Name: 시그마의 압축을 풉니다 - N - 앰프 조직 PCR 키트를 사용하여 마우스 조직의 신속한 Genotyping (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-01-22T18:40:00.000+00:00
Duration: 12 min 39 s
Description: 배우세요 마우스 꼬리 조직을 이용한 신속한 유전자형 분석 방법을 실시간 PCR로 확인하세요. 이 프로토콜은 약 1시간 반 내에 정확한 결과를 제공하여 연구자들이 효율적으로 실험을 진행할 수 있게 합니다.

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<table><tbody><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=XNATG%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12346">SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR Kit&lt;/a&gt;</td><td>시약 키트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=XNATG%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12346">XNATG&lt;/a&gt;</td><td>구성품: Extraction Solution, Neutralization Solution B, Tissue Preparation Solution, Extract-N-Amp SYBR Green PCR ReadyMix</td></tr></tbody></table>

시그마의 압축을 풉니다 - n - 앰프 조직 pcr 키트를 사용하여 마우스 조직의 신속한 genotyping

Rapid Genotyping of Mouse Tissue Using Sigma's Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

전기 겔에서 PCR의 증폭과 감지를 통해의 DNA 게놈 검출은 조직 샘플의 유전자형이 결정하는 표준 방법입니다. PCR - DNA 준비를위한 조직의 기존 준비는 종종 조직 샘플에 따라 일 몇 시간이 걸릴. 샘플의 유전자형 따라서 실험의 많은 다른 유형에 대한 옵션이 아니지만, 며칠 동안 지연될 수 있습니다. 여기 우리는 조직 소화 및 PCR 판독 하나와 시그마의 SYBR 그린 추출 - N - 앰프 조직 PCR 키트를 사용하여 시간 반을 포함한 마우스 꼬리 샘플의 전체 genotyping을 보여줍니다. 첫째, 우리는 조직 샘플에서 DNA의 열다섯 분 추출을 보여줍니다. 그렇다면, 우리는 그것이 증폭되고 있기 때문입니다 긍정적인 샘플의 식별을 허용 샘플의 PCR 증폭의 실시간 읽기 아웃 보여줍니다. 함께, 빠른 추출 및 실시간 판독은 PCR의 신뢰성 방법을 통해 조직의 다양한 다른 유형의 유전자형의 프롬프트 식별 수 있습니다.

조직 소화 및 PCR 판독 포함 마우스 꼬리 샘플의 전체 genotyping은, 하나는 시그마의 SYBR 그린 추출 - N - 앰프 조직 PCR 키트를 사용하여 시간 반에서 이루어집니다.

시그마의 압축을 풉니다 - N - 앰프 조직 PCR 키트를 사용하여 마우스 조직의 신속한 Genotyping

PCR 증폭과 전기영동 젤 검출을 통한 DNA의 게놈 검출은 조직 샘플의 유전자형을 ... 하는 표준적인 방법입니다.

안녕하세요, 제 이름은 Linda이며 캘리포니아 대학교 어바인 캠퍼스의 Dr.Edwin Niki 연구실에서 근무하고 있습니다. 오늘은 Sigma의 Cybergreen DNA Extraction & PCR Kit를 사용하여 형질전환 마우스의 유전형을 신속하게 분석하는 방법을 보여드리겠습니다. 저는 주로 급성 해리 세포 배양을 수행할 때, 마우스의 유전형을 빠르게 확인해야 하는 배아 마우스의 유전형 분석에 이 키트를 사용합니다.하지만 오늘의 목적을 위해, 이 키트를 어떻게 사용하는지 보여드릴 수 있는 성체 마우스 꼬리 샘플을 준비했습니다. 본 프로토콜은 신속한 알루미늄 소화 및 DNA 추출, 그리고 빠른 중화 단계로 구성됩니다. 추출된 DNA를 실시간 PCR에 사용하여 PCR 증폭 산물을 모니터링할 수 있습니다.이제 준비가 되셨다면 시작하겠습니다. 시작하기 전에, 히트 블록이 95 °C로 설정되어 있는지, Cyber Green이 해동되어 필요할 때까지 얼음 위에 보관되어 있는지, 그리고 다른 시약들이 실온에서 해동되고 있는지 확인하십시오. 제 아이스 버킷에는 유전형 분석에 사용할 두 종류의 프라이머가 있으며, 이들은 분석 대상 유전자에 맞게 특별히 설계되었고 qPCR을 통해 검증되었습니다.관심 유전자에 대한 양성 대조군과 음성 대조군, 그리고 이미 수집한 성체 생쥐의 조직 샘플도 준비해 두었습니다. 조직 샘플을 수집할 때는 매우 엄격한 기준을 적용하는 것이 매우 중요합니다. 배아 생쥐의 꼬리를 수집할 때, 저희는 항상 각 조직 수집 전과 수집 단계마다 포셉을 70% ethanol로 헹굽니다.먼저 항상 꼬리 샘플을 TBS로 세척합니다. 각 꼬리에 대해 조직 준비 및 DNA 추출을 위한 마스터 믹스를 만들어야 하며, 추출 용액 100 µL와 조직 준비 용액 25 µL가 필요합니다. P 200 피펫과 필터 팁을 사용하여 추출 용액 100 µL와 조직 준비 용액 25 µL를 새 eppendorf 튜브에 분주하겠습니다. 피펫팅을 통해 마스터 믹스 용액을 혼합해 줍니다.이제 관심 있는 샘플에 마스터 믹스 125 µL를 추가하십시오. 이때 성체 마우스의 꼬리 샘플이라면 절단된 끝부분이 마스터 믹스 용액에 완전히 잠겨 있는지 확인하십시오. 손가락으로 가볍게 쳐서 섞어준(finger vortex) 후, 상온에서 10분 동안 배양합니다. 이 10분간의 배양 시간 동안, 키트에 포함된 CyDIS Green 마스터 믹스, Milli-Q 또는 PCR 등급의 멸균수, 그리고 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 Green 마스터 믹스를 준비하겠습니다. 이것으로 준비가 완료되었습니다.10분간의 배양이 완료되었으므로, 95°C에서 3분 동안 가열하여 반응을 활성화해야 합니다. 3분간의 불활성화 과정이 끝났으며, 이제 키트에 제공된 중화 용액을 반응당 100 µL씩 첨가하고 볼텍싱하여 섞어줍니다. 중화 버퍼를 첨가한 후, DNA 샘플은 사용 전까지 4°C에서 보관할 수 있습니다.우리는 즉시 유전자형을 확인하고자 합니다. 따라서 바로 QPCR 단계로 넘어가며, 꼬리 샘플은 중화되어 준비된 상태입니다. Cyber Green PCR 마스터 믹스가 준비되었으며, PCR 튜브는 콜드 블록 위에 세팅되어 있습니다.이제 각 웰에 마스터 믹스 16 µL를 분주한 다음, 중화된 추출물 4 µL 또는 양성 또는 음성 대조군 4 µL를 각각 추가하겠습니다. 즉, 각 웰에 마스터 믹스 16 µL를 넣는 것입니다. 그 후 웰 내의 마스터 믹스 16 µL에 중화된 추출물 4 µL를 추가하여 총 반응 부피를 20 µL로 맞춥니다.양성 및 음성 대조군에 대해서도 동일하게 진행하겠습니다. PPR 마스터 믹스 16 µL에 4 µL를 첨가합니다. 모든 첨가가 완료되면, 광학적으로 투명한 8구 캡 스트립으로 캡을 닫아줍니다.샘플 위에 덮인 캡의 광학 투명 부위를 만지지 않도록 주의해야 합니다. 따라서 저는 킴와이프(Kim wipe)를 사용하여 캡을 눌러 확실히 밀폐되었는지 확인하고 있습니다. PCR 및 DNA 혼합물을 부드럽게 볼텍싱(vortex)하고 원심분리하여 가라앉혔으므로, 이제 QPCR 기기에 넣을 준비가 되었습니다.먼저 샘플을 Opticon PCR 기기에 로드하고 새로운 플레이트를 설정하겠습니다. 첫 번째 웰에는 샘플을, 두 번째 웰에는 양성 대조군을, 세 번째 웰에는 음성 대조군을 배치하며, 총 반응 부피는 20 µL로 지정합니다. 다음으로 신속 유전형 분석(rapid genotyping)을 위해 설계된 프로토콜을 로드하겠습니다.본 프로토콜은 3분간의 변성 단계와 15초의 변성, 15초의 1차 어닐링, 그리고 20초의 1차 신장으로 구성된 사이클을 포함합니다. 이때 1차 신장 시간은 실제로 약 10초까지 단축할 수 있으며, 이 경우 총 시간은 40초가 됩니다. 일반적인 PCR과 마찬가지로 각 사이클의 이 세 단계가 약 40회 반복되며, 마지막 단계에서 용해 곡선을 분석합니다.이제 플레이트 설정과 프로토콜 로드가 완료되었습니다. 이제 qPCR을 실행하기만 하면 되며, 현재 3분간의 변성 단계부터 시작되고 있습니다. 제가 사용하는 프라이머와 꼬리 샘플, 그리고 분석하고자 하는 유전자를 고려했을 때, 제 경험상 양성 샘플들은 약 25 사이클 정도에서 유의미한 임계 사이클(Ct) 값에 도달하며 검출되기 시작할 것입니다.이제, 교차 지점은 조직 샘플과 분석 대상, 그리고 초기 DNA 함량에 따라 크게 달라집니다. 이미 양성 대조군에서 반응이 나타난 것을 볼 수 있으며, 샘플 또한 양성인 것으로 보입니다. 보시는 바와 같이, 양성 대조군 이후에 샘플의 반응이 조금씩 나타나기 시작하고 있습니다.현재 27 사이클에 불과하므로 계속 기다려야 하겠지만, 몇 사이클 더 지나면 샘플의 양성 여부를 확실히 알 수 있을 것이며, 그 후 실험을 진행할 수 있을 것입니다. 현재 음성 대조군이 막 상승하기 시작하는 것을 볼 수 있는데, 이는 제가 테일을 과량으로 넣었기 때문입니다. 이를 통해 이 과량의 음성 테일이 나타나기 전에 상승하는 모든 신호가 양성임을 확신할 수 있습니다.따라서 이 시점에서 음성 대조군 이전에 나타나는 모든 밴드는 양성으로 간주하고 실험을 계속 진행하겠습니다. PCR 사이클링이 완료되면 기기에서 용해 곡선 분석(melting curve analysis)을 수행합니다. 이를 통해 생성물의 조성과 순도를 확인할 수 있습니다.이를 통해 양성 및 음성 샘플을 정확하게 선택했는지 확인할 수 있습니다. 예를 들어, 양성 샘플은 증폭된 특정 PCR 산물에 해당하는 뚜렷하고 날카로운 용해 온도 피크를 나타냅니다. 반면 음성 샘플은 PCR 과정 중 증폭된 비특이적 DNA에 해당하는 비특이적이고 넓은 용해 온도 피크를 나타냅니다.지금까지 Sigma의 Cyber Green 추출 앰플을 사용하여 성체 생쥐 꼬리의 유전자형을 신속하게 분석하는 방법을 보여드렸습니다. 하지만 이 키트는 다양한 동물 조직, 모발, 타액뿐만 아니라 생쥐 배아 꼬리의 유전자형 분석에도 사용할 수 있습니다. 저희는 신속한 분석이 가능하다는 점 때문에 이 키트를 선호합니다.한 시간 내에 유전자형 분석 결과를 얻을 수 있어 매우 편리하고 간단합니다. 시청해 주셔서 감사하며, 좋은 결과 있으시길 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 마우스 배아 조직에서 조직 특정 유전자 발현의 시작하는 동안이나 이후에 조직 특정 유전자의 상호 작용 요소를 식별하는 방법은 염색질의 immunoprecipitation (칩)을 보여줍니다. 그것이 정상적인 배아 발달 동안 발생으로이 프로토콜은 조직 특정 유전자 활성화의 연구에 대해 광범위하게 적용되어야합니다.

초기 마우스 배아를 사용하는 조직 특정 유전자에 대한 염색질의 Immunoprecipitation 분석

단세포 표현 프로 파일링 개별 세포의 자세한 유전자 발현 분석을 수 있습니다. 우리는 cardiomyocytes의 격리를 위해 방법을 설명하고, 구체적인 목표의 전체 transcriptome의 microarray 또는 qPCR 중 하나에 대한 결과 lysates를 준비.

성인 마우스 Cardiomyocytes의 단세포 Transcriptional 프로파일

여기에 제시된 직접 PCR의 접근 방식은 직접 unpurified 식물과 동물 조직의 작은 양의 PCR 증폭을 용이하게한다.

이전 DNA의 정제없이 식물과 동물 샘플의 Genotyping

우리는 라벨 및 신생아 쥐의 유전형과 그들로부터 차의 연결을 문화를 생성하는 절차에 대해 설명합니다. 유전자형은 신속하고 효율적이며 신뢰성 및 자동 핵산 추출 할 수 있습니다. 이 neonatally 치명적인 마우스와 유전자형의 이전 완료를 필요로 그들의 문화에 특히 유용합니다.

동물의 신속한 유전자형은 뇌 신경 세포의 차 문화 구축에 이어

이 프로토콜에는 중요 한 단계 및 패치 클램프 후 단일 셀 다중 반전 녹음 방송 연쇄 반응 하는 데 필요한 조치 설명 합니다. 이 기술은 패치 클램프 기록 특징 하나의 세포에서 유전자의 미리 결정 된 집합 식 프로 파일을 분석 하는 간단 하 고 효과적인 방법입니다.

패치 클램프 후 단일 셀 다중 반전 녹음 방송 연쇄 반응

여기에서, 우리는 고환에서 RBP 후보자의 주요 RNA 표적을 결정 하는 eCLIP 프로토콜을 제시 합니다.

마우스 고환에서 단백질 결합 RNA를 효율적으로 식별 하기 위한 향상 된 가교 면역 침전 (eCLIP) 방법

여기에서 우리는 마우스 배아 조직에서 유전자 발현을 프로파일링하는 다중단일 세포 mRNA 염기서열 분석방법을 제시했다. 멀티플렉싱 전략과 결합된 액적 기반 단일 세포 mRNA 염기서열 분석(scRNA-Seq) 방법은 여러 샘플에서 단일 세포를 동시에 프로파일링할 수 있어 시약 비용을 크게 줄이고 실험 배치 효과를 최소화합니다.

마우스 배아 세포의 다중화 단세포 mRNA 염기서열 분석

여기에서, 우리는 1 세포 배아의 동결 보존을 위한 수정된 방법 뿐만 아니라 유전자 변형 마우스의 효율적인 생성을 위한 동결 해동 된 배아 및 전기 천공의 사용을 결합하는 프로토콜을 제시한다.

유전자 변형 마우스의 고효율 생산을 위한 동결 해동 배아 사용

본 프로토콜은 Gja1에서 전장 Connexin43 생성을 유지하지만 더 작은 GJA1-20k 내부 번역 이소형의 번역을 방지하는 단일 M213L 돌연변이를 기술한다.

전장 단백질의 발현을 유지하면서 mRNA로부터 내부 번역 개시 부위의 제거

난관 핵산 전달 을 통한 개선된 게놈 편집(I-GONAD) 방법의 효율성은 기증자 여성으로부터 접합체 수집을 하고 가성 임신 여성에게 이식해야 하는 기존 미세 주사와 비슷합니다. 이 프로토콜은 CRISPR/Cas9 유도 돌연변이를 염색체 6의 ROSA26 유전자좌에 도입하여 그 효과를 입증합니다.

녹아웃 마우스 생성을 위한 난관 핵산 전달 기반 생체 내 전기천공 기술을 통한 개선된 게놈 편집

배우세요 마우스 꼬리 조직을 이용한 신속한 유전자형 분석 방법을 실시간 PCR로 확인하세요. 이 프로토콜은 약 1시간 반 내에 정확한 결과를 제공하여 연구자들이 효율적으로 실험을 진행할 수 있게 합니다.

시그마의 압축을 풉니다 - N - 앰프 조직 PCR 키트를 사용하여 마우스 조직의 신속한 Genotyping

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