시그마의 압축을 풉니다 - N - 앰프 조직 PCR 키트를 사용하여 마우스 조직의 신속한 Genotyping

안녕하세요, 제 이름은 Linda이며 캘리포니아 대학교 어바인 캠퍼스의 Dr.Edwin Niki 연구실에서 근무하고 있습니다. 오늘은 Sigma의 Cybergreen DNA Extraction & PCR Kit를 사용하여 형질전환 마우스의 유전형을 신속하게 분석하는 방법을 보여드리겠습니다. 저는 주로 급성 해리 세포 배양을 수행할 때, 마우스의 유전형을 빠르게 확인해야 하는 배아 마우스의 유전형 분석에 이 키트를 사용합니다.

하지만 오늘의 목적을 위해, 이 키트를 어떻게 사용하는지 보여드릴 수 있는 성체 마우스 꼬리 샘플을 준비했습니다. 본 프로토콜은 신속한 알루미늄 소화 및 DNA 추출, 그리고 빠른 중화 단계로 구성됩니다. 추출된 DNA를 실시간 PCR에 사용하여 PCR 증폭 산물을 모니터링할 수 있습니다.

이제 준비가 되셨다면 시작하겠습니다. 시작하기 전에, 히트 블록이 95 °C로 설정되어 있는지, Cyber Green이 해동되어 필요할 때까지 얼음 위에 보관되어 있는지, 그리고 다른 시약들이 실온에서 해동되고 있는지 확인하십시오. 제 아이스 버킷에는 유전형 분석에 사용할 두 종류의 프라이머가 있으며, 이들은 분석 대상 유전자에 맞게 특별히 설계되었고 qPCR을 통해 검증되었습니다.

관심 유전자에 대한 양성 대조군과 음성 대조군, 그리고 이미 수집한 성체 생쥐의 조직 샘플도 준비해 두었습니다. 조직 샘플을 수집할 때는 매우 엄격한 기준을 적용하는 것이 매우 중요합니다. 배아 생쥐의 꼬리를 수집할 때, 저희는 항상 각 조직 수집 전과 수집 단계마다 포셉을 70% ethanol로 헹굽니다.

먼저 항상 꼬리 샘플을 TBS로 세척합니다. 각 꼬리에 대해 조직 준비 및 DNA 추출을 위한 마스터 믹스를 만들어야 하며, 추출 용액 100 µL와 조직 준비 용액 25 µL가 필요합니다. P 200 피펫과 필터 팁을 사용하여 추출 용액 100 µL와 조직 준비 용액 25 µL를 새 eppendorf 튜브에 분주하겠습니다. 피펫팅을 통해 마스터 믹스 용액을 혼합해 줍니다.

이제 관심 있는 샘플에 마스터 믹스 125 µL를 추가하십시오. 이때 성체 마우스의 꼬리 샘플이라면 절단된 끝부분이 마스터 믹스 용액에 완전히 잠겨 있는지 확인하십시오. 손가락으로 가볍게 쳐서 섞어준(finger vortex) 후, 상온에서 10분 동안 배양합니다. 이 10분간의 배양 시간 동안, 키트에 포함된 CyDIS Green 마스터 믹스, Milli-Q 또는 PCR 등급의 멸균수, 그리고 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 Green 마스터 믹스를 준비하겠습니다. 이것으로 준비가 완료되었습니다.

10분간의 배양이 완료되었으므로, 95°C에서 3분 동안 가열하여 반응을 활성화해야 합니다. 3분간의 불활성화 과정이 끝났으며, 이제 키트에 제공된 중화 용액을 반응당 100 µL씩 첨가하고 볼텍싱하여 섞어줍니다. 중화 버퍼를 첨가한 후, DNA 샘플은 사용 전까지 4°C에서 보관할 수 있습니다.

우리는 즉시 유전자형을 확인하고자 합니다. 따라서 바로 QPCR 단계로 넘어가며, 꼬리 샘플은 중화되어 준비된 상태입니다. Cyber Green PCR 마스터 믹스가 준비되었으며, PCR 튜브는 콜드 블록 위에 세팅되어 있습니다.

이제 각 웰에 마스터 믹스 16 µL를 분주한 다음, 중화된 추출물 4 µL 또는 양성 또는 음성 대조군 4 µL를 각각 추가하겠습니다. 즉, 각 웰에 마스터 믹스 16 µL를 넣는 것입니다. 그 후 웰 내의 마스터 믹스 16 µL에 중화된 추출물 4 µL를 추가하여 총 반응 부피를 20 µL로 맞춥니다.

양성 및 음성 대조군에 대해서도 동일하게 진행하겠습니다. PPR 마스터 믹스 16 µL에 4 µL를 첨가합니다. 모든 첨가가 완료되면, 광학적으로 투명한 8구 캡 스트립으로 캡을 닫아줍니다.

샘플 위에 덮인 캡의 광학 투명 부위를 만지지 않도록 주의해야 합니다. 따라서 저는 킴와이프(Kim wipe)를 사용하여 캡을 눌러 확실히 밀폐되었는지 확인하고 있습니다. PCR 및 DNA 혼합물을 부드럽게 볼텍싱(vortex)하고 원심분리하여 가라앉혔으므로, 이제 QPCR 기기에 넣을 준비가 되었습니다.

먼저 샘플을 Opticon PCR 기기에 로드하고 새로운 플레이트를 설정하겠습니다. 첫 번째 웰에는 샘플을, 두 번째 웰에는 양성 대조군을, 세 번째 웰에는 음성 대조군을 배치하며, 총 반응 부피는 20 µL로 지정합니다. 다음으로 신속 유전형 분석(rapid genotyping)을 위해 설계된 프로토콜을 로드하겠습니다.

본 프로토콜은 3분간의 변성 단계와 15초의 변성, 15초의 1차 어닐링, 그리고 20초의 1차 신장으로 구성된 사이클을 포함합니다. 이때 1차 신장 시간은 실제로 약 10초까지 단축할 수 있으며, 이 경우 총 시간은 40초가 됩니다. 일반적인 PCR과 마찬가지로 각 사이클의 이 세 단계가 약 40회 반복되며, 마지막 단계에서 용해 곡선을 분석합니다.

이제 플레이트 설정과 프로토콜 로드가 완료되었습니다. 이제 qPCR을 실행하기만 하면 되며, 현재 3분간의 변성 단계부터 시작되고 있습니다. 제가 사용하는 프라이머와 꼬리 샘플, 그리고 분석하고자 하는 유전자를 고려했을 때, 제 경험상 양성 샘플들은 약 25 사이클 정도에서 유의미한 임계 사이클(Ct) 값에 도달하며 검출되기 시작할 것입니다.

이제, 교차 지점은 조직 샘플과 분석 대상, 그리고 초기 DNA 함량에 따라 크게 달라집니다. 이미 양성 대조군에서 반응이 나타난 것을 볼 수 있으며, 샘플 또한 양성인 것으로 보입니다. 보시는 바와 같이, 양성 대조군 이후에 샘플의 반응이 조금씩 나타나기 시작하고 있습니다.

현재 27 사이클에 불과하므로 계속 기다려야 하겠지만, 몇 사이클 더 지나면 샘플의 양성 여부를 확실히 알 수 있을 것이며, 그 후 실험을 진행할 수 있을 것입니다. 현재 음성 대조군이 막 상승하기 시작하는 것을 볼 수 있는데, 이는 제가 테일을 과량으로 넣었기 때문입니다. 이를 통해 이 과량의 음성 테일이 나타나기 전에 상승하는 모든 신호가 양성임을 확신할 수 있습니다.

따라서 이 시점에서 음성 대조군 이전에 나타나는 모든 밴드는 양성으로 간주하고 실험을 계속 진행하겠습니다. PCR 사이클링이 완료되면 기기에서 용해 곡선 분석(melting curve analysis)을 수행합니다. 이를 통해 생성물의 조성과 순도를 확인할 수 있습니다.

이를 통해 양성 및 음성 샘플을 정확하게 선택했는지 확인할 수 있습니다. 예를 들어, 양성 샘플은 증폭된 특정 PCR 산물에 해당하는 뚜렷하고 날카로운 용해 온도 피크를 나타냅니다. 반면 음성 샘플은 PCR 과정 중 증폭된 비특이적 DNA에 해당하는 비특이적이고 넓은 용해 온도 피크를 나타냅니다.

지금까지 Sigma의 Cyber Green 추출 앰플을 사용하여 성체 생쥐 꼬리의 유전자형을 신속하게 분석하는 방법을 보여드렸습니다. 하지만 이 키트는 다양한 동물 조직, 모발, 타액뿐만 아니라 생쥐 배아 꼬리의 유전자형 분석에도 사용할 수 있습니다. 저희는 신속한 분석이 가능하다는 점 때문에 이 키트를 선호합니다.

한 시간 내에 유전자형 분석 결과를 얻을 수 있어 매우 편리하고 간단합니다. 시청해 주셔서 감사하며, 좋은 결과 있으시길 바랍니다.