linnemann, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+regenerative+potential+in+primary+human+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Quantification of regenerative potential in primary human mammary epithelial cells.</a> Development. 142 (18), 3239-3251 (2015).</li>
<li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).</li>
<li>Chua, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+luminal+epithelial+progenitors+can+generate+prostate+organoids+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture.</a> Nature Cell Biology. 16 (1), 951-961 (2014).</li>
<li>Maimets, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vitro+expansion+of+salivary+gland+stem+cells+driven+by+Wnt+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Long-term in vitro expansion of salivary gland stem cells driven by Wnt signals.</a> Stem Cell Reports. 6 (1), 150-162 (2016).</li>
<li>Xiao, S., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+long-term+serum-free+culture+for+lacrimal+gland+stem+cells+aiming+at+lacrimal+gland+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Establishment of long-term serum-free culture for lacrimal gland stem cells aiming at lacrimal gland repair.</a> Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 20(2020).</li>
<li>Shatos, M. A., Haugaard-Kedstrom, L., Hodges, R. R., Dartt, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+progenitor+cells+in+uninjured%2C+adult+rat+lacrimal+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of progenitor cells in uninjured, adult rat lacrimal gland.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2749-2759 (2012).</li>
<li>Mishima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+side+population+cells+restores+the+function+of+damaged+exocrine+glands+through+clusterin%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Transplantation of side population cells restores the function of damaged exocrine glands through clusterin.</a> Stem Cells. 30 (9), 1925-1937 (2012).</li>
<li>Aluri, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+improves+tear+production+in+a+mouse+model+of+sj%C3%B6gren%27s+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells improves tear production in a mouse model of sjögren's syndrome.</a> Stem Cells International. 2017, 1-10 (2017).</li>
<li>Dietrich, J., Schrader, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+lacrimal+gland+regeneration%3A+current+concepts+and+experimental+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Towards lacrimal gland regeneration: current concepts and experimental approaches.</a> Current Eye Research. 45 (3), 230-240 (2020).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SnapShot%3A+growing+organoids+from+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SnapShot: growing organoids from stem cells.</a> Cell. 161 (7), 1700(2015).</li>
<li>Kleinman, H. K., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+basement+membrane+matrix+with+biological+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">Matrigel: basement membrane matrix with biological activity.</a> Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 378-386 (2005).</li>
<li>Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membrane+matrix+%28BME%29+has+multiple+uses+with+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Basement membrane matrix (BME) has multiple uses with stem cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 8 (1), 163-169 (2012).</li>
</ol>

저자들은 그들이 경쟁하는 이익이 없다고 선언합니다.

눈물 줄기 세포 배양 및 LG 손상 복구를위한 눈물 줄기 세포의 분리 및 시험관 내 배양을위한 잘 확립 된 방법이 있습니다. Shatos et al.17 and Ackermannet al. (6) 쥐와 생쥐의 눈물 줄기세포를 각각 2D 배양 방법으로 성공적으로 배양 및 계대배양하여, ADD 치료를 위해 눈물 줄기세포를 이식할 수 있게 하였다. 2D로 배양된 LGs의 줄기세포18 및 중간엽 줄기세포19,20에 대한 연구는 이들 세포를 이식하면 ADD의 증상을 어느 정도 완화시킬 수 있음을 보여주었다. 형광-활성화된 세포 분류에 의해, Gromovaet al. 마우스 LGs로부터 LG 전구세포 마커를 발현하는 줄기세포 2개를 선별하여 시험관</em...

눈물샘 줄기 세포 (LGSCs)는 눈물샘 (LG) 세포 재생을 유지하며 acinar 및 ductal 세포의 원천입니다. 따라서, LGSC 이식은 심각한 염증성 손상 및 수성-결핍성 안구 건조증(ADDED)1,2,3을 치료하기 위한 대안적인 접근법으로 간주된다. LGSCs를 풍부하게하기 위해 여러 가지 배양 방법이 적용되었습니다. Tiwari et al. 여러 성장 인자가 보충 된 콜라겐 I 및 매트릭스 젤을 사용하여 일차 LG 세포를 분리 및 배양했습니다. 그러나, LG 세포는 지속적으로 배양될 수 없었다4. 2차원(2D) 배양물을 사용하여, 마우스 LG 유래 줄기세포를 You et al.5 및 Ackermann et al.에 의해 분리하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 줄기/전구 세포 마커 유전자, Oct4, Sox2, Nanog 및 네스틴을 발현하는 것으로 밝혀졌으며, 계대배양될 수 있었다. 그러나, 이들 세포가 아시나 또는 덕트 세포로 분화할 수 있다는 명확한 징후는 없으며, 생체내에서 분화 가능성을 검증하기 위한 이식 실험은 없다.
최근에, c-kit+ dim/EpCAM+/Sca1-/CD34-/CD45- 세포는 유세포 분석기에 의해 마우스 LG로부터 분리되었고, Pax6 및 Runx1과 같은 LG 전구 세포 마커를 발현하는 것으로 밝혀졌으며, 시험관 내에서 덕트 및 아시니로 분화되었다. ADDED를 가진 마우스에서, 이들 세포를 이용한 동위원소 주사는 손상된 LG를 복구하고 LGs2의 분비 기능을 회복시킬 수 있다. 그러나, 이 방법에 의해 단리된 줄기세포의 수는 적었고, 단리된 LGSCs를 확장시키기 위한 적절한 배양 조건은 없었다. 요약하면, ADDED의 치료에서 LGSCs의 연구를 위해 안정적이고 지속적인 확장으로 성인 LGSCs를 효과적으로 분리하고 배양하기 위해 적절한 배양 시스템이 수립 될 필요가있다.
줄기 세포 또는 만능 줄기 세포로부터 유래 된 오가노이드는 관련 기관과 조직학적으로 유사하고 자신의 재생을 유지할 수있는 세포 그룹입니다. 마우스 장 오가노이드가 2009년Sato et al. 7에 의해 성공적으로 배양된 후, 담낭8, 간9, 췌장10, 위 11, 유방12, 폐13, 전립선14 및 타액선15와 같은 사토의 배양 시스템에 기초하여 다른 장기로부터의 오가노이드를 연속적으로 배양하였다. . 오가노이드 배양에서 세포 분화 전 성체 줄기세포의 비율이 높기 때문에, 3차원(3D) 오가노이드 배양 방법은 LG의 성체줄기세포의 분리 및 배양에 최적으로 고려된다.
성인 마우스 LGSC 배양 시스템은 3D, 무혈청 배양 방법을 최적화함으로써 본 연구에서 확립되었다. 정상 및 ADDED 마우스 둘 다로부터 배양된 LGSCs가 자가재생 및 증식의 안정한 능력을 나타냈다는 것이 입증되었다. ADDED 마우스 LGs에 이식 한 후, LGSCs는 손상된 LG를 식민지화하고 눈물 생산을 개선했습니다. 또한, 적색 형광 LGSCs를 ROSA26mT/mG 마우스로부터 분리하고 배양하였다. 이 연구는 ADDED 요법을 위한 임상 적용 에서 시험관내 LGSC 농축 및 LGSC 자가이식편에 대한 신뢰할 수 있는 참조를 제공한다.

<table><tbody><tr><td>Animal(Mouse)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bal B/C</td><td>모델 난징 대학교</td><td></td><td></td>동물 연구 센터</tr><tr><td>C57 BL/6J</td><td>쑨원</td><td></td><td></td>대학교 실험 동물 센터</tr><tr><td>NOD/ShiLtJ</td><td>모델 동물 연구 센터 난징 대학교</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ROSA26mT/mG</td><td>난징 대학의</td><td></td><td></td> 모델 동물 연구 센터</tr> <tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>분석 저울</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>자동 탈수기</td><td>열</td><td></td><td></td></tr><tr><td>혈액 계수기</td><td>BLAU</td><td></td><td></td></tr><tr><td>세포 계수</td>기 <td>CountStar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 항온 인큐베이터</td><td>Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ECL Gel 이미징 시스템</td><td>GE 헬스케어</td><td></td><td></td></tr><tr><td>수조용 전기 수조</td><td>Yiheng 기술</td><td></td><td></td></tr><tr><td>전기 영동 장치</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>형광 정량 PCR 기기</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>냉동 조직 슬라이서</td><td>Lecia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>수평 원심 분리기</td><td>CENCE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>도립 형광 현미경</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>올림푸스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>레이저 라멜라 스캐닝 현미경 사진</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>액체 질소 용기</td><td>열</td><td></td><td></td></tr><tr><td>저온 고온 속도 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipettor</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microwave oven</td><td>Panasonic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 자외선 분광 광도계</td><td>온도</td><td>측정 RNA 농도</td><td></td></tr><tr><td>파라핀 슬라이싱 기계</td><td>Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR 증폭기</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH 값 테스터</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 &deg; C 냉장고</td><td>Haier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>자동 온도 조절 문화 발진기</td><td>ZHICHENG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>조직 파라핀 임베딩 기기</td><td>열</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;-80°C; C 초저온 냉장고</td><td>열</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;-20&deg; C 초저온 냉장고</td><td>Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>초순수 정화 시스템</td><td>ELGA</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>u>시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>동물 실험</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCG</td><td>시그마</td><td>9002-61-3</td><td></td></tr><tr><td>PMSG</td><td>시그마</td><td>14158-65-7</td><td></td></tr><tr><td>펜토바르비탈 나트륨</td><td>시그마</td><td>57-33-0</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐분해효소 I</td><td>Gibco</td><td>17018029</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>BD</td><td>354235</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>시그마</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>시그마</td><td>D0697</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>시그마</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500895</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Gibco</td><td>04-001-1ACS</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Gibco 35050087</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human FGF10</td><td>PeproTech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel (매트릭스 젤)</td><td>BD</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>쥐 Noggin</td><td>PeproTech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>쥐 Wnt3A</td><td>PeproTech</td><td>315-20</td><td></td></tr><tr><td>쥐 EGF</td><td>PeproTech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>R-spondin 1</td><td>PeproTech</td><td>120-38</td><td></td></tr><tr><td>트립신 억제제(TI)</td>Glycine max에서 유래한 <td>Sigma</td><td>T6522</td><td>는 트립신, 키모트립신 및 플라스미나제를 덜 억제할 수 있습니다. 1mg은 1.0-3.0mg의 트립신을 억제합니다.</td></tr><tr><td>트립신</td><td>시그마</td><td>&nbsp; T4799</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Selleck</td><td>S1049</td><td></td></tr><tr><td>HE 염색 & Immunostaining</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 당나귀 안티-마우스 IgG</td><td>Thermo</td><td>A-21202</td><td>사용 희석: IHC) 2 &mu; g/mL, (IF) 0.2 & g/mL</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 당나귀 안티 토끼 IgG Thermo</td><td></td><td>A-21206</td><td>사용 희석: (IHC) 2 &mu; g/mL, (IF) 2 & 뮤; g/mL</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 당나귀 안티 마우스 IgG</td><td>Thermo</td><td>A-10037</td><td>사용 희석: (IHC) 2 &mu; g/mL, (IF) 2 & 뮤; g/mL</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 당나귀 안티 토끼 IgG Thermo</td><td></td><td>A-10042</td><td>사용 희석: (IHC) 2 &mu; g/mL, (IF) 4 & 뮤; g/mL</td></tr><tr><td>Anti-AQP5 rabbit 항체</td><td>Abcam</td><td>ab104751</td><td>사용된 희석액: (IHC) 1 &mu; g/mL, (IF) 0.1 & g/mL</td></tr><tr><td>Anti-E-cadherin 쥐 항체</td><td>Abcam</td><td>ab11512</td><td>사용된 희석액: (IF)&nbsp; 5 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Anti-Keratin14 토끼 항체</td><td>Abcam</td><td>ab181595</td><td>사용된 희석액: (IHC) 1 &mu; g/mL, (IF) 2 & 뮤; g/mL</td></tr><tr><td>Anti-Ki67 토끼 항체</td><td>Abcam</td><td>ab15580</td><td>사용된 희석액: (IHC) 1 &mu; g/mL, (IF) 1 & 뮤; g/mL</td></tr><tr><td>Anti-mCherry 마우스 항체</td><td>Abcam</td><td>ab125096</td><td>사용된 희석액: (IHC) 2 &mu; g/mL, (IF) 2 & 뮤; g/mL</td></tr><tr><td>Anti-mCherry 토끼 항체</td><td>Abcam</td><td>ab167453</td><td>사용된 희석: (IF)&nbsp; 2 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>C6H8O7</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501702-0500</td><td></td></tr><tr><td>구연산</td><td>Sangon Biotech</td><td>201-069-1</td><td></td></tr><tr><td>DAB 키트(20x)</td><td>CWBIO</td><td>CW0125</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>BASO</td><td>68115</td><td></td></tr><tr><td>형광 장착 중간 Dako</td><td></td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Formalin</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501912-0500</td><td></td></tr><tr><td>염소 항-마우스 IgG 항체 (HRP)</td><td>Abcam</td><td>ab6789</td><td>사용 희석: 2 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>염소 anti-Rabbit IgG 항체(HRP)</td><td>Abcam</td><td>ab6721</td><td>사용 희석: 2 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>BASO</td><td>517-28-2</td><td></td></tr><tr><td>히스토겔(임베딩 하이드로겔)</td><td>Thermo</td><td>HG-400-012</td><td></td></tr><tr><td>30% H2O2</td><td>Guangzhou Chemistry</td><td>KD10</td><td></td></tr><tr><td>30% 과산화수소 용액</td><td>Guangzhou Chemistry</td><td>7722-84-1</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Guangzhou Chemistry</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Na3C6H5O7.2H2O</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501293-0500</td><td></td></tr><tr><td>Neutral balsam</td><td>SHANGHAI YIYANG YY-Neutral</td><td>balsam</td><td></td></tr><tr><td>Non-immunized Goat Serum</td><td></td><td>BOSTER AR0009</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Sangon Biotech</td><td>A601891-0500</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>DAMAO</td><td>200-001-8</td><td></td></tr><tr><td>당류</td><td>광저우 화학</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>구연산나트륨 삼염기성 이수화물</td><td>Sangon Biotech</td><td>200-675-3</td><td></td></tr><tr><td>자당</td><td>광저우 화학</td><td>IB11-AR-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.T.C. 화합물</td><td>SAKURA</td><td>SAKURA.4583</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>DINGGUO</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Guangzhou Chemistry</td><td>128686-03-3</td><td></td></tr><tr><td>RT-PCR & qRT-PCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>알코올</td><td>Guangzhou Chemistry</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>Guangzhou Chemistry</td><td>865-49-6</td><td></td></tr><tr><td>에티듐 브로마이드</td><td>Sangon Biotech</td><td>214-984-6</td><td></td></tr><tr><td>이소프로필 알코올</td><td>광저우 화학</td><td>67-63-0</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 SYBR Green I 마스터 믹스</td><td>Roche</td><td>488735200H</td><td></td></tr><tr><td>ReverTra Ace qPCR RT 마스터 믹스</td><td>TOYOBO-Taq</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>DNA 중합효소</td><td>TAKARA</td><td>R10T1</td><td></td></tr><tr><td>Goldview (핵산 stain)</td><td>BioSharp</td><td>BS357A</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Magen</td><td>R4801-02</td><td></td></tr><tr><td>Vector Construction & 세포 형질주입</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>OXID-Ampicillin</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Sigma</td><td>69-52-3</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Sigma</td><td>56-75-7</td><td></td></tr><tr><td>Endotoxin-free Plasmid 추출 키트</td><td>Thermo</td><td>A36227</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Sigma</td><td>25389-94-0</td><td></td></tr><tr><td>Lipo3000 Plasmid 트랜스펙션 키트</td><td>, Thermo</td><td>L3000015</td><td></td></tr>, <tr><td>LR 반응 키트</td><td>, Thermo</td><td>11791019</td><td></td></tr><tr><td>플라스미드 추출 키트</td><td>, TIANGEN</td><td>DP103</td><td></td></tr>, <tr><td>Trans5&alpha; 화학적으로 유능한 세포</td><td>TRANSGEN</td><td>CD201-01</td><td></td></tr><tr><td>Trytone</td><td>OXID-</td><td></td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>OXID-</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primers 및 순서</td><td>Company<</td><td></td><td></td></tr><tr><td>strong>Primer: AQP5 Sequence: F: CATGAACCCAGCCCGATCTT R: CTTCTGCTCCCATCCCATCC</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: &beta;-actin Sequence: F: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT R: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: Epcam Sequence: F: CATTTGCTCCAAACTGGCGT R: TGTCCTTGTCGGTTCTTCGG</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: Krt5 Sequence: F: AGCAATGGCGTTCTGGAGG R: GCTGAAGGTCAGGTAGAGCC</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: Krt14 Sequence: F: CGGACCAAGTTTGAGACGGA R: GCCACCTCCTCGTGGTTC</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: Krt19 Sequence: F: TCTTTGAAAAACACTGAACCCTG R: TGGCTCCTCAGGGCAGTAAT</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: Ltf Sequence: F: CACATGCTGTCGTATCCCGA R: CGATGCCCTGATGGACGA</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: Nestin Sequence: F: GGGGCTACAGGAGTGGAAAC R: GACCTCTAGGGTTCCCGTCT</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: P63 Sequence: F: TCCTATCACGGGAAGGCAGA R: GTACCATCGCCGTTCTTTGC</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vector</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pLX302 렌티바이러스 무부하 벡터</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pENRTY-mCherry</td><td>Xiaofeng Qin 실험실, Sun Yat-sen University</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

눈물샘 줄기세포를 위한 삼차원, 무혈청 배양 시스템

Three-Dimensional, Serum-Free Culture System for Lacrimal Gland Stem Cells

눈물샘 (LG) 줄기 세포 기반 치료는 눈물샘 질환에 대한 유망한 전략입니다. 그러나, 충분한 수의 LG 줄기세포(LGSCs)를 얻기 위한 신뢰할 수 있는 무혈청 배양 방법의 결여는 추가적인 연구 및 적용을 위한 하나의 장애물이다. 성인 마우스 LGSCs에 대한 3차원(3D), 무혈청 배양 방법이 잘 확립되어 여기에 도시되어 있다. LGSCs는 지속적으로 계대되고 acinar 또는 ductal-like 세포로 분화하도록 유도될 수 있었다.
LGSC 일차 배양을 위해, 6-8주령의 마우스로부터의 LGs를 디스파제, 콜라게나제 I 및 트립신-EDTA로 소화시켰다. 총 1 × 10개의 4개의 단일 세포를24 -웰 플레이트의 각 웰에 80 μL의 매트릭스 겔-눈물샘 줄기 세포 배지 (LGSCM) 매트릭스에 시딩하고, 20 μL의 매트릭스 겔-LGSCM 매트릭스로 예비코팅하였다. 혼합물을 37°C에서 20분 동안 인큐베이션한 후, 600 μL의 LGSCM을 첨가하여 고형화시켰다.
LGSC 유지를 위해, 7일 동안 배양된 LGSCs는 디스파아제 및 트립신-EDTA에 의해 단일 세포로 분해되었다. 상기 단세포는 LGSC 일차 배양에 사용된 방법에 따라 이식 및 배양하였다. LGSC는 40 회 이상 계대되고 줄기 / 선조 세포 마커 Krt14, Krt5, P63 및 네스틴을 지속적으로 발현 할 수 있습니다. LGSCM에서 배양된 LGSCs는 자기 재생 능력을 가지며 시험관내 및 생체내에서 아시나 또는 덕트형 세포로 분화할 수 있다.

3D, 무혈청 문화 시스템 구축 본 연구에서는 마우스 LGSC용 EGF, Wnt3A, FGF10 및 Y-27632를 포함하는 LGSCM을 개발하였고, LGSCs는 3D 배양법으로 성공적으로 분리 및 배양하였다(도 1A). C57BL/6 마우스, NOD/ShiLtJ 마우스, BALB/c 마우스 및 ROSA26mT/mG 마우스로부터의 LGSCs의 성공적인 3D, 무혈청 배양 시스템이 이 방법16을 사용하여 확립되었다. 수컷 마우스의 경우, 1.5-2 × 10개의6 개의 세포를 해리시킴으로써 2개의 LGs로부터 수득하였다. 배양 1주일 후, 배양 초기에 1 × 10개의 4개의 LG 세포를 시딩할 때 30-60개의 구가 형성되었다. 더욱이, 이 방법에 의해 배양된 세포는 Epcam, Krt5, Krt14, P63, nestin 및 기타 줄기세포 마...

성체 눈물샘(LG) 줄기세포를 위한 삼차원, 무혈청 배양 방법은 LG 오가노이드 형성의 유도 및 아시나 또는 덕트 유사 세포로의 분화를 위해 잘 확립되어 있다.

Lacrimal gland (LG) stem cell-based therapy is a promising strategy for lacrimal gland diseases. However, the lack of a reliable, serum-free culture ...

이 프로토콜은 눈물샘의 재생 및 재건을 위해 눈물샘 줄기 세포를 풍부하게하기위한 유리한 전략을 제공합니다. 눈물샘 줄기세포는 장기적인 확장 능력과 분화 가능성을 보여줍니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 눈물샘 줄기 세포의 배양 배지가 혈청이 없다는 것입니다.이 배지는 안락사 된 여섯 ~ 여덟 주 된 BALB / c 수컷 마우스를 얻고 귀 뒤의 피부를 절단하여 눈물샘과 그 주변의 결합 조직을 노출시킴으로써 눈물샘 복구에 엄청난 가치를 보여줍니다.핀셋의 도움으로 무딘 해부로 결합 조직을 벗겨 내고 눈물샘을 제거하십시오. 눈물샘을 75%에탄올 네 밀리리터와 함께 6센티미터 접시에 담그고 즉시 10밀리몰 PBS 용액으로 두 번 헹구십시오. 눈물샘을 약 한 밀리미터 입방체의 작은 조각으로 자릅니다.이들을 멸균 15 밀리리터 원심분리 튜브로 옮기고 섭씨 37도에서 1 시간 동안 밀리리터 디스파제 당 25 단위의 500 마이크로리터와 0.1 % 콜라게나제 I 500 마이크로리터로 조직을 처리한다. 눈물샘 절편을 섭씨 37도에서 10분 동안 0.05%트립신 EDTA 1밀리리터로 처리하고 반복적으로 피펫팅하여 단편을 단일 세포로 해리시킨다. 현탁액을 70마이크로미터 필터를 통해 여과하고, 필터를 멸균된 15밀리리터 원심분리 튜브에 넣고, 5분 동안 150배 G에서 원심분리한다.원심분리 후, 상층액을 제거하고, 세포 펠릿을 세척하기 위해 10 밀리리터의 10-밀리몰 PBS 용액을 첨가하고, 현탁액을 5분 동안 150배 G에서 원심분리한다. 세포 펠릿의 세척을 반복한다. 그런 다음 상층액을 제거하고 Dulbecco의 Modified Eagles Medium과 Ham's F-12의 1:1 비율의 1 밀리리터를 추가하여 세포 펠릿을 재현탁시킵니다.20 마이크로리터의 매트릭스 겔 눈물샘 줄기 세포 배지 매트릭스를 24-웰 플레이트의 웰 중앙에 첨가한다. 피펫 팁을 사용하여 직경이 약 여섯 ~ 8 밀리미터 인 원으로 확장하고 섭씨 37도에서 20 분 동안 혼합물을 인큐베이션하여 웰을 미리 코팅하십시오. 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 결정하고 40 마이크로 리터의 눈물샘 줄기 세포 배지 또는 LGSCM을 매트릭스 젤의 40 마이크로 리터에 총 10, 000 개의 세포와 함께 첨가하십시오.피펫으로 부드럽게 섞으십시오. 피펫을 사용하여 24-웰 플레이트의 각 웰에 있는 예비코팅된 영역 위에 80 마이크로리터의 혼합물을 조심스럽게 떨어뜨린다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

손상 조직을 사용 organoids 차 세포 배양은 다세포 생체 내 미세 환경을 모방 모델 시스템을 제공한다. 우리는 효소 조직을 중단하지 않고 형태를 차별화 혼합 세포 배양 계통 및 전시회를 영속 무 혈청 차 유방 상피 조직 배양 모델을 개발했다. 유방 organoids&gt;는 6 개월 가능한 남아있다.

비 효소, Mammospheres의 자연 발생에 대한 사전 침습 유방 병변의 혈청이없는 조직 문화

눈물샘 (LG)는 비전과 눈 건강을 유지하기 위해 필요한 눈물의 수성 부품을 생산하는 분기 기관이다. 여기에서 우리는 LG 개발에 참여 경로 신호 해독 쥐 LG 절제술 및 체외 배양 기술에 대해 설명합니다.

쥐의 눈물샘을 조작

여기 우리는 무 혈청 배아 체 (SFEB)라고 불리는 인간 유도 다 능성 줄기 세포 (hiPSCs)로부터 3 차원 (3-D) 시스템을 개발하기위한 프로토콜을보고합니다. 이 3-D 모델은 인간 피질 발달을 모델로하고 신경 회로를 개발하는 생리 학적 심문을 위해 장기 유형의 슬라이스 문화처럼 사용될 수 있습니다.

생리 학적으로 적합한 분석법을 사용하여 3 차원 줄기 세포 배양 물의 심문을위한 HiPSC 파생 혈청 무 세포 배아 체 개발

이 프로토콜은 이종-및 피더 세포 무료 문화 조건 하에서 인간의 pluripotent 줄기 세포에서 각 막 limbal 상피 줄기 세포를 분화 하는 간단한 2 단계 방법을 소개 합니다. 여기에 제시 된 셀 문화 방법 각 막 세포 치료 이용에 적용 가능한 임상 질 세포의 비용 효율적인, 대규모 생산...

임상 호환 막 Limbal 상피 줄기 세포 인간 만능 줄기 세포에서의 효율적이 고 확장 가능한 감독된 차별화

이 프로토콜은 정의된 배양 시스템 및 세포 자가 조립을 사용하여 인간 다능성 줄기 세포로부터 간구를 생성하는 접근법을 기술한다. 이 프로토콜은 다수의 세포주에서 재현가능하고 비용 효율적이며 생체 의학 적용을 위한 안정적인 인간 간구의 생산을 허용합니다.

다능성 줄기 세포에서 3차원 인간 간구의 혈청 무료 생산

이 프로토콜은 일차 마우스 및 인간 조직에서 유래한 눈물샘 오가노이드를 확립, 유지, 유전적으로 변형, 분화, 기능적으로 특성화 및 이식하는 방법을 설명합니다.

마우스 및 인간 눈물샘 오가노이드의 확립, 유지, 분화, 유전자 조작 및 이식

여기에서는 지방 유래 줄기 세포(ADSC) 배양을 위한 3차원(3D) 세포 배양 프레임워크로 하이드로겔을 사용하는 방법을 시연하고 3D 배양 환경 내에서 ADSC의 증식을 향상시키기 위해 광생물 조절(PBM)을 도입하는 프로토콜을 제시합니다.

광생물조절 증강을 이용한 하이드로겔 내 지방 유래 줄기세포의 3차원 세포 배양

이 프로토콜은 노화 마우스 눈물선을 해리하여 단일 세포 RNA 시퀀싱을 위한 생존 가능한 단일 세포를 얻는 최적화된 방법을 설명합니다. 순차적 효소 소화와 부드러운 취급은 세포의 무결성을 유지하여, 세포 유형 특이적 분리 및 노화 관련 눈물샘 변화의 전사체 분석에 적합한 고품질 현탁액을 생성합니다.

노령 눈물 및 침샘에서 단세포 해리, RNA 시퀀싱 및 노령 분수선에서 근상피세포 및 섬유아세포 분리 프로토콜

우리는 마이크로 bioreactors에서 세포의 3 차원 배양을위한 칩 기반의 플랫폼을 설명합니다. 하나의 칩 10 미오 최대 집 수 있습니다. 멸균, 폐쇄 순환 루프에서 유체 흐름, 산소 장력 등에 관한 정확하게 정의된 조건 하에서 재배 세포 수 있습니다.

Perfused 마이크로 bioreactors의 칩 기반의 입체 세포 배양

인간의 혈소판 lysate 성장 요인 풍부한 소스와 세포 배양에서 강력한 보충이다. 이 프로토콜은, 혈소판 풍부 혈장부터 몇 동결 - 해동 사이클을 수행하고 혈소판 조각을 파괴하여 인간의 혈소판 lysate의 큰 수영장을 준비하는 과정을 보여줍니다.

동물 세럼 - 무료 인간 줄기 세포 배양을위한 효율적인 보충으로 풀링 인간 혈소판 Lysate (pHPL)의 준비

배우세요 눈물샘 줄기세포의 무혈청 3차원 배양 시스템을 이용한 장기간 증식 및 분화 유도 방법. 이 기술은 눈물샘 재생 및 수술 복원 연구에 필수적인 모델을 제공합니다.

눈물샘 줄기세포를 위한 삼차원, 무혈청 배양 시스템

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