Name: 포유류 세포에서 유비퀴틴화된 p53 단백질의 정제 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: 학습하세요 포유류 세포에서 유비퀴틴화된 p53 단백질을 정제하는 방법을. 이 프로토콜은 단백질 기능 조절에서 유비퀴틴화의 역할을 연구하는 데 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (81972624)의 DL 보조금으로 지원되었습니다.

참고 : H1299 세포는 중국 과학원의 줄기 세포 은행에서 친절하게 제공했으며 마이코 플라스마 오염에 대해 음성으로 입증되었습니다.
1. 세포 배양
<ol><li>초기 배양의 경우, 10% 태아 소 혈청(FBS), 1% 글루타민 첨가제, 1% 나트륨 피루브산염 및 항생제(100U/mL 페니실린 및 100μg/mL 스트렙토마이신)가 보충된 RPMI 1640 배지 10-12mL가 포함된 10cm 페트리 접시에 인간 폐 선암 세포주 H1299의 1 x 106 세포를 넣습니다. 세포를 5%CO2로 가습된 인큐베이터에서 37°C로 유지한다. 세포가 80%-90% 컨플루언스에 도달하는 시기에 따라 2-3일마다 세포를 분할합니다.</li>
	<li>형질주입 하루 전에, 3개의 페트리 접시에 대해 6-9 x 10 6 세포를 준비하고, 형질주입 동안 70%-90%의 합류를 달성하기 위해 10-12mL의 배지를 함유하는 단일 10cm 페트리 접시에 2-3 x 106 세포를 플레이트한다. 참고: HEK293T 세포는 또한 높은 형질주입 효율 및 단백질 발현 수준으로 인해 유비퀴틴화된 단백질을 정제하는 데 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>2. 플라스미드 형질감염
<ol><li>3개의 15mL 원심분리 튜브에 1.5mL의 감소된 혈청 배지를 추가합니다.</li>
	<li>형질주입 준비가 된 플라스미드 DNA를 각 튜브에 추가하여 다음과 같이 희석합니다. 튜브 1: 1 μg의 Flag-p53 플라스미드, 12 μg의 빈 벡터; 튜브 2: 1 μg의 Flag-p53 플라스미드, 3 μg의 His-HA-Ub (HH-Ub) 플라스미드, 및 9 μg의 빈 벡터; 튜브 3: 1μg의 Flag-p53 플라스미드, 3μg의 HH-Ub 플라스미드 및 9μg의 Mdm2 플라스미드. 총 0.2μg의 녹색 형광 단백질(GFP) 플라스미드를 각 튜브에 추가하여 형질감염 효율을 모니터링합니다. 참고: 세포에서 효율적인 표적 단백질 발현을 달성하는 데 필요한 최적의 플라스미드 양을 결정하기 위해 파일럿 실험을 수행해야 합니다.</li>
	<li>78μL의 리포좀 형질주입 시약을 다른 원심분리 튜브의 환원된 혈청 배지 4.5mL에 추가하여 리포좀을 희석합니다. 튜브를 튕겨 완전히 혼합하고 실온(RT)에서 5분 동안 그대로 두십시오.</li>
	<li>희석된 DNA 용액 1.5mL를 포함하는 단계 2.2의 각 튜브에 희석된 리포좀 용액 1.5mL를 추가합니다. 완전히 혼합하고 RT에서 최소 20분 동안 플라스미드를 리포좀과 가교결합시킵니다. 각 형질감염에 대해 1:2(μg:μL)의 플라스미드 DNA:리포좀 비율을 사용합니다.</li>
	<li>페트리 접시에서 원래 배지를 버리고 각 접시에 9mL의 환원 혈청 배지를 추가합니다. 각 접시에 리포좀-DNA 혼합물 3mL를 넣고 플레이트를 앞뒤로 3배 부드럽게 흔든 다음 플레이트에 혼합물을 고르게 분배하기 위해 좌우로 3배 흔들어 용액을 혼합합니다.</li>
	<li>세포를 37°C에서 5%CO2로 가습된 배양기에서 배양한다. 4-6 시간 후에 배지를 교체하고 24-36 시간 동안 세포를 계속 배양하십시오.</li>
</ol>3. 세포 수집
<ol><li>24-36 시간 후, 세포를 10-6 시간 동안 10 μM의 최종 농도로 MG132로 처리한다. 참고: MG132는 26S 프로테아좀 복합체의 단백질 분해 활성을 효율적으로 차단하는 펩타이드 알데히드입니다. 라이신 -48 (K48) 결합 폴리 유비 퀴틴 사슬로 유비퀴틴 화 된 단백질의 양은 세포가 MG132 또는 다른 프로테아좀 억제제로 처리 된 후에 증가 될 수있다.</li>
	<li>배지를 버리고 얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 2배(세포가 플러시되지 않도록 주의) 세척하고 혈청학적 피펫으로 세포를 흡인합니다.</li>
	<li>접시에 PBS 1mL를 넣고 깨끗한 스크레이퍼로 긁어 세포를 제거한 다음 세포 현탁액을 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다. 700 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포 펠릿을 수집합니다.</li>
</ol>4. 비변성 조건에서 유비퀴틴화된 단백질의 정제
<ol><li>사용하기 전에 프로테아제 억제제 칵테일로 새로 보충 된 플래그 용해 완충액 (50 mM Tris-HCl (pH 7.9), 137 mM NaCl, 10 mM NaF, 1 mM 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA), 1 % 트리톤 X-100, 0.2 % 사르 코실 및 10 % 글리세롤)을 준비하십시오.</li>
	<li>각 튜브의 세포에 800μL의 얼음처럼 차가운 플래그 용해 버퍼를 추가하고 와류 발진기 또는 피펫 건을 사용하여 세포를 혼합한 다음 혼합물을 4°C의 회전 장치에서 30분 동안 배양합니다.</li>
	<li>혼합물을 초음파의 5-10 짧은 펄스에 적용하십시오. 20 kHZ의 초음파 처리 주파수와 1 초 동안 지속되는 각 펄스로 80 % 진폭으로 얼음에 초음파를 수행하십시오. 혼합물을 4°C에서 분당 40회전(rpm)으로 회전기에서 30분 동안 인큐베이션한다.</li>
	<li>초음파 처리 된 샘플을 8,000 x g 에서 4 °C에서 20-30 분 동안 원심 분리합니다. 상청액을 새로운 미세 원심 분리기 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>세포 추출물 80 μL (1/10)를 분취하고, 20 μL의 5x 나트륨 도데실 설페이트 (SDS) 로딩 완충액과 혼합한다. 샘플을 98 ° C에서 5 분 동안 끓여서 얼음에서 2 분 동안 식히고 사용할 때까지 -20 ° C에서 보관하십시오. 이러한 샘플을 입력 그룹으로 사용하여 단백질 발현을 모니터링합니다.</li>
	<li>나머지 세포 추출물에 30μL의 항-Flag M2 항체 접합(Flag/M2) 비드를 추가하고 4°C의 회전 장치에서 최소 4시간 또는 밤새 배양합니다.</li>
	<li>4°C에서 2분 동안 1,500 x g 에서 원심분리하여 비드를 수집하였다. 1mL의 얼음처럼 차가운 플래그 용해 완충액을 비드에 추가하고 튜브를 여러 번 뒤집어 혼합합니다.</li>
	<li>4°C에서 2분 동안 1,500 x g 에서 원심분리하여 비드를 수집하였다. 4.7 단계를 4-6 번 반복하십시오.</li>
	<li>최종 농도 200ng/μL의 플래그 펩타이드 40μL를 비드에 추가하고 4°C의 회전 장치에서 2시간 동안 배양하여 결합된 단백질을 용리합니다.</li>
	<li>4°C에서 5분 동안 1,500 x g 로 원심분리합니다. 상청액을 새로운 미세 원심 분리기 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>10μL의 5x SDS 로딩 버퍼를 추가하고, 혼합물을 98°C에서 5분 동안 끓이고, 얼음에서 2분 동안 냉각하고, 웨스턴 블로팅을 위해 -20°C에서 보관합니다. 또는 다른 다운스트림 실험을 위해 단계 4.10의 용출액을 -80°C에서 직접 보관하십시오. 참고: 정제된 유비퀴틴화된 단백질의 양은 세포 수와 형질감염된 플라스미드의 양을 증가시킴으로써 확대될 수 있다. 에피토프 태깅 전략은 천연 정제 조건 하에서 유비퀴틴화된 p53에 특이적으로 결합하는 세포 복합체를 정제하도록 적응될 수 있다. Flag-p53, mdm2, 및 HA-유비퀴틴을 공동-발현함으로써, 유비퀴틴화된 p53 단백질 복합체는 포유동물 세포로부터 순차적 플래그 및 HA 항체-접합된 아가로스에 의해 면역침전될 수 있다. 유비퀴틴화 p53 단백질의 결합 파트너를 유지하기 위해, 정제 과정에서 덜 엄격한 BC100 용해 완충액(20mM Tris-HCl(pH 7.9), 100mM NaCl, 10% 글리세롤, 0.2mM EDTA, 0.2% 트리톤 X-100 및 1x 프로테아제 억제제)을 사용해야 합니다. HA 펩타이드로부터의 용출액은 유비퀴틴화된 p53에 특이적으로 결합하는 모든 파트너를 식별하기 위해 질량 분석법을 거친다.</li>
</ol>5. 변성 조건하에서 유비퀴틴화된 단백질의 정제
<ol><li>1단계에서 얻은 셀 펠릿에 3.3mL의 얼음처럼 차가운 PBS를 추가하고 고르게 혼합합니다. 세포 현탁액 100 μL (1/10 부피)를 입력 샘플로서 마이크로 원심분리 튜브에 분취한다.</li>
	<li>4°C에서 5분 동안 700 x g 에서 원심분리하여 세포 펠릿을 수집하였다. 입력 샘플에 80μL의 플래그 용해 버퍼를 추가하고 와류 발진기 또는 피펫 건을 사용하여 세포를 혼합하고 1시간 동안 얼음에서 세포를 용해합니다.</li>
	<li>8,000 x g 에서 4 °C에서 20-30분 동안 원심분리합니다. 상청액 80 μL를 새로운 미세원심분리 튜브에 분취한다.</li>
	<li>상청액에 20μL의 5x SDS 로딩 버퍼를 첨가하고, 98°C에서 5-10분 동안 끓이고, 얼음에서 2분 동안 냉각하고, 사용할 때까지 -20°C에서 보관합니다.</li>
	<li>나머지 900 μL의 세포 현탁액을 700 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하여 세포 펠렛을 수집하였다. 1mL의 유비퀴틴 완충액 1 (UB 완충액 1; 6 M 구아니딘-HCI, 0.1 M Na2HPO4, 6.8 mMNaH2PO4, 10 mM 트리스-HCI (pH 8.0) 및 0.2 % 트리톤 X-100, 10 mM β-메르캅토에탄올 및 5 mM 이미다졸)을 세포 펠릿에 첨가하고 세포를 고르게 분배하기 위해 위아래로 피펫팅하여 여러 번 혼합합니다. 참고: 이미다졸의 농도는 니켈-하전된 수지 상의 비특이적 단백질 결합을 감소시키기 위해 5mM에서 20mM까지 다양할 수 있다. 유비퀴틴 완충액에는 구아니딘 하이드로 클로라이드가 포함되어있어 리가 아제와 DUB를 모두 비활성화합니다. β- 메르 캅토 에탄올은 썩은 계란과 비슷한 강하고 불쾌한 냄새가 나는 투명한 무색의 액체입니다. 고농도 용액은 점막, 상부 호흡기, 피부 및 눈에 심각한 손상을 줄 수 있습니다. 장갑과 고글을 착용하고 흄 후드에서 작동하십시오.</li>
	<li>용액이 더 이상 점성이 없을 때까지 세포 용해물을 10-20 라운드의 초음파에 노출시킵니다. 20 kHZ의 초음파 처리 주파수와 1 초 동안 지속되는 각 펄스로 80 % 진폭으로 얼음에 초음파를 수행하십시오. RT에서 20-30분 동안 8,000 x g 로 원심분리하고 상청액을 새로운 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>상청액에 니켈 충전 수지 30μL를 추가하고 RT에서 4시간 동안 또는 밤새 15rpm으로 설정된 회전기에서 배양합니다. RT에서 2분 동안 1,500 x g 로 원심분리하여 비드를 수집합니다.</li>
	<li>UB 버퍼 1 1mL를 추가하고, RT에서 10분 동안 셰이커에서 회전하면서 배양하고, RT에서 2분 동안 1,500 x g 에서 원심분리하여 비드를 수집합니다.</li>
	<li>1mL의 유비퀴틴 완충액 2 (UB 완충액 2; 8 M 우레아, 0.1 M Na2HPO4, 6.8 mMNaH2PO4,10 mM Tris-HCI (pH 8.0), 및 0.2% 트리톤 X-100)를 비드에 첨가하고, RT에서 10분 동안 쉐이커에서 회전하면서 인큐베이션하고, 1,500 x g에서 2분 동안 원심분리하여 비드를 수집한다. 이것을 한 번 더 반복하십시오.</li>
	<li>비드에 1mL의 PBS를 추가하고, RT에서 10분 동안 셰이커에서 회전하면서 배양하고, RT에서 2분 동안 1,500 x g 에서 원심분리하여 비드를 수집합니다. 이것을 한 번 더 반복하십시오.</li>
	<li>비드를 RT에서 1시간 동안 0.5M의 최종 농도로 40μL의 이미다졸과 함께 인큐베이션하여 결합된 단백질을 용리시킵니다. RT에서 2분 동안 1,500 x g 로 원심분리합니다.</li>
	<li>상청액을 깨끗한 미세 원심분리 튜브로 옮기고 10μL의 5x SDS 로딩 버퍼를 추가하고 98°C에서 5분 동안 끓인 다음 얼음에서 2분 동안 냉각하고 웨스턴 블로팅을 위해 -20°C에서 보관합니다. 또는 다른 다운스트림 실험을 위해 처리되지 않은 용출액을 -80°C에 보관하십시오.</li>
</ol>6. 웨스턴 블롯팅에 의한 정제된 유비퀴틴화 단백질의 검출
<ol><li>단계 4.11 및 5.12로부터의 샘플을 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)으로 해결한 다음, 웨스턴 블롯팅에 의해 니트로셀룰로스 막으로 옮겨18에 기재된 바와 같이 상응하는 항체를 사용하여 표적 단백질을 검출한다.</li>
	<li>간단히 말해서, TBST 완충액 (15 mM Tris-HCI; pH = 7.6, 4.6 mM Tris-base, 150 mM NaCI, 사용 전에 0.1 % Tween-20으로 새로 보충 됨) 중 5 % 데파트 분유를 함유하는 20 mL의 블로킹 용액에 1 시간 동안 침지시켜 막을 배양한다. 이어서, 1차 항체와 함께 막을 RT에서 2시간 동안 또는 4°C에서 밤새 인큐베이션한다. 각 세트에 대해 다음 항체를 사용하십시오. 모든 1차 항체는 1:1000의 희석으로 사용하였다.<ol><li>Flag/M2 아가로스 비드로 면역침전 후 항-p53 단클론 항체로 유비퀴틴화된 p53을 포함한 총 p53 단백질을 검출합니다.</li>
		<li>Flag/M2 아가로스 비드로 면역침전 후 항-HA 항체 또는 항-유비퀴틴 항체로 유비퀴틴화된 p53 단백질을 검출합니다.</li>
		<li>니켈 충전 레진 풀다운 후 항-p53 단일클론 항체로 유비퀴틴화된 p53 단백질을 검출합니다.</li>
		<li>니켈 충전 수지 풀다운 후 항-HA 항체 또는 항-유비퀴틴 항체로 총 유비퀴틴화된 단백질을 검출합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP) 결합 된 2 차 항체로 막을 TBST 완충액으로 각각 5 분 동안 3x 세척 한 후 RT에서 1 시간 동안 배양합니다. 모든 2차 항체를 1:3000의 희석으로 사용하였다. 그런 다음 TBST 버퍼로 멤브레인을 3x 부드럽게 교반하면서 각각 5 분 동안 세척하십시오.</li>
	<li>화학 발광 이미징 시스템을 시작하여 웨스턴 블로팅의 신호를 감지합니다. 용액 A와 B를 1 : 1의 비율로 혼합하여 HRP 용 기질 용액을 준비하십시오.</li>
	<li>니트로셀룰로오스 멤브레인을 카메라 옵스큐라의 앞면이 위로 향하게 하고 피펫팅 건을 사용하여 멤브레인에 기질 용액을 고르게 코팅합니다. 자동 노출 절차를 선택하여 화학 발광 신호를 캡처하고 이상적인 신호가 획득 될 때까지 노출 시간을 수동으로 조정하십시오.</li>
</ol>

<ol><li>Kwon, Y. T., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+code+in+the+ubiquitin-proteasome+system+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin code in the ubiquitin-proteasome system and autophagy.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (11), 873-886 (2017).</li>
<li>Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitination+in+disease+pathogenesis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment.</a> Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).</li>
<li>Zheng, N., Shabek, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+ligases%3A+Structure%2C+function%2C+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin ligases: Structure, function, and regulation.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).</li>
<li>Dikic, I., Wakatsuki, S., Walters, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-binding+domains+-+from+structures+to+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-binding domains - from structures to functions.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (10), 659-671 (2009).</li>
<li>Oh, E., Akopian, D., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+ubiquitin-dependent+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Principles of ubiquitin-dependent signaling.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 137-162 (2018).</li>
<li>Clague, M. J., Urbe, S., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+chains%3A+deubiquitylating+enzyme+specificity+begets+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Breaking the chains: deubiquitylating enzyme specificity begets function.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (6), 338-352 (2019).</li>
<li>Harrigan, J. A., Jacq, X., Martin, N. M., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deubiquitylating+enzymes+and+drug+discovery%3A+emerging+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Deubiquitylating enzymes and drug discovery: emerging opportunities.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (1), 57-78 (2018).</li>
<li>Vogelstein, B., Lane, D., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfing+the+p53+network%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Surfing the p53 network.</a> Nature. 408 (6810), 307-310 (2000).</li>
<li>Boutelle, A. M., Attardi, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+and+Tumor+suppression%3A+It+takes+a+network%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+In+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">p53 and Tumor suppression: It takes a network.</a> Trends In Cell Biology. 31 (4), 298-310 (2021).</li>
<li>Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53%3A+800+million+years+of+evolution+and+40+years+of+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">p53: 800 million years of evolution and 40 years of discovery.</a> Nature Reviews Cancer. 20 (8), 471-480 (2020).</li>
<li>Vousden, K. H., Prives, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blinded+by+the+light%3A+The+growing+complexity+of+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Blinded by the light: The growing complexity of p53.</a> Cell. 137 (3), 413-431 (2009).</li>
<li>Brooks, C. L., Gu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+ubiquitination%3A+Mdm2+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">p53 ubiquitination: Mdm2 and beyond.</a> Molecular Cell. 21 (3), 307-315 (2006).</li>
<li>Liu, Y., Tavana, O., Gu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+modifications%3A+exquisite+decorations+of+the+powerful+guardian%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">p53 modifications: exquisite decorations of the powerful guardian.</a> Journal Of Molecular Cell Biology. 11 (7), 564-577 (2019).</li>
<li>Dobbelstein, M., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mdm2%3A+Open+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">Mdm2: Open questions.</a> Cancer Science. 111 (7), 2203-2211 (2020).</li>
<li>Kulikov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mdm2+facilitates+the+association+of+p53+with+the+proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mdm2 facilitates the association of p53 with the proteasome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10038-10043 (2010).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mono-+versus+polyubiquitination%3A+differential+control+of+p53+fate+by+Mdm2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mono- versus polyubiquitination: differential control of p53 fate by Mdm2.</a> Science. 302 (5652), 1972-1975 (2003).</li>
<li>Tomlinson, E., Palaniyappan, N., Tooth, D., Layfield, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+purification+of+ubiquitinated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Methods for the purification of ubiquitinated proteins.</a> Proteomics. 7 (7), 1016-1022 (2007).</li>
<li>Green, M., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+M+%22Molecular+Cloning+A+Laboratory+Manual.+%28Fourth+Edition%29%22">Molecular Cloning A Laboratory Manual. (Fourth Edition)</a>. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, USA. 28(2012).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

유비퀴틴화는 거의 모든 생리적 및 병리학적 세포 과정에서 중요한 역할을 합니다2. 최근 몇 년 동안 신호 전달 경로에서 유비퀴틴의 분자 역할과 유비퀴틴 시스템의 변화가 어떻게 다른인간 질병을 유발하는지 이해하는 데 큰 진전이 있었습니다2. 유비퀴틴화 단백질의 정제는 이러한 공정에서 유비퀴틴화의 정확한 역할에 대한 통찰력을 제공하는 데 기여합니다. 유비퀴틴-접합 단백질의 혼합물은 비변성 및 변성 조건 하에서 세포로부터 정제될 수 있다. 니켈 수지를 사용하는 IMAC는 변성 조건에서 poly-His-tagged 단백질을 정제하는 데 사용할 수 있습니다. 변성 조건에서 유비퀴틴화된 단백질을 정제하는 목표는 표적 단백질로부터 상호작용 파트너를 버리는 것입니다. 표적 단백질에 결합하는 모든 세포 성분은 변성 조건 하에서 용출로부터 결실될 것이다. 대조적으로, 표적 단백질에 결합하는 일부 세포 단백질은 천연 조건 하에서 용출 상태로 유지될 수 있으며, 이...

유비퀴틴은 76 개의 아미노산 1,2,3의 진화 적으로 보존 된 단백질입니다. 유비퀴틴은 활성화 (E1), 접합 (E2) 및 리가 아제 (E3) 효소를 포함하는 캐스케이드를 통해 표적 단백질의 라이신 잔기에 공유 결합합니다. 유비퀴틴은 먼저 E1 효소에 의해 활성화 된 다음 E2 접합 효소로 옮겨집니다. 이어서, E3 유비퀴틴 리가 아제는 유비퀴틴-로딩 된 E2 효소 및 기질 단백질 모두와 상호 작용하고, 유비퀴틴의 C- 말단과 기질 1,2,3,4,5의 라이신 잔기 사이의 이소 펩티드 결합의 형성을 매개한다. 유비퀴틴화는 유비퀴틴 잔기를 기질 단백질 상의 라이신 잔기 또는 그 자체에 부착시켜 단백질 모노유비퀴틴화 또는 폴리유비퀴틴화를 유도하는 것을 포함한다. 이 유비퀴틴화 과정은 진핵생물에서 세포 내에서 발생하며 다양한 생물학적 과정을 조절합니다. 유비퀴틴화는 유비퀴틴-프로테 아좀 시스템 1,2,3,4,5를 통해 기질 단백질의 분해를 초래한다. 또한, 유비퀴틴화는 세포3,5에서 단백질 세포 내 국소화, 단백질 복합체 형성 및 단백질 트래피킹을 조절한다. 기질 단백질에 연결된 유비퀴틴 잔기는 데유비퀴틴화 효소(DUB)에 의해 제거될 수 있습니다6,7. 특히, 유비퀴틴 사슬이 조립되는 다양한 방법은 다양한 생물학적 과정을 조절하는 무수한 수단을 제공합니다 1,5. 기질 단백질 기능을 조절하는 유비퀴틴화의 정확한 역할은 지금까지 불완전하게 이해되고 있습니다. 유비퀴틴화 된 단백질의 정제는 다양한 세포 과정에 대한 단백질 유비퀴틴화의 효과의 해명에 기여한다.
p53 단백질은 가장 중요한 종양 억제 단백질 중 하나이며 거의 모든 인간 암 8,9,10,11에서 유전 적 돌연변이 또는 불 활성화를 나타냅니다. p53 안정성 및 활성은 유비퀴틴화, 인산화, 아세틸화 및 메틸화12,13을 포함하는 번역후 변형에 의해 생체내에서 섬세하게 조절된다. p53 단백질은 다양한 세포에서 6 분에서 40 분 범위의 짧은 반감기를 가지며, 이는 주로 폴리 유비 퀴틴 화 및 후속 프로테아좀 분해10,12로 인해 발생합니다. 마우스 더블분 2 (Mdm2)는 p53의 N 말단에 결합하여 그의 전사 활성12,14,15를 억제하는 p53의 E3 유비퀴틴 리가제이다. Mdm2는 p53의 폴리유비퀴틴화 및 프로테아좀 분해를 촉진하여 안정성을 제어하고 p53의 모노유비퀴틴화를 유도하여 핵 수출12,14,15,16을 촉진합니다. 여기서, 유비퀴틴화 Mdm2 매개 p53은 포유동물 세포로부터 유비퀴틴화 단백질을 정제하는 방법을 구체적으로 소개하기 위한 예로 사용된다. 표적 단백질의 유비퀴틴화 상태에 영향을 미치는 조절자는 포유류 세포에서 과발현되거나 녹다운/녹아웃될 때 이 생체 내 유비퀴틴화 분석을 사용하여 확인할 수 있습니다. 또한, 유비퀴틴화 단백질은 시험관내 탈유비퀴틴화 분석을 위한 기질로서 사용될 수 있다. 유비퀴틴화된 기질을 개별 DUB와 함께 배양하여 표적 단백질에 대한 특정 DUB를 식별하기 위해 고처리량 스크리닝을 수행할 수 있습니다. 유비퀴틴화된 단백질은 세포에서 다운스트림 신호전달 단백질을 모집하는 스캐폴드로서 작용할 수 있다. 유비퀴틴화된 표적 단백질 복합체는 천연 정제 조건 하에서 순차적 면역침전에 의해 정제될 수 있고 질량 분석법에 의해 확인될 수 있다. 현재 프로토콜은 유비퀴틴화에 의해 조절되는 세포 단백질을 조사하기 위해 광범위하게 사용될 수 있다.
친화성 태그가 부착된 유비퀴틴, 유비퀴틴 항체, 유비퀴틴 결합 단백질 및 분리된 유비퀴틴 결합 도메인(UBD)의 사용을 포함하는 유비퀴틴화된 단백질을 정제하기 위한 몇 가지 방법이 확립되었습니다17. 여기에서는 포유동물 세포에서 유비퀴틴화 단백질을 정제하기 위한 매개체로 친화성 태그된 유비퀴틴을 사용하는 프로토콜을 제공합니다. poly-His-tagged 유비퀴틴의 사용은 다른 방법들에 비해 이점을 제공한다. 유비퀴틴화 단백질은 강력한 변성제의 존재 하에서 정제되며, 이는 세포 단백질을 선형화하고 단백질-단백질 상호 작용을 방해함으로써 니켈 하전 수지에 대한 비특이적 결합을 감소시킵니다. 대조적으로, 유비퀴틴 항체, 유비퀴틴 결합 단백질 및 분리된 UBD를 매개체로 사용하는 것은 덜 엄격한 조건에서 정제를 수행해야 하기 때문에 표적 단백질에서 결합 파트너를 효과적으로 배제할 수 없습니다. 더욱이, 정제는 또한 이들 매개체를 사용하여 관련없는 단백질의 결합 증가를 유도 할 수있다. 또한, 다양한 유비퀴틴 결합 유형뿐만 아니라 유비퀴틴 결합 단백질 또는 단리된 UBDs(17)에 의한 모노- 및 폴리-유비퀴틴화에 대한 결합 성향이 존재한다. poly-His-tagged 유비퀴틴의 사용은 모든 세포 유비퀴틴화 단백질을 끌어내리는 데 기여합니다. 대안적으로, 시판되는 항-플래그 또는 항-HA 항체-접합된 아가로스의 사용은 비변성 조건 하에서 대규모 플래그- 또는 HA-태그된 표적 단백질을 면역침전시키는 것을 용이하게 한다. 제2 정제 단계는, 예를 들어, 폴리-히스-태그된 유비퀴틴을 표적화하는 니켈-하전된 수지에 의해, 다운스트림 실험을 위해 고순도의 유비퀴틴화된 표적 단백질을 획득하는데 사용될 수 있다. 특히, 에피토프 태깅 정제 전략은 표적 단백질을 효과적으로 면역침전시키기 위해 특정 항체를 획득할 수 없을 때 적응될 수 있다. 마지막으로, 포유류 세포에서 유비퀴틴화 단백질의 정제는 시험관 내 정제와 비교하여 더 많은 생리학적 조건 하에서 표적 단백질의 유비퀴틴 결합 모드를 유지합니다.

<table><tbody><tr><td>&beta;-메르캅토에탄올</td><td>Sangon Biotech</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Amersham ECL Mouse IgG, HRP linked whole Ab (from sheep)</td><td>GE healthcare</td><td>NA931</td><td>Secondary antibdoy</td></tr><tr><td>Amersham ECL Rat IgG, HRP linked whole Ab (from donkey)</td><td>GE healthcare</td><td>NA935</td><td>Secondary antibdoy</td></tr><tr><td>Anti-Flag M2 Affinity Gel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2220</td><td>FLAG/M2 beads</td></tr><tr><td>Anti-GFP monocolonal 항체</td><td>Santa cruz</td><td>sc-9996</td><td>Primary 항체</td></tr><tr><td>Anti-HA High Affinity</td><td>Roche</td><td>11867423001</td><td>Primary 항체</td></tr><tr><td>Anti-Mdm2 monocolonal 항체 (SMP14)</td><td>Santa cruz</td><td>sc-965</td><td>1차 항체</td></tr><tr><td>Anti-p53 monocolonal 항체 (DO-1)</td><td>Santa cruz</td><td>sc-126</td><td>1차 항체</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Alddich</td><td>E5134</td><td>용매</td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>VivaCell</td><td>C04001-500</td><td>FBS</td></tr><tr><td>FLAG 펩타이드</td><td>Sigma-Alddich</td><td>F3290</td><td>용출 완충액 준비</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>보충제</td></tr><tr><td>Guanidine-HCI</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100287-0500</td><td>용매</td></tr><tr><td>H1299</td><td>줄기 세포 은행, 중국 아카데미 과학</td><td></td><td></td></tr><tr><td>이미지 연구소</td><td>Bio-rad</td><td></td><td>소프트웨어</td></tr><tr><td>Immidazole</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500529-0100</td><td>용매</td></tr><tr><td>Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate</td><td>Millipore</td><td>WBKLS0500</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 시약</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td>Transfection 시약</td></tr><tr><td>MG132</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-13259</td><td>프로테아솜 억제제</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501727-0500</td><td>용매</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610476-0005</td><td>용매</td></tr><tr><td>NaF</td><td>Sigma-Alddich</td><td>201154</td><td>용매</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501726-0500</td><td>용매</td></tr><tr><td>Ni-NTA Agarose</td><td>QIAGEN</td><td>30230</td><td>니켈 충전 수지</td></tr><tr><td>니트로셀룰로오스 블로팅 멤브레인</td><td>GE 헬스케어</td><td>10600002</td><td>0.45 &마이크로; m 기공 크기</td></tr><tr><td>Opti-MEM 감소 혈청 배지</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>형질 주입 배지</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-cv</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 용액</td><td>Sangon Biotech</td><td>E607011-0100</td><td>항생제</td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Biological Industries</td><td>01-100-1ACS</td><td>매체</td></tr><tr><td>Sarkosyl</td><td>Sigma-Alddich</td><td>L5777</td><td>용매</td></tr><tr><td>SDS 로딩 버퍼</td><td>Beyotime</td><td>P0015L</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 피루브산</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td>보충제</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501492-0005</td><td>용매</td></tr><tr><td>Tris-HCI</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610103-0250</td><td>용매</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sangon Biotech</td><td>A110694-0500</td><td>시약</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100777-0500</td><td>보충제</td></tr><tr><td>초고감도 화학발광 이미징 시스템</td><td>Bio-rad</td><td></td><td>ChemiDoc XRS+</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sangon Biotech</td><td>A510907-0500</td><td>용매</td></tr></tbody></table>

포유류 세포에서 유비퀴틴화된 p53 단백질의 정제

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

유비퀴틴화는 기질 단백질의 안정성뿐만 아니라 국소화 및 기능을 조절하는 번역 후 변형의 한 유형입니다. 유비퀴틴화 과정은 진핵생물에서 세포 내에서 발생하며 거의 모든 기본적인 세포 생물학적 과정을 조절합니다. 유비퀴틴화된 단백질의 정제는 기질 단백질의 기능을 제어하는 유비퀴틴화의 역할에 대한 조사를 돕습니다. 여기서, 포유류 세포에서 유비퀴틴화 단백질을 정제하기 위한 단계별 절차가 p53 종양 억제 단백질을 예로 들어 설명된다. 유비퀴틴화된 p53 단백질은 엄격한 비변성 및 변성 조건 하에서 정제하였다. 총 세포 플래그-태그된 p53 단백질을 비변성 조건 하에 항-플래그 항체-접합된 아가로스로 정제하였다. 대안적으로, 총 세포 His-태그된 유비퀴틴화 단백질을 변성 조건 하에 니켈-하전된 수지를 사용하여 정제하였다. 용출액에서 유비퀴틴화된 p53 단백질은 특정 항체로 성공적으로 검출되었습니다. 이 절차를 사용하여 주어진 단백질의 유비퀴틴화 된 형태를 포유류 세포로부터 효율적으로 정제하여 단백질 기능을 조절하는 유비퀴틴화의 역할에 대한 연구를 용이하게합니다.

도식도는 플래그 태그 p53(Flag-p53) 및 His/HA 이중 태그 유비퀴틴(HH-Ub) 단백질을 보여줍니다(그림 1A). 유비퀴틴화된 단백질을 정제하는 데 사용되는 절차는 그림 1B에 요약되어 있습니다. Poly-His-태그된 유비퀴틴은 포유동물 세포 내의 표적 단백질에 라이게이션될 수 있다. 유비퀴틴화된 단백질은 비변성 조건에서 Flag/M2 비드로 정제하거나 변성 조건에서 고정화된 금속 이온 친화성 크로마토그래피(IMAC)로 정제할 수 있습니다(그림 1B). 유비퀴틴화된 p53을 포함한 총 p53 단백질은 비변성 조건하에서 H1299 세포로부터의 Flag/M2 비드로 면역침전시켰다. 저분자량에서 고분자량까지 번진 밴드로 나타나는 유비퀴틴화 p53 단백질의 신호는 Mdm2가 이들 세포에서 외분비로 발현되었을 때 현저하게 증가하여 유비퀴틴화된 p53 단백질이 세포...

프로토콜은 p53 종양 억제 단백질을 예로 사용하여 포유류 세포로부터 유비퀴틴화된 단백질을 정제하는 단계별 방법을 설명합니다. 유비퀴틴화된 p53 단백질은 엄격한 비변성 및 변성 조건 하에서 세포로부터 정제하였다.

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...

이 프로토콜을 사용하면 주어진 단백질의 유비퀴틴화 된 형태를 포유류 세포로부터 효율적으로 정제하여 단백질 기능을 조절하는 유비퀴틴화의 역할에 대한 연구를 용이하게 할 수 있습니다. 시험관내 정제와 비교하여 포유동물 세포에서 유비퀴틴화된 단백질의 정제는 보다 방사선학적 조건 하에서 표적 단백질의 유비퀴틴 결합 모드를 유지합니다. 3 개의 15 밀리리터 원심 분리 튜브에 1.5 밀리리터의 감소 된 혈청 배지를 추가하여 시작하십시오.형질주입 준비가 된 플라스미드 DNA를 각 튜브에 추가하고 0.2마이크로그램의 녹색 형광 단백질 플라스미드를 추가하여 형질주입 효율을 모니터링합니다. 78 마이크로리터의 리포좀 형질주입 시약을 다른 원심분리 튜브의 4.5 밀리리터의 환원된 혈청 배지에 첨가하여 리포좀을 희석한다. 튜브를 튕겨서 완전히 섞은 다음 실온에서 5분 동안 그대로 두십시오.희석된 DNA 용액 1.5밀리리터가 들어 있는 각 튜브에 희석된 리포좀 용액 1.5밀리리터를 추가합니다. 완전히 혼합하고 플라스미드를 실온에서 최소 20분 동안 리포좀과 가교결합시킵니다. 페트리 접시에서 원래 배지를 버리고 각 접시에 환원 된 혈청 배지 9 밀리리터를 첨가하십시오.리포좀 DNA 혼합물 3 밀리리터를 넣고 플레이트를 앞뒤로 3 번 부드럽게 흔든 다음 플레이트에 혼합물을 고르게 분배하기 위해 좌우로 3 번 혼합하여 용액을 혼합합니다. 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에서 세포를 5%이산화탄소로 배양합니다. 4 내지 6시간 후에 배지를 교체하고 24 내지 36시간 동안 세포를 계속 배양한다.24 내지 36시간 후, 세포를 MG132로 최종 농도 10 마이크로몰로 4 내지 6시간 동안 처리한다. 배지를 버리고 세포를 얼음처럼 차가운 PBS로 2회 세척한다. 접시에 1 밀리리터의 PBS를 첨가하십시오.깨끗한 스크레이퍼로 세포를 긁어 제거하고 세포 현탁액을 미세 원심 분리 튜브로 옮깁니다. 700G에서 5분 동안 원심분리하여 세포 펠릿을 수집하였다. 프로테아제 억제제 칵테일이 보충된 800마이크로리터의 얼음처럼 차가운 FLAG 용해 완충액을 각 튜브의 세포에 추가합니다.와류 발진기 또는 피펫 건을 사용하여 세포를 혼합 한 다음 섭씨 4 도의 회전 장치에서 혼합물을 30 분 동안 배양합니다. 각 펄스가 1 초 동안 지속되는 얼음 위의 혼합물을 초음파로 처리하고 혼합물을 5-10 개의 짧은 펄스로 만듭니다. 혼합물을 섭씨 4도에서 30분 동안 40

purification-of-ubiquitinated-p53-proteins-from-mammalian-cells

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

Ubiquitination 세 효소의 집합으로 실시하는 핵심 posttranslational 수정합니다. 이 수정에 관여 유전자의 돌연변이가 여러 가지 인간의 질병와 관련된 있습니다. 여기, 우리는 교양 세포에 단백질 ubiquitination을 감지 프로토콜...

단백질 Ubiquitination의 감지

이 동영상은 복합 펩타이드 혼합물에서 잔류 디글리신 펩타이드를 포함하는 유비퀴틴닐화 펩타이드를 추출하고 정제하는 방법을 설명합니다. 제시된 방법은 단백질의 원래 유비퀴틴(ubiquitination) 부위를 확인하는 데 도움이 될 수 있습니다.

유비퀴틴화 펩타이드의 면역친화성 기반 추출: 정제된 펩타이드 분획에서 유비퀴틴 태그 펩타이드를 선택적으로 추출하는 기술

여기에 설명 된 메서드는 exogenous 항 바인딩과 그물 관련 저하 크로스-프레 젠 테이 션에 의해 처리 됩니다 세포질 구획의 정화에 대 한 수 있는 새로운 소포 격리 프로토콜입니다.

외 인 항 원 십자가-프레 젠 테이 션에의 바인딩과 그물 관련 성능 저하 막 구획의 정화

유비퀴틴 ligases와 달리 몇 E3 스모 ligases가 확인 되었습니다. 이 수정 된 생체 외에서 SUMOylation 프로토콜 생체 외에서 재구성 분석 결과 의해 소설 스모 E3 ligases를 확인 할 수 있다.

생체 외에서 스모 E3 리가 활동 공부 SUMOylation 분석 결과

우리는 복잡한 생물학적 샘플에서 유비퀴틴화 된 단백질에서 유래 한 diGly 펩티드의 정제, 검출 및 식별방법을 제시합니다. 제시된 방법은 유비퀴티노메 분석의 깊이 수준에 대하여 공표된 방법을 재현가능하고 견고하며 능가합니다.

펩타이드 농축 및 질량 분광법에 의한 단백질 유비퀴틴화 부위 검출

유비퀴틴화는 세포 과정에서 중요한 역할을 하는 번역 후 수정이며, 듀비퀴틴화에 의해 긴밀하게 조정됩니다. 두 반응의 결함은 인간의 병리를 뒷받침합니다. 우리는 정제 된 구성 요소를 사용하여 시험관 내에서 유비퀴틴화 및 듀비퀴틴화 반응을 수행하기위한 프로토콜을 제공합니다.

체외 유비퀴틴화 및 뉴클레오소말 히스톤의 이중화 율법의 비퀴틴화 어설션

이 프로토콜은 치료 또는 표현형과 같은 특정 조건과 관련된 이러한 종류의 번역 후 수정 (PTM)의 변경을 식별하기 위해 유비퀴틴 (Ub) 및 유비퀴틴 -좋아요 (Ubls) 특정 프로테오옴을 확립하는 것을 목표로합니다.

유비퀴틴 및 유비퀴틴과 같은 종속 적 번역 후 수정 및 중대한 변경 식별 프로파일링

이 방법은 유비퀴틴 체인 토폴로지의 글로벌 변화에 대한 평가를 설명합니다. 평가는 질량 분광계 기지를 둔 표적 proteomics 접근의 응용에 의해 수행됩니다.

병렬 반응 모니터링에 의한 유비퀴틴 연쇄 분석

우리는 포유동물 세포에서 특정 기질 및 E3 유비퀴틴 리가아제의 유비퀴틸화 검정을 위한 상세한 프로토콜을 제공한다. HEK293T 세포주는 단백질 과발현을 위해 사용되었고, 폴리유비퀴틸화된 기질은 면역침전에 의해 세포 용해물로부터 정제되고, SDS-PAGE에서 분해되었다. 면역블롯팅은 이러한 번역 후 변형을 시각화하기 위해 사용되었다.

포유동물 세포 용해물에서 E3 유비퀴틴-리가아제에 의한 기질 유비퀴틸화의 평가

유비퀴틴화는 세포 내 단백질 기능의 중요한 조절자입니다. 여기서는 포유류 세포에서 기질 단백질 유비퀴틴화 수준을 검출하는 두 가지 세포 용해 방법을 설명하고, 유비퀴틴화 수준 분석에 미치는 효과를 비교합니다. HEK293T 세포 내 단백질 과발현은 일시적 형질전환에 의해 유도되었고, 유비퀴틴화된 단백질은 웨스턴 블롯 분석을 통해 검출되었습니다.

SMAD2/SMURF2를 모델로 삼은 포유류 세포 용해체에서의 유비퀴틴화 검출 비교 전략

이 프로토콜은 포유류 세포 용해액 또는 순수 유비퀴틴 효소 복합체를 이용해 폐렴 구균을 유비퀴틴화하는 방법을 설명하며, 이후 정제된 VCP/p97-UFD1-NPLOC4 단백질 복합체로 처리하여 박테리오리네이션 활성을 평가하여 유비퀴틴 의존성 면역 효과 연구를 가능하게 합니다.

시험관 내 박테리아 유비퀴틴화 재구성 및 VCP/p97 매개 제거

학습하세요 포유류 세포에서 유비퀴틴화된 p53 단백질을 정제하는 방법을. 이 프로토콜은 단백질 기능 조절에서 유비퀴틴화의 역할을 연구하는 데 활용됩니다.

포유류 세포에서 유비퀴틴화된 p53 단백질의 정제

더 많은 동영상 탐색