Name: 발달 중인 (개구리) 배아의 세포 계통 유도 질량 분석법 단백질체학 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: 학습하세요 Xenopus laevis 배아의 계열 유도 질량 분석법 단백질체학을 통해 발달 생물학 연구를 수행하는 방법을. 이 기술은 조직 유도와 세포 운명 결정 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

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배아 해리 및 FACS에 대한 귀중한 토론을 해주신 Jie Li (University of Maryland, College Park)에게 감사드립니다. 이 프로토콜에서 강조된 단백질체학 응용 분야를 예시하는 이전 연구에서 샘플 준비 및 데이터 수집에 도움을 준 Vi M. Quach와 Camille Lombard-Banek에게 감사드립니다. 이 연구의 일부는 수상 번호 IOS-1832968 CAREER(PN으로), 국립 보건원(National Institutes of Health)에서 수상 번호 R35GM124755(PN), 메릴랜드 대학교-국립 암 연구소 파트너십 프로그램(PN) 및 COSMOS Club Foundation 연구 상(ABB 및 LRP)의 지원을 받았습니다.

저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.

이 프로토콜은 Xenopus 종의 배아에서 확인된 세포 계통에서 단백질 발현의 특성화를 가능하게 합니다. HRMS에서 비롯된 이 방법론은 분자 식별의 정교한 특이성, 분자 프로브 없이 다중 단백질 검출 기능(일반적으로 수백에서 수천 개의 서로 다른 단백질) 및 정량 기능을 결합합니다. 세포 및 발달 (신경) 생물학의 고전적인 도구 및 워크플로우에 대한 적응성은 척추동물 X. laevis 배아에서 줄기 세포 분화의 전체론적 특성 분석을 포함하여 HRMS 단백질체학을 흥미로운 응용 분야로 확장합니다.
이 단계는 X. laevis 배아의 세포 계통 유도 단백질체학을 설명합니다. 예를 들어, 우리는 신경 운명 단일 세포와 그 계통의 분석을 시연하고 공개 데이터 저장소를 통해 해당 CE 및 nanoLC HRMS 데이터 세트를 제공합니다(PROUD 참조). 이 접근법은 여러 세포 유형(및 계통)에서 단백질의 시공간 조절에 대한 연구에 쉽게 적...

세포 분화와 조직 및 기관의 기원에 대한 우리의 이해는 수십 년 동안 유전자와 그 산물에 대한 정교한 표적 스크리닝의 결과입니다. 중요한 세포 사건 동안 모든 생체 분자와 그 양에 대한 지식을 늘리면 척추 동물 신체 계획의 공간적 및 시간적 패턴을 제어하는 분자 메커니즘을 밝히는 데 도움이 될 것입니다. 분자 증폭 및 시퀀싱을 가능하게 하는 기술은 이제 많은 수의 유전자와 전사체에 대해 일상적으로 보고할 수 있어 기초 생물학 및 중개 연구에서 가설 기반 연구를 지원합니다. 개발 중인 시스템을 이해하기 위해 전사와 번역 간의 복잡한 관계는 여러 단백질의 직접 분석과 번역 후 변형을 지지합니다. 유도만능줄기세포와 같은 시험관 내 생물학적 시스템을 사용하는 글로벌 단백질체학은 조직 유도 1,2의 메커니즘을 설명하기 시작했습니다. 척추동물 배아와 같은 복잡한 유기체에서 발달은 공간과 시간의 맥락에서 모르포겐 구배에 의존한다3. 따라서 세포가 분화하여 신경 조직과 같은 특수 조직을 형성함에 따라 단백질체학적 변화에 대한 지식을 얻는 것은 정상 및 결함 발달을 제어하는 분자 프로그램을 잠금 해제하고 차세대 치료법을 안내하는 열쇠를 제공합니다.
척추동물 남아프리카 발톱 개구리(Xenopus laevis)는 세포 및 발달, 신경 및 재생 생물학에서 잘 확립된 모델입니다. 체세포의 다능성 발견에 대한 John Gurdon 경의 2012년 노벨 생리의학상 4,5는 기초 및 중개 연구의 발견에 대한 이 모델의 중요성을 강조했습니다. Xenopus 배아는 모체 외부에서 발달하여 다양한 발달 단계에서 세포, 세포 클론 및 유전자 발현의 직접적인 조작을 용이하게 합니다. 비대칭 색소 침착과 고정 관념의 세포 분열은 16-6 및 32 세포 7,8 단계 배아에서 재현 가능한 운명지도의 차트를 가능하게했습니다. 고분해능 질량분석법(HRMS) 기반 단백질체학의 경우, 이 모델의 추가적인 장점은 분석을 위한 풍부한 단백질 함량을 산출하는 비교적 큰 크기(직경 ~1mm)를 포함합니다(초기 절단 단계 배아에서 ~130μg, 16세포 배아의 단일 세포에서 ~10μg의 단백질 함량)9,10.
현재 HRMS는 단백질 검출을 위한 선도적인 기술입니다. 이 기술은 일반적으로 수백에서 수천 개의 서로 다른 단백질을 직접적이고 민감하며 특이적으로 검출하고 정량화할 수 있게 한다11. HRMS에 의한 상향식 단백질체학은 일련의 상호 연결된 단계를 포함합니다. 세포/조직 샘플에서 추출한 후 단백질은 트립신(상향식 단백질체학)과 같은 단백질 분해 효소로 분해됩니다. 생성된 펩타이드는 소수성(reversed-phase liquid chromatography, LC), 순 전하(ion-exchange chromatography), 크기(size exclusion chromatography) 또는 전기영동 이동도(capillary electrophoresis, CE)를 포함한 다양한 물리화학적 특성에 따라 분리됩니다. 그런 다음 펩타이드는 일반적으로 전기분무 이온화(ESI)를 사용하여 충전(이온화)되며, 탠덤 HRMS에 의한 기체상 단편화를 통해 펩타이드 이온이 검출 및 시퀀싱됩니다. 결과 펩타이드 데이터는 연구 중인 유기체의 프로테옴에 매핑됩니다. 농도와 상관관계가 있는 단백질 특이적(proteotypic) 펩타이드 이온 신호 강도를 이용하여, 단백질 정량화는 비표지 또는 표지 기반(multiplexing quantitation)으로 수행될 수 있다. HRMS 단백질체학은 연구 중인 시스템의 분자 상태에 대한 풍부한 정보 리소스를 제공하여 가설 생성 및 후속 기능 연구를 가능하게 합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63586/63586fig01v2.jpg"> 그림 1: 발달 중인 (개구리) 배아에서 세포 계통 유도 HRMS 단백질체학을 가능하게 하는 시공간적으로 확장 가능한 단백질체학. (A) 평행 전단 (4)에 의해 제어되는 제작된 마이크로피펫 (3)을 사용하여 확인된 세포(삽입물)의 주입을 위한 실체현미경(2)을 이용한 표본 (1)의 가시화. (B) 16-세포 배아에서 확인된 왼쪽D11 세포의 세포하 샘플링. (C) 16-세포 배아로부터 전체D11 세포의 해부. (D) 32세포 배아에서 왼쪽 및 오른쪽 D111 자손의 형광(녹색) 추적으로 위스트룰라에서 신경 외배엽(NE)의 해부(10단계) 및 FACS를 사용하여 올챙이에서 자손 조직 분리를 안내합니다. 스케일 바: 배아의 경우 200μm, 바이알의 경우 1.25mm. 수치는 참고 문헌 15,19,21,59의 허가를 받아 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63586/63586fig01largev2.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
여기에 제시된 프로토콜은 발달 중인 X. laevis 배아에서 확인된 세포/조직에서 많은 수의 단백질에 대한 HRMS 기반 정량화를 가능하게 합니다. 이 접근법은 정확한 세포 식별, 재현 가능한 세포 운명 지도 및 이 생물학적 모델 6,7,8에서 세포 계통을 추적하기 위한 확립된 방법론을 기반으로 합니다. 그림 1에서 볼 수 있듯이, 우리는 세포 내용물을 흡인하기 위해 전체 세포 해부 또는 모세관 마이크로 샘플링을 사용하여 단일 세포에서 프로테옴을 연구합니다. 세포의 혈통을 모니터링하면 세포가 위장 중에 조직을 형성함에 따라 프로테옴의 시공간 진화를 연구할 수 있습니다. 세포 자손은 형광 단백질(예: 녹색 형광 단백질 또는 GFP)에 대해 불활성 덱스트란 또는 mRNA에 접합된 형광단을 주입하여 형광을 표시합니다. 표지된 자손은 원하는 발달 시점에서 분리됩니다. gastrulation 동안, 단단히 클러스터링된 세포 클론은 해부에 의해 분리될 수 있습니다. 위축 후, 세포 클론은 이동 운동으로 인해 배아 내에 분포할 수 있으며 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 의해 해리된 조직에서 분리될 수 있습니다. 이러한 세포 및 조직의 단백질은 분리를 위해 HPLC 또는 CE를 사용하고 식별을 위해 ESI 탠덤 HRMS를 사용하는 상향식 단백질체학을 통해 측정됩니다. 세포 계통 유도 HRMS 단백질체학은 배아 내에서 다양한 세포 크기와 계통으로 확장 가능하며 특이적이고 민감하며 정량적입니다. 여기에 표시된 선별된 예를 통해 이 프로토콜이 다양한 유형의 세포 및 세포 계통에 확장 가능하고 광범위하게 적응할 수 있음을 보여줍니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63586/63586fig02.jpg"> 그림 2: 바이오분석 워크플로우. 미세 해부 및 모세관 흡인 또는 FACS는 세포 및 클론 단백질 함량의 샘플링을 용이하게 했습니다. 풍부한 난황 단백질의 고갈 및 모세관 전기영동(CE) 또는 나노 유동 액체 크로마토그래피(LC)에 의한 분리는 전기분무 이온화(ESI) 고분해능 질량분석법(HRMS)을 사용하여 식별(ID) 감도를 향상시킵니다. 정량화는 유전자 온톨로지(GO)에서 사용할 수 있는 정보와 함께 가설 기반 연구를 위한 새로운 정보를 제공하는 조절 장애를 드러냈습니다. 수치는 참고 문헌15의 허가를 받아 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63586/63586fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>아세토니트릴(LC-MS 등급)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955</td><td></td></tr><tr><td>아가로스</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0492</td><td></td></tr><tr><td>중탄산암모늄</td><td>Fisher Scientific</td><td>A643-500</td><td></td></tr><tr><td>분석 컬럼</td><td>Thermo Scientific</td><td>164941</td><td></td></tr><tr><td>분석 마이크로저울</td><td>Mettler-Toledo</td><td>XSE105DU</td><td></td></tr><tr><td>자동 펩타이드 분획 플랫폼</td><td>: Agilent</td><td>1260 Infinity II</td><td></td></tr>, <tr><td>붕규산 모세 필라리</td>, <td>Sutter Instruments Co.</td><td>B100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>붕규산 모세 필러리(이미터 제조용)</td><td>Sutter Instruments</td><td>B100-75-10</td><td></td></tr><tr><td>C18 스핀 컬럼(탈염용)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>89870</td><td></td></tr><tr><td>카메라 및 모니터 전기 스프레이</td><td>Edmund Optics Inc.</td><td>EO-2018C</td><td></td></tr><tr><td>Combretastatin A4</td><td>Millipore Sigma</td><td>C7744</td><td></td></tr><tr><td>상업용 CESI 시스템</td><td>AB SCIEX</td><td>CESI</td><td></td></tr><tr><td>(Cyclohexylamino)-1-propanesulfonic acid (CAPS)</td><td>VWR</td><td>97061-492</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasin D</td><td>Millipore Sigma</td><td>C8273</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Alexa Fluor 488; 10,000 MW, 음이온성, 고정성</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D22910</td><td></td></tr><tr><td>Diothiothreitol</td><td>Fisher Scientific</td><td>FERR0861</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 펜치</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ62786AP</td><td></td></tr><tr><td>Epifluorescence 광원</td><td>Lumencore</td><td>AURA III</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf LoBing 마이크로 원심분리기&nbsp; 튜브: 단백질</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-698-793</td><td></td></tr><tr><td>포름산 (LC-MS 등급)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A117-50</td><td></td></tr><tr><td>냉동고 (-20 &deg; C)</td> <td>피셔 사이언티픽</td><td>97-926-1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>냉동고 (-80 &deg; C)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>TSX40086A</td><td></td></tr><tr><td>용융 실리카 모세관</td><td>Molex</td><td>1088150596</td><td></td></tr><tr><td>Heat Block</td><td>벤치 마크</td><td>BSH300</td><td></td></tr><tr><td>고압 액체 크로마토 그래피 시스템</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Dionex Ultimate 3000 RSLC 나노 시스템</td><td></td></tr><tr><td>고전압 전원 공급</td><td>장치 Spellman</td><td>CZE1000R</td><td></td></tr><tr><td>고분해능 질량분석기</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 질량분석기</td><td></td></tr><tr><td>HPLC caps</td><td>Thermo Scientific</td><td>C4013-40A</td><td></td></tr><tr><td>HPLC 바이알</td><td>Thermo Scientific</td><td>C4013-11</td><td></td></tr><tr><td>조명기 예: 구즈넥</td><td>Nikon</td><td>C-FLED2</td><td></td></tr><tr><td>Ingenuity Pathway Analysis</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>요오드아세트아미드</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC122275000</td><td></td></tr><tr><td>메탄올 (LC-MS 등급)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A456</td><td></td></tr><tr><td>메탄올 (LC-MS 등급)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A456-4</td><td></td></tr><tr><td>마이크로모세관 풀러</td><td>서터 기기</td><td>P-2000</td><td></td></tr><tr><td>마이크로인젝터</td><td>워너 기기, Handem, CT</td><td>PLI-100A</td><td></td></tr><tr><td>마이크로피펫 풀러</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>MS 데이터 분석 소프트웨어, 상용</td><td>ProteomeDiscoverer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MS 데이터 분석 소프트웨어, 오픈 소스</td><td>MaxQuant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>non-idet 40 대체</td>품 <td>Millipore Sigma</td><td>11754599001</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 60mm 및 80mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>S08184</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 10 &micro; L 침대 지퍼 팁(탈염용)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>87782</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 비신코닌산 단백질 분석 키트</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 정량 비색 펩타이드 분석</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23275</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 트립신 프로테아제(MS 등급)</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI90058</td><td></td></tr><tr><td>단백질 LoBind 바이알</td><td>Eppendorf</td><td>0030108434 , 0030108442</td><td></td></tr><tr><td>냉장 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5430R</td><td></td></tr><tr><td>냉장 인큐베이터</td><td>Thermo Scientific</td><td>PR505755R/3721</td><td></td></tr><tr><td>이세티오네이트 나트륨</td><td>밀리포어 밀리포어 시그마</td><td>220078</td><td></td></tr><tr><td>피로인산나트륨</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221368-100G</td><td></td></tr><tr><td>스테인리스 스틸 BGE 바이알</td><td></td><td></td><td></td>맞춤형</tr><tr><td>스테인리스 스틸 샘플 바이알</td><td>맞춤형</td><td></td><td></td></tr><tr><td>스테레오현미경 (목표 10x)</td><td>Nikon</td><td>SMZ 1270, SZX18</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>VWR</td><td>97063-790</td><td></td></tr><tr><td>주사기 펌프 (2)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>704506</td><td></td></tr><tr><td>Syringes (gas-tight): 500&ndash; 1000 &마이크로; L</td><td>Hamilton</td><td>1750TTL</td><td></td></tr><tr><td>트랜스퍼 피펫 (플라스틱, 일회용)</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>트랩 컬럼</td><td>Thermo Scientific</td><td>164750</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (1 M 용액)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ22638AP</td><td></td></tr><tr><td>진공 농축기 4&ndash에서 작동 가능; 10 > C</td><td>Labconco</td><td>7310022</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-mixer</td><td>벤치마크</td><td>BS-VM-1000</td><td></td></tr><tr><td>물(LC-MS 등급)</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6</td><td></td></tr><tr><td>물(LC-MS 등급)</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6</td><td></td></tr><tr><td>XYZ 번역 스테이지</td><td>Thorlabs</td><td>PT3</td><td></td></tr><tr><td>XYZ 번역 스테이지</td><td>맞춤형 제작</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

발달 중인 (개구리) 배아의 세포 계통 유도 질량 분석법 단백질체학

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing (Frog) Embryo

세포가 조직과 기관을 생성함에 따라 분자 사건의 특성화는 정상적인 발달을 더 잘 이해하고 질병에 대한 효율적인 치료법을 설계할 수 있는 잠재력을 높입니다. 다양한 유형과 많은 수의 단백질을 정확하게 식별하고 정량화할 수 있는 기술은 공간과 시간에서 조직과 유기체 발달을 조율하는 분자 메커니즘에 대한 정보를 여전히 제공하지 못할 것입니다. 여기에서 우리는 Xenopus laevis (개구리) 배아에서 확인된 세포 계통에서 수천 개의 단백질을 측정할 수 있는 질량 분석 기반 프로토콜을 제시합니다. 이 접근법은 재현 가능한 세포-운명 지도와 이 척추동물 발달 모델에서 세포와 그 자손(클론)을 식별, 형광 표지, 추적 및 샘플링하는 확립된 방법을 기반으로 합니다. 마이크로 샘플링을 사용하여 세포 내용물을 수집하거나 해부 또는 형광 활성화 세포 분류를 통해 세포를 분리한 후 단백질을 추출하고 처리하여 상향식 단백질체학 분석을 수행합니다. 액체 크로마토그래피 및 모세관 전기영동은 고분해능 질량분석법(HRMS)을 통해 단백질 검출 및 정량화를 위한 확장 가능한 분리를 제공하는 데 사용됩니다. 대표적인 예가 신경-조직 운명 세포의 프로테오믹 특성화에 대해 제공된다. 세포 계통 유도 HRMS 단백질체학은 다양한 조직과 유기체에 적용할 수 있습니다. 척추동물 발달 동안 프로테옴의 시공간적 역학을 들여다보기에 충분히 민감하고 구체적이며 정량적입니다.

이 프로토콜은 단일 세포에서 단백질과 X. laevis 배아에서 조직을 확립할 때 그 계통에 대한 연구를 가능하게 했습니다. 그림 1은 신경-조직 운명 세포와 배아에서 새로 유도된 신경 외배엽에서 단백질을 연구하기 위한 접근 방식의 이러한 적용 중 하나를 보여줍니다. 그림 1A에서 볼 수 있듯이 생물 분석 워크플로는 세포를 식별, 주입/흡인하고 표본을 수집하기 위해 세포 및 발달 생물학의 전통적인 도구를 통합했습니다. 도 1B는 마이크로인젝터를 사용하여 생체 내에서 좌측 등쪽 동물(D11) 세포 16-세포 배아의 마이크로프로브 샘플링을 도시한다; 실험 후, 배아는 정상적인 해부학적 56을 가진 올챙이로 성공적으로 발달했습니다. 큰 배아 세포(직경 ~100-250μm)도 수동 미...

여기에서 우리는 척추동물 Xenopus laevis 배아에서 알려진 조직 운명을 가진 세포 계통의 질량 분석 기반 단백질체 특성 분석을 설명합니다.

Characterization of molecular events as cells give rise to tissues and organs raises a potential to better understand normal development and design ...

이 계통 유도 접근 방식은 척추동물 배아 내의 공간적 및 시간적 분해능을 통해 중요한 발달 사건의 단백질체 분석을 가능하게 하여 전체 배아 측정을 통해 접근할 수 없는 정보를 전달합니다. 이 접근법은 발달 중에 분화되는 다양한 배아 세포의 단백질, 대사 산물 및 전사체를 연구하기 위해 쉽게 확장될 수 있습니다. 이 방법은 초기 발달 동안 조직 유도 및 세포 운명 헌신 메커니즘을 포함하여 정상 및 질병 발달을 제어하는 분자 메커니즘에 대한 이해를 높일 수 있습니다.헤어 루프를 사용하여 각 배아를 우물로 안내하고 관심 대상 세포가 마이크로니들과 직각이 되도록 부드럽게 배치합니다. xenopus laevis 조직 운명 지도를 따라 관심 계통의 전구체 세포를 식별합니다. 두 개의 날카로운 집게를 사용하여 배아를 둘러싼 vitelline 막을 부드럽게 제거합니다.집게를 사용하여 수동 해부로 배아에서 단일 세포를 분리합니다. 먼저 계보 추적 용액이 들어 있는 주사 바늘을 설정합니다. 미세 주입 바늘을 다축 마이크로 매니퓰레이터로 제어되는 마이크로 피펫 홀더에 장착합니다.마이크로 피펫 홀더를 마이크로 인젝터에 연결하고 부압을 가하여 리니지 트레이서로 바늘을 채웁니다. 바늘을 보정하고 바늘 끝의 크기와 주입 시간을 조정하여 미네랄 오일에서 측정된 약 1나노리터의 계보 추적 용액을 전달합니다. 주입되는 액적 크기가 정확한지 확인하고 필요한 경우 인젝터 설정을 조정합니다.미세주입 점토 접시에 3%fCAL 용액을 채우고 이식 피펫을 사용하여 약 10개의 배아를 점토 접시에 옮깁니다. 관심 세포에 약 1나노리터의 형광 덱스트란 또는 200피코그램의 GFP mRNA를 주입합니다. 실체 현미경을 사용하여 세포 라벨링의 성공 여부를 확인합니다.의도한 세포만 주입되었는지 확인합니다. 손상되었거나 잘못 라벨링된 세포가 포함된 배아는 제도적 정책에 따라 폐기합니다. 주입된 배아를 0.5x Steinberg 용액이 들어 있는 페트리 접시에 옮깁니다.원하는 발달 단계에 도달할 때까지 섭씨 14도에서 25도 사이에서 배양하십시오. 3-5개의 배아를 미세 해부를 위해 0.2x Steinberg 용액이 들어 있는 한천 접시에 옮깁니다. 집게를 사용하여 배아에서 표지된 클론을 해부합니다.0.5-10 마이크로 리터 피펫으로 해부 된 조직을 수집하여 마이크로 원심 분리기 파일에 넣습니다. 피펫을 사용하여 수집된 조직을 둘러싼 배지를 흡인하여 HRMS 분석에 방해가 되지 않도록 시료의 염분을 제한합니다. 샘플 바이알을 드라이아이스 또는 액체 질소에 올려 놓아 분리된 세포를 즉시 동결합니다.질량 분석 분석이 있을 때까지 샘플을 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. CE에 의한 단일 세포 샘플 처리의 경우 샘플을 약 15분 동안 섭씨 60도로 가열하여 단백질을 변성시킵니다. 그런 다음 샘플을 실온에서 5분 동안 평형화하고 소화를 위해 샘플에 트립신을 첨가합니다.NanoLC에 의한 분석을 위해 50마이크로리터의 용해 완충액에서 최대 5개의 해부된 조직을 용해합니다. 시료를 위아래로 피펫팅하여 공정을 용이하게 합니다. 해부된 조직을 처리하기 위해 용해물을 섭씨 4도에서 10분 동안 배양합니다.그런 다음 세포 파편과 노른자 혈소판을 섭씨 4도에서 4, 500 RCF에서 중심화하여 펠릿화합니다. 상청액을 깨끗한 마이크로 원심분리기 바이알에 옮기고 10% SDS를 첨가하여 용해물에서 1% SDS의 최종 농도를 얻습니다. 조직의 경우 용해물에 0.5몰 디티오트레이톨을 첨가하여 약 25밀리몰의 최종 농도를 얻습니다.그런 다음 용해물을 섭씨 60도에서 30분 동안 배양하여 단백질의 이황화 결합을 화학적으로 감소시킵니다. 0.5몰 요오도아세트아미드를 첨가하여 용해물에 약 75밀리몰의 최종 농도를 얻고 혼합물을 실온에서 암실에서 15분 동안 인큐베이션합니다. 초기 부피와 동일한 0.5 몰의 디티오트레이톨을 첨가하여 알킬화 반응에서 남은 반응물을 소멸시킵니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 하룻밤 동안 아세톤에 단백질을 침전시키고 0.5몰 중탄산암모늄으로 재구성합니다. 시료 분해를 위해 트립신을 첨가하고 바이알을 섭씨 37도에서 배양합니다. CE를 사용하여 펩타이드를 분리하기 위해, 1 내지 2 마이크로리터의 샘플 용매에서 분해된 단백질을 재구성한다.혼합된 샘플을 섭씨 4도에서 2분 동안 10, 000 RCF에서 원심 융합하여 세포 파편을 펠렛화합니다. CE 모세관을 BGE로 세척하여 CE-ESI 기기를 초기화합니다. 1 마이크로 리터의 샘플을 샘플 바이알에 넣고 유체 역학 주입에 의해 1-10 나노 리터의 샘플을 CE 분리 모세관에 주입합니다.CE 분리 모세관의 입구 끝을 BGE로 옮깁니다. 접지에서 CE 분리 전압을 점진적으로 램핑하여 전기 영동 분리를 시작합니다. 10 마이크로 암페어 미만의 전류에서 20 - 28 킬로볼트의 전위는 분석을 위한 안정적이고 재현 가능한 기기 성능을 보장합니다.Nano LC를 사용하여 분리하려면 이동상 A.The 샘플의 농도와 주입 부피가 사용 가능한 LC 시스템 및 컬럼에 따라 달라지므로 펩타이드 샘플을 다시 중단합니다. 샘플을 LC 바이알에 옮깁니다. 약 200 나노그램에서 2 마이크로 그램의 펩타이드 샘플을 C18 분석 컬럼에로드하고 텍스트 원고에 설명 된대로 그래디언트 용출을 사용하여 분당 300 나노 리터의 유속으로 펩타이드를 분리합니다.카메라를 사용하여 전기 스프레이 방출기를 통한 액체 흐름을 확인하고 누출 가능성이 있는지 설정을 육안으로 검사합니다. 질량 분석 이벤트를 획득하고 텍스트 원고에 설명된 대로 펩타이드를 시퀀싱합니다. CE-ESI-HRMS를 사용하여 상이한 배아에서 해부된 D11 세포 간에 유전자 번역 차이가 검출되었습니다.계통-표지된 해부된 세포 클론을 LC-HRMS에 의해 분석하였다. 단백질의 경로 분석은 신경외배엽이 있는 Spemann의 조직자에서 상향 조절된 단백질 번역 및 에너지 대사를 보여주었습니다. 신경 외배엽 prodeum은 세포 내 단백질 화물의 핵 수송과 관련된 단백질이 풍부했으며, 이는 신호 전달 후 다운스트림 사건을 나타낼 가능성이 있습니다.분자 기능의 농축 분석은 번역 개시, RNA 결합 및 프로테아좀 복합체의 결합에서 상향 조절을 나타내었으며, 이는 Spemann의 조직자를 개발하는 동적 단백질 회전율에 대한 역할을 시사합니다. 이 프로토콜에 대해 고정형 배아만 선택하여 재현성과 결과 해석을 개선합니다. 해부된 조직은 바이알에 옮겨 완충액염으로 인한 오염을 최소화하기 위해 가능한 한 최소한의 배지 완충액을 함유한 즉시 냉동해야 합니다.이 접근법을 통해 우리는 확인된 세포의 단백질 역학과 살아있는 배아의 세포 계통을 연구할 수 있었습니다. 발달 중인 조직에서 중요한 단백질의 공간적 시간 생산에 대해 얻은 새로운 정보를 통해 생물학적 기능을 평가하기 위한 표적 실험을 설계할 수 있었습니다.

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Research

연구

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Xenopus 배아 상피 조직은 상피 morphogenesis 동안 극성 개발 및 형태의 변화와 같은 세포 행위를 연구하는 이상적인 모델 시스템입니다. 고정 샘플 전통 조직학 점점 라이브 셀 이미징 공촛점에 의해 보완되고있다. 여기 개구리 조직을 분리 및 라이브 세포 공촛점 현미경을 사용하여 라이브 상피 세포 및 cytoskeleton을 시각화하는 방법을 보여줍니다.

라이브 셀 이미징 및 배아 상피 세포의 정량 분석 Xenopus laevis</em

개인 배아 세포의 운명은 상속 분자 및 / 또는 주변 세포의 신호에 의해 영향을받을 수 있습니다. 절단 단계 Xenopus의 배아의 운명지도 활용 한 blastomeres는 세포 세포의 상호 작용 비해 상속 분자의 공헌을 평가하기 위해 격리 문화 식별 할 수 있습니다.

Blastomere Explants는 배아 개발하는 동안 세포 운명의 헌신에 대해 테스트 할

방법 염색질 규제 및 염색질 상태의 문제는 생체 내에서 유전자가 세포 운명 결정이 배아에서 어떻게 만들어 지는지 초기에 대한 우리의 이해의 열쇠입니다 영향을 미칩니다. 칩 서열 번호 - 글로벌 수준입니다 Xenopus의 배아 여기 설명에서 크로 마틴의 기능을 조사하기 가장 인기있는 방법.

염색질 레귤레이터 및 미국에서의 게놈 전체의 스냅 샷<em&gt; 아프리카 발톱 개구리</em칩 서열 번호&gt; 태아

원고는 여기 Xenopus의에서 찬란 태그 리간드의 분비 및 확산을 분석하는 방법의 간단한 세트를 제공합니다. 이는 리간드 분포를 수정하는 다른 단백질의 능력을 시험하고 morphogen 기울기 조절 메커니즘에 대한 통찰력을 제공 할 수 있도록 실험을위한 컨텍스트를 제공한다.

공 촛점 분석을 사용하여<em&gt; 아프리카 발톱 개구리 laevis의</em&gt;의 Wnt 및 쉬 Morphogen 그라디언트의 변조기를 조사하기 위해

이 프로토콜은 마우스 착상 전 배아 계통 명세서를 연구하는 단백질 발현의 정량적 분석 시츄, 단일 셀을 수행하는 방법을 제시한다. 포배의 수집에 필요한 절차, 단백질의 면역 검출을 전체 마운트, 공 초점 현미경, 핵 세분화 및 이미지 분석에 샘플 영상은 설명한다.

단백질 발현의 정량 분석​​은 마우스 착상 전의 배아에서 리니지 사양을 공부하기

우리는 빠른 시내 현장 샘플링의 높은 정밀도와 최소한의 침공에 신진 대사 활동의 스냅샷의 화학 특성을 촉진 하기 위하여 모 세관 기반 마이크로-샘플링를 사용 하 여 개별 셀의 작은 부분을 사용할 수 있는 단계를 설명 배아를 사용자 단일 셀 모 세관 전기 이동 법 질량 분석 플랫폼을 사용 하 여 라이브.

단일 셀 대사체학 라이브 개구리 (Xenopus laevis) 배아에 대 한 현미경 모 세관 전기 이동 법 질량 분석

여기에서 우리는 마우스 배아 조직에서 유전자 발현을 프로파일링하는 다중단일 세포 mRNA 염기서열 분석방법을 제시했다. 멀티플렉싱 전략과 결합된 액적 기반 단일 세포 mRNA 염기서열 분석(scRNA-Seq) 방법은 여러 샘플에서 단일 세포를 동시에 프로파일링할 수 있어 시약 비용을 크게 줄이고 실험 배치 효과를 최소화합니다.

마우스 배아 세포의 다중화 단세포 mRNA 염기서열 분석

우리는 형광 칼슘 화상 진찰을 계면 혼성화에서 결합하는 2개의 부분 프로토콜을 제시합니다, 실험자가 단하나 세포 수준에 유전자 발현 단면도와 칼슘 활동의 패턴을 상호 연관시키는 것을 허용하.

제노푸스 라에비스의 신경 전구체 특성화를 위한 형광 칼슘 이미징 및 후속 시토 혼성화

광 시트 기반 형광 현미경 검사는 발달 생물학에서 가장 가치있는 도구입니다. 비교 연구의 주요 문제는 주변 분산입니다. 우리의 프로토콜은 여러 표본의 동시 라이브 이미징을위한 실험 프레임 워크를 설명하고, 따라서, 적극적으로이 문제를 해결.

샘플 챔버 기반 광시트 형광 현미경에서 여러 곤충 배아의 동시 라이브 이미징

반응성 친전자필 및 산화제(Z-REX)를 표적으로 하는 제브라피쉬는 반응성 소분자 신호 조사를 위한 화학 생물학 기반 방법입니다. 이 기술은 다양한 발달 단계의 활어에 적용 할 수 있습니다. 여기에서는 신호 전달 경로 분석을 위해 제브라피쉬의 표준 분석과 Z-REX를 결합합니다.

유충 제브라피쉬의 표적 신호 반응 모니터링 - Z-REX는 친전자성 약물 및 대사 산물의 정확한 메커니즘을 밝힙니다.

여기에 제시된 것은 전사체학 및 단백질체학 연구를 위해 아프리카 발톱 개구리의 조직 샘플을 준비하기 위한 효과적인 신속 혈액 관류 프로토콜입니다.

Xenopus의 효과적인 급속 관류

학습하세요 Xenopus laevis 배아의 계열 유도 질량 분석법 단백질체학을 통해 발달 생물학 연구를 수행하는 방법을. 이 기술은 조직 유도와 세포 운명 결정 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

발달 중인 (개구리) 배아의 세포 계통 유도 질량 분석법 단백질체학

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