제브라피쉬에서 백금 및 루테늄 기반 화합물 노출의 선량 흡수는 유도적으로 결합된 플라즈마 질량 분광법과 광범위한 응용 분야에 의한 것입니다.

제브라 피쉬는 매력적인 모델이지만 과학자들은 유기체가 수인성 투여로 얼마나 많은 양을 섭취하고 있는지 알지 못합니다. 우리는 노출 후 조직을 소화하고 ICPMS를 통해 금속을 정량화하는 기술을 개발했습니다. 이 기술을 사용하면 ICPMS를 사용하여 용량 반응을 정확하게 정량화하고 검증 할 수 있습니다.

이 방법은 많은 잠재력을 가지고 있습니다. 약리학적 또는 환경적 금속 노출은 세포 수준에서 동물 모델의 전체 장기 시스템에 적용될 수 있다. 약 0.25 밀리리터의 고순도 질산을 최대 10 마리의 유충을 위해 15 밀리리터 폴리 프로필렌 원심 분리 튜브에 첨가하십시오.

한 시간 동안 초음파를 사용하여 샘플을 미리 소화합니다. 초음파 처리의 경우, 모든 조직이 눈에 띄게 산화 될 때까지 산성 안전 전자 레인지 소화조에서 다섯 분 간격으로 짧은 사이클의 조직 소화를 수행하여 균일하고 투명한 노란색 용액을 생산하십시오. 튜브의 무결성을 주의 깊게 모니터링하여 파열을 방지하고 사이클 사이의 원심 분리기에서 짧은 회전을 수행하십시오.

조직이 눈에 띄게 산화되면 흄 후드의 샘플을 6.75 밀리리터의 고순도 물과 와류를 사용하여 3.5 % 질산으로 희석하여 완전히 혼합하십시오. 그런 다음 잠재적인 등압 간섭을 설명하기 위해 매트릭스 매칭, 7점 보정 곡선을 수행합니다. 수성 인증 원소 표준의 스톡 농도를 사용하여 0.1 밀리리터 분취량을 취하고, 피펫으로 새로운 15 밀리리터 원심 분리 튜브에 넣습니다.

3.5 % 질산으로 10 밀리리터의 최종 부피로 희석하여 10 억 개의 표준 용액 당 10 부품을 생산하십시오. 10 억 재고 당 10 부품을 사용하여 직렬 희석을 3.5 % 질산으로 10 억 당 0.1, 1.0 및 5.0 부품 표준 솔루션으로 만듭니다. 0.1 스톡을 사용하여 직렬 희석액을 3.5 % 질산으로 10 억 당 0.001, 0.005 및 0.01 부품 표준 솔루션으로 만듭니다.

그런 다음 샘플 분석을 위해 ICPMS 장비를 준비하기 전에 아르곤 가스 밸브가 열려 있고 모든 튜브가 단단히 연결되고 깨끗하며 샘플 분석 사이에 튜브와 유리 제품을 헹구기 위해 5 % 질산이 열려 있는지 확인하십시오. 토치와 콘의 상태를 확인하고 토치 박스가 단단히 고정되어 있는지 확인하십시오. 그리고 스프레이 챔버 배수 튜브는 주변 펌프에 올바르게 연결되어 있습니다.

소프트웨어를 열고 진공 판독값을 확인한 다음 모든 터보 펌프가 100%플라즈마 제어 시스템 상태 창에서 시작을 클릭하여 시작 시퀀스를 시작합니다. 플라즈마 펌프와 플라즈마 냉각기를 켜고 분무기를 설치하고 플라즈마에 불을 붙입니다. 상태 창에 시작 시퀀스가 완료되었음을 나타낼 때 플라즈마가 켜지고 안정될 때까지 기다립니다.

이 시점에서 시스템 상태 창에서 모든 전원 공급 장치가 켜져 있음을 나타내는 녹색 점을 관찰하십시오. 메뉴 막대에서 드롭 다운 메뉴에서 컨트롤, 자동 샘플러를 클릭하십시오. 5 % 질산을 함유 한 튜브의 자동 시료 주입기 랙 위치를 입력하고 산이 플라즈마에 들어갈 수 있도록하십시오.

메뉴 막대에서 드롭 다운 메뉴에서 스캔, 자석을 클릭하십시오. MagnetScan 창에서 마커 질량 위치에 115를 입력하고 Enter 키를 클릭합니다. 계측기가 예열되는 동안 자석이 질량 범위에서 30분 동안 스캔되도록 합니다.

30분 후, 자동 샘플러 컨트롤을 사용하여 십억 개당 하나의 부품의 다중 요소 튜닝 솔루션의 위치로 이동합니다. 튜닝 솔루션을 흡인하고 계측기를 조정하여 신호 판독을 최적화하십시오. X, Y, Z 좌표에 대한 토치 위치를 조정하여 토치가 플라즈마 제어 창의 원뿔 및 분무기 유량의 중심과 정렬되도록 합니다.

소스, 검출기 및 분석기에 대한 이온 광학 튜닝 창에서 필요한 조정을 수행합니다. 신호 판독이 최적화되면 자석 스캔 창에서 중지를 클릭하고 자석 보정을 클릭한 다음 팝업 창에서 저해상도를 선택합니다. 확인을 클릭하고 질량 교정 smc 파일을 열어 자석을 보정합니다.

저장, 사용을 클릭하여 현재 자석 보정을 분석에 적용합니다. 거대한 범위의 농도로 알려지지 않은 샘플을 측정할 때는 검출기 보정을 수행하여 낮은 농도의 이온 펄스 카운트 신호를 더 높은 농도에서 생성된 감쇠된 이온 신호와 비교합니다. 데이터 수집을 클릭하여 샘플 분석을 시작한 다음 드롭 다운 메뉴에서 방법 설정을 클릭하십시오.

제조업체에서 제공하는 기존 방법을 사용하거나 관심 요소를 기반으로 메서드를 만듭니다. 필요한 경우 디플렉터 설정을 위해 분석 모드, 유지 시간, 스위치 지연, 스윕 및 사이클 수, 해상도, 감지 모드 및 박수 질량을 조정하십시오. 저장을 클릭하여 메서드 설정을 기록합니다.

각 금속 및 이소형에 대한 매개 변수를 최적화합니다. 메뉴 모음에서 데이터 수집을 클릭하십시오. 드롭 다운 메뉴에서 배치 실행을 클릭하십시오.

또는 메뉴 모음 아래의 BATCH 아이콘을 클릭하거나, 스프레드시트에서 배치 매개변수를 가져오거나, 배치 실행 창에서 시퀀스를 만듭니다. 샘플 유형, 자동 시료 주입기 랙 위치, 전송 시간, 세척 시간, 반복실험, 샘플 ID 및 메소드 파일을 입력합니다. 교정 곡선에 대한 표준 솔루션에 대한 배치 실행을 정렬하고 품질 관리 표준을 작성한 다음 알 수없는 샘플을 정렬하십시오.

5~10개 샘플마다 0.5개 부품당 0.5개 품질 관리 표준을 포함하여 계측기 드리프트 및 샘플 재현성을 모니터링합니다. 조직 흡수 연구는 시스플라틴의 수인성 노출과 새로운 루테늄계 항암 화합물 PMC79로 수행되었다. 치사율 및 지연된 부화는 시스플라틴의 공칭 농도에 대해 평가되었다.

시스 플라틴 리터 당 0, 3.75, 7.5 15, 30 및 60 밀리그램. 유기체 조직에서의 백금 축적은 ICPMS 분석에 의해 결정되었고, 유기체 조직은 유기체 당 0.05, 8.7, 23.5, 59.9, 193.2 및 461.9 나노그램의 각각의 투여량을 함유하였다. 지연된 부화는 모든 시스플라틴 농도에서 관찰되었다.

데코리오네이션 후, 코리온을 수집하여 백금에 대해 개별적으로 분석하였다. dechorionation 연구에 사용 된 시스 플라틴의 비 치명적인 복용량은 시스 플라틴의 총 전달 복용량의 93-96 %가 chorion에 축적되어 애벌레 조직 내에 남아있는 용량으로 결정되었습니다. 제브라피쉬 유충은 PMC79 리터당 0, 3.1, 6.2, 9.2 및 12.4 밀리그램에 노출되었다.

이들 농도는 루테늄 리터당 0, 0.17, 0.44, 0.66 및 0.76 밀리그램을 함유하는 것으로 분석적으로 결정되었다. 이 시스플라틴과는 달리, PMC79 노출된 유충에서는 지연된 부화가 관찰되지 않았다. Chorions는 유충 수집 전에 자연적으로 분해되기 때문에 루테늄 분석에 포함되지 않았습니다.

각 농도에서 분석된 유충 조직 내의 거대 금속은 유충 당 루테늄의 0.19, 0.41 및 0.68 나노그램이었다. 노출 프로토콜에 추가된 임의의 시약은 등압 간섭에 대한 가능성을 제공한다. 가능한 경우 트리카인에 비해 급속 냉각과 같은 대안을 고려하십시오.

이 방법은 독성, 효능, 실험에 대한 금속 용량 정량화가 더 높은 척추 동물에 걸쳐 비교 될 수있게합니다. 우리는 특히 우리의 임계 용량이 환자에게 주어진 크기의 순서 내에 있다는 것에 흥분했습니다.