Name: 조절된 세포 배양 배지에서 세포외 소포를 분리하기 위한 크기 배제 크로마토그래피 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: 배우세요 조절된 세포 배양 배지에서 크기 배제 크로마토그래피를 이용한 세포외 소포 분리 방법을. CD 마커 분석을 통해 세포 간 신호 전달 메커니즘 연구에 활용할 수 있습니다.

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저자는 Penn State Behrend와 Hamot Health Foundation의 자금 지원과 펜실베이니아 주 유니버시티 파크에있는 Penn State Microscopy Facility에 감사드립니다.

<ol><li>Pan, B. T., Teng, K., Wu, C., Adam, M., Johnstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopic+evidence+for+externalization+of+the+transferrin+receptor+in+vesicular+form+in+sheep+reticulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Electron microscopic evidence for externalization of the transferrin receptor in vesicular form in sheep reticulocytes.</a> The Journal of Cell Biology. 101 (3), 942-948 (1985).</li>
<li>Harding, C., Heuser, J., Stahl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-mediated+endocytosis+of+transferrin+and+recycling+of+the+transferrin+receptor+in+rat+reticulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Receptor-mediated endocytosis of transferrin and recycling of the transferrin receptor in rat reticulocytes.</a> The Journal of Cell Biology. 97 (2), 329-339 (1983).</li>
<li>Valadi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-mediated+transfer+of+mRNAs+and+microRNAs+is+a+novel+mechanism+of+genetic+exchange+between+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.</a> Nature Cell Biology. 9 (6), 654-659 (2007).</li>
<li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+Exosomes%2C+microvesicles%2C+and+friends%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends.</a> The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li>
<li>Rontogianni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+profiling+of+extracellular+vesicles+allows+for+human+breast+cancer+subtyping%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Proteomic profiling of extracellular vesicles allows for human breast cancer subtyping.</a> Communications Biology. 2 (1), 1-13 (2019).</li>
<li>Lane, R. E., Korbie, D., Hill, M. M., Trau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+as+circulating+cancer+biomarkers%3A+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles as circulating cancer biomarkers: opportunities and challenges.</a> Clinical and Translational Medicine. 7 (1), 14(2018).</li>
<li>Thompson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+in+neurodegenerative+disease-pathogenesis+to+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles in neurodegenerative disease-pathogenesis to biomarkers.</a> Nature Reviews Neurology. 12 (6), 346-357 (2016).</li>
<li>O'Brien, K., Ughetto, S., Mahjoum, S., Nair, A. V., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake%2C+functionality%2C+and+re-release+of+extracellular+vesicle-encapsulated+cargo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Uptake, functionality, and re-release of extracellular vesicle-encapsulated cargo.</a> Cell Reports. 39 (2), 110651(2022).</li>
<li>Joshi, B. S., de Beer, M. A., Giepmans, B. N. G., Zuhorn, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+of+extracellular+vesicles+and+release+of+their+cargo+from+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Endocytosis of extracellular vesicles and release of their cargo from endosomes.</a> ACS Nano. 14 (4), 4444-4455 (2020).</li>
<li>Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols in Cell Biology. 30 (1), 3-22 (2006).</li>
<li>Willms, E., Cabañas, C., Mäger, I., Wood, M. J. A., Vader, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+heterogeneity%3A+Subpopulations%2C+isolation+techniques%2C+and+diverse+functions+in+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle heterogeneity: Subpopulations, isolation techniques, and diverse functions in cancer progression.</a> Frontiers in Immunology. 9, 738(2018).</li>
<li>Tzaridis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+separation+techniques+impact+results+from+human+blood+samples%3A+Considerations+for+diagnostic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle separation techniques impact results from human blood samples: Considerations for diagnostic applications.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9211(2021).</li>
<li>Liangsupree, T., Multia, E., Riekkola, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+isolation+and+separation+techniques+for+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Modern isolation and separation techniques for extracellular vesicles.</a> Journal of Chromatography A. 1636, 461773(2021).</li>
<li>Gámez-Valero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-exclusion+chromatography-based+isolation+minimally+alters+extracellular+vesicles%27+characteristics+compared+to+precipitating+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Size-exclusion chromatography-based isolation minimally alters extracellular vesicles' characteristics compared to precipitating agents.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).</li>
<li>Mol, E. A., Goumans, M. J., Doevendans, P. A., Sluijter, J. P. G., Vader, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher+functionality+of+extracellular+vesicles+isolated+using+size-exclusion+chromatography+compared+to+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%3A+Nanotechnology%2C+Biology%2C+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Higher functionality of extracellular vesicles isolated using size-exclusion chromatography compared to ultracentrifugation.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (6), 2061-2065 (2017).</li>
<li>Campos-Silva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+detection+of+extracellular+vesicles+immune-captured+from+urine+by+conventional+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High sensitivity detection of extracellular vesicles immune-captured from urine by conventional flow cytometry.</a> Scientific Reports. 9 (1), 2042(2019).</li>
<li>Norman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L1CAM+is+not+associated+with+extracellular+vesicles+in+human+cerebrospinal+fluid+or+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">L1CAM is not associated with extracellular vesicles in human cerebrospinal fluid or plasma.</a> Nature methods. 18 (6), 631-634 (2021).</li>
<li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Mathieu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificities+of+exosome+versus+small+ectosome+secretion+revealed+by+live+intracellular+tracking+of+CD63+and+CD9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Specificities of exosome versus small ectosome secretion revealed by live intracellular tracking of CD63 and CD9.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-18 (2021).</li>
<li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+simplified+dichotomic+size-exclusion+chromatography+for+isolating+extracellular+vesicles+toward+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Establishment of a simplified dichotomic size-exclusion chromatography for isolating extracellular vesicles toward clinical applications.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (11), 12145(2021).</li>
<li>Benedikter, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafiltration+combined+with+size+exclusion+chromatography+efficiently+isolates+extracellular+vesicles+from+cell+culture+media+for+compositional+and+functional+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).</li>
<li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blotting%3A+sample+preparation+to+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Western blotting: sample preparation to detection.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2359(2010).</li>
<li>Grassucci, R. A., Taylor, D. J., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+macromolecular+complexes+for+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of macromolecular complexes for cryo-electron microscopy.</a> Nature Protocols. 2 (12), 3239(2007).</li>
<li>Williams, R. L., Urbé, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+shape+of+the+ESCRT+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The emerging shape of the ESCRT machinery.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (5), 355-368 (2007).</li>
<li>Willms, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+release+subpopulations+of+exosomes+with+distinct+molecular+and+biological+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Cells release subpopulations of exosomes with distinct molecular and biological properties.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-12 (2016).</li>
<li>Lehrich, B. M., Liang, Y., Fiandaca, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foetal+bovine+serum+influence+on+in+vitro+extracellular+vesicle+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Foetal bovine serum influence on in vitro extracellular vesicle analyses.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12061(2021).</li>
<li>Kornilov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+ultrafiltration-based+protocol+to+deplete+extracellular+vesicles+from+fetal+bovine+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1422674(2018).</li>
<li>Böing, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+isolation+of+extracellular+vesicles+by+size-exclusion+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).</li>
<li>Zhang, X., Borg, E. G. F., Liaci, A. M., Vos, H. R., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+three+step+protocol+to+isolate+extracellular+vesicles+from+plasma+or+cell+culture+medium+with+both+high+yield+and+purity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">A novel three step protocol to isolate extracellular vesicles from plasma or cell culture medium with both high yield and purity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1791450(2020).</li>
<li>Guerreiro, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+extracellular+vesicle+isolation+by+combining+cell+media+modifications%2C+ultrafiltration%2C+and+size-exclusion+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Efficient extracellular vesicle isolation by combining cell media modifications, ultrafiltration, and size-exclusion chromatography.</a> PLoS ONE. 13 (9), 02024276(2018).</li>
<li>Onódi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+high-purity+extracellular+vesicles+by+the+combination+of+iodixanol+density+gradient+ultracentrifugation+and+bind-elute+chromatography+from+blood+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Isolation of high-purity extracellular vesicles by the combination of iodixanol density gradient ultracentrifugation and bind-elute chromatography from blood plasma.</a> Frontiers in Physiology. 9, 1479(2018).</li>
<li>Yuana, Y., Levels, J., Grootemaat, A., Sturk, A., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-isolation+of+extracellular+vesicles+and+high-density+lipoproteins+using+density+gradient+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Co-isolation of extracellular vesicles and high-density lipoproteins using density gradient ultracentrifugation.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).</li>
</ol>

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

SEC는 컨디셔닝 CCM에서 EV를 적절하게 분리하기 위한 사용자 친화적인 방법입니다. 세포 유래 EV를 특이적으로 분리하기 위해서는 CCM의 유형과 보충제를 신중하게 고려해야 합니다. 많은 세포 배양 배지에는 혈청을 수확한 동물에서 추출한 EV가 포함된 FBS가 보충되어야 합니다. 이들 혈청 EV는 배양물(26)에서 세포로부터 유래된 EV에 의해 생성된 임의의 신호를 포화시키고 마스킹할 수 있다. 따라서, 실험을 수행할 때, EV-고갈된 FBS는 발견된 EV가 소 유래가 아닌 세포 유래에 기인할 수 있다는 것을 보장하기 위해 가능할 때마다 사용되어야 하며, EV는 상업적으로 구매되거나 다른 곳에서 검토된 다양한 기술을 통해 사내에서 만들어질 수 있다(26, 27).
SEC 열을 통해 샘플을 실행할 때는 필터링된 PBS를 사용해야 합...

세포외 소포(EV) 연구에 대한 관심의 폭발은 이러한 나노 크기의 이질적인 입자를 분리하고 연구하는 데 사용되는 기술과 기술의 주요 발전을 동반했습니다. 거의 40년 전에 발견된 이후1,2, 이 작은 막 구조는 생리활성 지질, 핵산 및 단백질을 포함하고 세포간 통신에서 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌습니다3,4. EV는 모든 세포 유형에서 방출되므로 혈장과 혈청, 타액 및 소변을 포함한 모든 생물학적 체액에 존재합니다. 이러한 유체 내의 EV는 신경 염증 및 신경 퇴행성 질환, 암 및자가 면역 질환 5,6,7을 포함한 다양한 질병에 대한 비 침습적 바이오 마커 역할을 할 큰 가능성을 가지고 있습니다. 또한, 배양액(3,8,9)으로 방출된 EV를 분리하여 세포 배양 기술을 통해 체외 기계론적 연구를 수행할 수 있다.
질병 병태생리학에서 EV의 역할을 이해하려면 EV가 발견되는 유체에서 적절한 분리가 가장 중요합니다. EV 분리의 황금 표준은 오랫동안 차동 초원심분리(dUC)10였지만 다른 세포 외 구성 요소에서 EV를 더 잘 분리하기 위해 보다 정교한 기술이 등장했습니다. 이러한 기술 중 일부에는 밀도 구배, 비대칭 유동 계장 유동 분획(A4F), 유세포분석, 면역포획, 폴리에틸렌 글리콜 침전 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC)11,12,13이 포함됩니다. 각 기술에는 고유 한 장점과 단점이 있습니다. 그러나, SEC는 특히 EV를 생물학적 유체 및 세포 배양 상청액 둘 다로부터 매우 효과적으로 분리하는 것으로 나타났다 8,14,15. SEC는 또한 비교적 간단하고 사용자 친화적이라는 추가 보너스를 가지고 있습니다.
SEC는 크기에 따라 유체의 구성 요소를 분리하는 방법입니다. 이 기술을 사용하면 수지 컬럼 (자체 제작 또는 상업적으로 구매)을 사용하여 샘플을 분획합니다. 샘플의 작은 입자는 수지 내의 비드 사이에 갇히는 반면, 큰 입자는 수지를 더 자유롭게 통과할 수 있으므로 공정 초기에 용리됩니다. EV는 많은 세포외 단백질 및 단백질 응집체보다 크기가 크기 때문에 EV는 컬럼을 더 빨리 통과하고 세포외 단백질보다 초기 분획에서 용리됩니다14.
이 방법 논문에서는 제어 및 소포체(ER) 스트레스 조건 모두에서 인간 희소돌기아교세포로부터 세포 배양 배지(CCM)로부터 EV를 분리하기 위한 SEC의 사용에 대해 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하면 이 기술로 분리된 EV가 함께 풀링되고 다운스트림 특성화를 위해 농축될 수 있는 특정 분획 내에서 발견되며, 분리된 EV는 CCM을 보충하는 데 사용되는 태아 소 혈청(FBS)과 같은 외인성 공급원이 아닌 세포에서 파생되는 것으로 나타났습니다. EV 분획에서 표준 EV 마커 CD63, CD81 및 CD9 16,17,18,19의 존재와 단백질 분획에서의 이들의 부재는 웨스턴 블로팅으로 입증된다. 투과 전자 현미경(TEM)을 사용하여 EV를 시각화하고 예상 형태를 표시하며 EV 분획에서만 관찰됩니다. 입자는 또한 대조군 및 ER 스트레스 조건 모두에서 EV 및 단백질 분획에서 계수되며, EV 샘플에서 직경 50-200nm의 예상 크기 범위 내의 많은 수의 입자가 관찰됩니다. 이러한 데이터는 SEC가 세포 배양 배지에서 EV를 분리하는 효율적이고 효과적인 방법이라는 개념을 뒷받침합니다.

<table><tbody><tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>VWR</td><td>97064-588</td><td></td></tr><tr><td>4X Laemmli 시료 완충액</td><td>BioRad</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 원심 필터 장치, Ultracel, 3 KDa, 15mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>UFC900308</td><td>3 kDa 차단 Amicon</td></tr><tr><td>Ultra-2 Ultracel-3 멤브레인</td><td>포함 Sigma-Aldrich</td><td>UFC200324</td><td>3 kDa 차단</td></tr><tr><td>암모늄 퍼설페이트</td><td>시그마-알드리치</td><td>A3678-100G</td><td></td></tr><tr><td>안티 토끼 IgG, HRP 연계 항체</td><td>세포 신호 기술</td><td>7074V</td><td>1:1000 희석</td></tr><tr><td>안티-칼넥신 항체</td><td>Abcam</td><td>&nbsp; ab22595</td><td>1:500 희석</td></tr><tr><td>Anti-CD9 마우스 단클론 항체</td><td>BioLegend</td><td>312102</td><td>1:500 희석</td></tr><tr><td>Anti-GM130 항체 [EP892Y] - cis-Golgi Marker</td><td>Abcam</td><td>ab52649</td><td>1:500 Dilution</td></tr><tr><td>Anti-mouse IgG, HRP 관련 항체</td><td>세포 신호 전달 기술</td><td>7076V</td><td>1:1000 희석</td></tr><tr><td>자동 분획 수집기</td><td>Izon Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BCA 분석 키트</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD 카메라</td><td>Gatan Orius SC200</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cd63 마우스 안티 휴먼</td><td>BD</td><td>556019</td><td>1:1000 희석</td></tr><tr><td>CD81 항체</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-23962</td><td>1:1000 희석</td></tr><tr><td>Cellstar 필터 캡 세포 배양 플라스크</td><td>Greiner Bio-One</td><td>660175</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc MP Imager</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clarity Western ECL Substrate</td><td>BioRad</td><td>1705061</td><td></td></tr><tr><td>deoxycholate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750-10G</td><td></td></tr><tr><td>dithiothreitol</td><td>Sigma</td><td>3483-12-3</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/L-글루타민이 함유된 고포도당;</td><td>Cytiva</td> SH300022 나트륨 없음<td>. FS</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청 프리미엄 등급</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청, 엑소좀 고갈</td><td>Thermo Scientific</td><td>A2720801</td><td></td></tr><tr><td>글리신</td><td>BioRad</td><td>1610718</td><td></td></tr><tr><td>큰 가치 무지방 분유</td><td>아마존</td><td>B076NRD2TZ</td><td></td></tr><tr><td>HOG 인간 희소돌기아교종 세포주</td><td>시그마-알드리치</td><td>SCC163</td><td></td></tr><tr><td>Izon Science Usa Ltd qev 크기 제외 컬럼 5pk</td><td>Izon Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>메탄올 >99.8% ACS</td><td>VWR</td><td>BDH1135-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN 유리 플레이트</td><td>BioRad</td><td>1653310</td><td>(0.75mm 스페이서 포함</td></tr>) <tr><td>Mini-PROTEAN 짧은 플레이트</td><td>BioRad</td><td>1653308</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>492016</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신, 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458-100mL</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP66150</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA 단백질 분석 키트 및 시약</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Pierce PVDF Transfer Membranes</td><td>Thermo Scientific</td><td>88518</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Western Blotting Filter Paper</td><td>Thermo Scientific</td><td>84783</td><td></td></tr><tr><td>폴리옥시에틸렌-20 (TWEEN 20), 500mL</td><td>바이오 베이직</td><td>TB0560</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제/포스파타제 억제제 칵테일 (100X)</td><td>세포 신호 전달 기술</td><td>5872S</td><td></td></tr><tr><td>재조합 항-TSG101 항체 [EPR7130(B)]</td><td>ABCam</td><td>ab125011</td><td>1:1000 희석</td></tr><tr><td>수산화슬라듐</td><td>시그마-알드리치</td><td>SX0603</td><td></td></tr><tr><td>소듐 아지드</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP922I-500</td><td></td></tr><tr><td>소듐 클로라이드</td><td>시그마-알드리치</td><td>S9888-500G</td><td></td></tr><tr><td>소듐 도데실 설페이트,&ge; 99.0%(GC), 먼지가 없는 펠릿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75746-1KG</td><td></td></tr><tr><td>테트라메틸에틸렌디아민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281-25ML</td><td></td></tr><tr><td>TGX 얼룩 방지 FastCast 아크릴아미드 키트, 10%</td><td>BioRad</td><td>1610183</td><td></td></tr><tr><td>투과 전자 현미경</td><td>FEI Tecnai 12 Biotwin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>BioRad</td><td>1610716</td><td></td></tr><tr><td>트립신 0.25% 프로테아제와 돼지 트립신, HBSS, EDTA; 칼슘 없음, 마그네슘</td><td>Cytiva</td><td>SH30042.01</td><td></td></tr><tr><td>투니카마이신</td><td>Tocris</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Zeta View 소프트웨어</td><td>Analytik</td><td></td><td>NTA 소프트웨어</td></tr></tbody></table>

조절된 세포 배양 배지에서 세포외 소포를 분리하기 위한 크기 배제 크로마토그래피

Size Exclusion Chromatography for Separating Extracellular Vesicles from Conditioned Cell Culture Media

세포외 소포(EV)는 모든 세포에서 방출되고 모든 생체 유체에 존재하며 단백질, 핵산 및 이들이 유래한 모 세포를 반사하는 지질을 포함하는 나노 크기의 지질막 결합 구조입니다. 샘플의 다른 구성 요소에서 EV를 적절하게 분리하면 관련 화물의 특성을 분석할 수 있으며 수많은 질병에 대한 세포 간 통신기 및 비침습적 바이오마커로서의 잠재력에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 현재 연구에서 희소돌기아교세포 유래 EV는 다른 세포외 단백질 및 단백질 복합체에서 EV를 분리하기 위해 한외여과 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 포함한 최첨단 기술의 조합을 사용하여 세포 배양 배지에서 분리되었습니다. 시판되는 SEC 컬럼을 사용하여, EV는 대조군 및 소포체(ER) 스트레스 조건 모두에서 인간 희소돌기아교종 세포로부터 방출된 세포외 단백질로부터 분리되었다. 표준 EV 마커 CD9, CD63 및 CD81은 분획 1-4에서 관찰되었지만 분획 5-8에서는 관찰되지 않았습니다. 골지체의 단백질인 GM130과 ER의 필수 단백질인 칼넥신을 음성 EV 마커로 사용하였으며, 어떤 분획에서도 관찰되지 않았다. 또한, 분획 1-4를 EV 분획으로, 분획 5-8을 단백질 분획으로 풀링하여 농축하였을 때, EV 분획물에서 CD63, CD81, 및 CD9의 발현이 관찰되었다. GM130 또는 칼넥신의 발현은 분획 유형 중 어느 것에서도 관찰되지 않았다. 대조군 및 ER 스트레스 조건 모두에서 풀링된 분획을 투과 전자 현미경으로 시각화하고 소포는 EV 분획에서 관찰되었지만 단백질 분획에서는 관찰되지 않았습니다. 두 조건의 EV 및 단백질 분획의 입자도 나노입자 추적 분석으로 정량화하였다. 이러한 데이터는 SEC가 컨디셔닝 된 세포 배양 배지에서 EV를 분리하는 효과적인 방법임을 보여줍니다.

웨스턴 블로팅은 CCM에서 EV의 적절한 분리를 보여줍니다. 세포 배양 배지에서 EV를 분리하기 위한 SEC의 효과를 평가하기 위해 대조군 샘플의 각 개별 분획을 사용하여 웨스턴 블롯을 실행하여 음성 대조군으로 사용된 3개의 표준 EV 마커인 CD9, CD63 및 CD81과 GM130 및 칼넥신18의 발현을 조사했습니다(그림 3). 알부민 발현18 은 또한 CCM의 세포외 단백질이 EV로부터 적절하게 분리될 수 있는지 확인하기 위해 프로빙되었다. CD9, CD63 및 CD81의 강한 발현은 분획 1-4에서 관찰되었으며, 분획 5-8에서는 발현이 거의 또는 전혀 없었다. GM130이나 칼넥신은 어떤 분획에서도 관찰되지 않았습니다. 알부민은 분획 6-8에서만 존재했습니다. 함께, 이러한 데이터는 소포가 주로 분획 1-4로 용리되고 분획 5-8이 세포 외 단백질...

여기서 프로토콜은 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 세포외 소포가 컨디셔닝 세포 배양 배지로부터 적절하게 분리될 수 있음을 보여줍니다.

Extracellular vesicles (EVs) are nano-sized lipid-membrane bound structures that are released from all cells, are present in all biofluids, and contain ...

조건 세포 배양 배지와 같은 체액에서 세포 외 소포를 분리하면 연구자가 전낭화물을 특성화하고 세포 내 통신 메커니즘을 탐색 할 수 있습니다. 이 기술은 간단하고 사용자 친화적인 컨디셔닝 세포 배양 배지에서 EV와 세포외 단백질을 충분히 분리할 수 있도록 합니다. 시작하려면 PBS를 섭씨 37도 수조에 놓습니다.대조군 및 튜니카마이신 처리된 세포 배양 플라스크를 10 x 및 100 x 대물 렌즈가 있는 복합 현미경으로 관찰합니다. 플라스크 간의 차이점을 기록해 두십시오. 플라스크에서 배지를 제거하고 50 밀리리터 튜브에 넣습니다.그런 다음 섭씨 4도에서 5 분 동안 500G의 튜브를 원심 분리하고 수퍼 액액을 새 튜브로 옮깁니다. 섭씨 4도에서 20 분 동안 2000G의 튜브를 원심 분리합니다. 상청액을 새 튜브로 옮기고 튜브를 얼음 위에 놓습니다.4 개의 15 밀리리터 3 킬로 달톤 컷오프 울트라 여과 장치를 가져 와서 각 튜브에 5 밀리리터의 PBS를 추가하십시오. 섭씨 4도에서 10 분 동안 4, 000 G의 장치를 원심 분리하여 필터를 프라이밍하십시오. 장치에서 PBS를 제거한 후 대조군 및 처리된 조건에서 상청액을 각각 약 12.5밀리리터의 배지가 있는 두 개의 한외 여과 장치로 나눕니다.튜브를 섭씨 4도에서 1시간 45분 동안 4, 000 G에서 원심분리하거나 각 단위의 농축된 배지 또는 잔류물이 250 마이크로리터 이하가 될 때까지 원심분리한다. 두 제어 장치의 잔류물을 라벨이 부착된 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 처리된 장치에서 다른 튜브로 옮깁니다. 각 마이크로 원심분리기 튜브에 있는 잔류물의 총 부피를 측정합니다.부피가 500 마이크로리터 미만인 경우, 최종 부피가 500 마이크로리터가 될 때까지 0.22 마이크로론 여과된 PBS를 첨가한다. 섭씨 영하 80도 냉동고에 튜브를 놓습니다. 자동 분수 수집기 또는 AFC를 켭니다.섭씨 4도에서 컬럼을 제거하고 컬럼을 실온으로 예열합니다. 영하 80도의 냉동고에서 잔류물 샘플을 꺼내 얼음 위에 올려 해동시킨 후 기다리는 동안 뚜껑이 안쪽을 향하도록 AFC 캐러셀에 라벨이 붙은 1.5밀리리터 튜브 8개를 놓습니다. 바코드가 리더기를 향하도록 열을 AFC에 삽입하고 각각 500마이크로리터의 8개 분획을 수집하고 버퍼 볼륨을 기본값으로 조정하도록 설정을 조정합니다.그런 다음 화면의 지침을 확인하여 컬렉션을 시작합니다. 저장 버퍼가 컬럼 매트릭스의 상부 부분으로 완전히 흡수된 후. 컬럼에 PBS 15ml를 추가하여 컬럼 세척을 시작합니다.PBS는 저장 버퍼를 희석시키고 적절한 플러싱을 방지하므로 너무 일찍 추가하지 마십시오. 15 밀리리터의 PBS가 매트릭스에 흡수되기 직전에 확인을 클릭하여 플러싱을 중지하고 마이크로 피펫으로 컬럼 매트릭스 상단에서 잔류 PBS를 제거합니다. 매트릭스를 만지지 마십시오.컬럼 중앙에 500마이크로리터의 시료를 추가하고 확인을 클릭하여 실행을 시작합니다. 샘플이 매트릭스에 완전히 흡수된 후 즉시 8밀리리터의 PBS를 컬럼에 첨가합니다. AFC는 각각 500 마이크로 리터의 8 개 분획을 모두 수집하기 전에 캐러셀 중앙으로 보이드 볼륨을 자동으로 제거합니다.실행 후 회전 목마에서 분수를 제거하고 얼음 위에 놓습니다. 그런 다음 캐러셀 중앙에서 빈 공간 볼륨을 제거합니다. 다음으로, 컬럼에 PBS 10ml를 추가하여 컬럼에서 잔류 샘플을 세척합니다.그리고 회개 한 샘플이 완전히 플러시되면 컬럼에 15 밀리리터의 PBS를 첨가하십시오. 최종 PBS가 매트릭스에 흡수됨에 따라 컬럼 매트릭스의 중앙에 500 마이크로리터의 0.5몰 수산화나트륨을 추가합니다. 그런 다음 수산화나트륨이 흡수되면 컬럼에 PBS 30ml를 넣고 플러시합니다.모든 샘플이 완료되면 컬럼에 0.05% 아지드화나트륨 15밀리리터를 추가하여 나중에 사용할 수 있도록 컬럼을 보존합니다. 컬럼 매트릭스의 상단에 약 5 밀리리터의 나트륨 아 지드화물을 남겨 둡니다. 보관을 위해 기둥을 섭씨 4도에 놓기 전에 AFC에서 기둥을 제거하고 상단 및 하단 캡을 부착합니다.울트라 필트레이션 장치를 구성합니다. 샘플당 2밀리리터, 3킬로달톤 컷오프 초여과 장치를 얻습니다. 각 단위는 실린더를 통해서 콘, 여과기 및 교류의 3개 부품으로 구성됩니다.각 부품에 적절하게 라벨을 붙입니다. 필터 부분에 1 밀리리터 PBS를 추가하고 콘 조각으로 캡을 씌 웁니다. 한외여과 유닛 콘 쪽을 섭씨 4도에서 10분 동안 3, 500 G에서 위로 향하게 하고 여과된 PBS를 실린더를 통한 유동으로부터 제거한다.한외여과 장치를 거꾸로 뒤집고 섭씨 4도에서 1000G에서 2분 동안 원심분리하여 남아 있는 PBS를 제거합니다. 각 분획의 4 개의 500 마이크로 리터를 결합하여 한외 여과 장치에 첨가하십시오. 그런 다음 원심 분리기 컬럼은 섭씨 4도에서 3, 500G에서 1 시간, 45 분 동안 또는 잔류물 수준이 100 마이크로 리터가 될 때까지 일치합니다.실린더를 통과하는 흐름을 제거하고 흐름을 폐기하십시오. 울트라 필트레이션 장치를 거꾸로 뒤집고 섭씨 4도에서 1000XG에서 2분 동안 원심분리합니다. 튜브를 섭씨 영하 80도 냉동고에 넣기 전에 콘의 잔류물을 1.5밀리리터 튜브로 옮기고 0.22미크론 여과된 PBS로 샘플 부피를 150마이크로리터로 만듭니다.개별 분획의 대표적인 웨스턴 블록은 CD9, CD63, 및 CD81의 강한 발현을 나타내었다. 1-4 위반 및 표현 위반이 거의 또는 전혀 없음 5-8. 어떤 분획에서도 GM130 또는 칼넥신의 발현이 관찰되지 않았다.알부민은 분획 6 내지 8개로만 존재하였다. EV 및 단백질 분획을 농축하는 효과도 평가하였다. 세포 용해물에서 CD9 및 CD63의 발현이 관찰되었다.3개의 CD 단백질 모두 대조군 및 튜니카마이신 처리된 샘플의 EV 분획에는 존재했지만 단백질 분획에는 존재하지 않았습니다. 종양 감수성 유전자 101은 세포 용해물에는 존재했지만 EV 또는 단백질 분획에는 존재하지 않았습니다. GM130 및 칼넥신은 세포 용해물에서만 관찰되었다.엑소좀이 고갈된 세포 배양 배지의 웨스턴 블롯에서, EV 마커는 세포 용해물에는 존재했지만 배지 샘플에는 존재하지 않았다. 알부민 발현은 세포 용해물에서 단백질 분획 및 최소 발현에서 관찰되었다. TEM 관찰은 대조군 및 튜니카마이신 처리된 샘플의 EV 분획에서 구형 구조를 입증했습니다.이들 구조는 어느 샘플 유형의 단백질 분획에서도 관찰되지 않았다. 나노입자 추적 분석은 대조군과 비교하여 EV 분획에서 대조군 및 처리된 분획의 입자 농도의 차이를 보여주며, 튜니카마이신 처리에서 약간 더 많은 입자가 존재하였다. 그러나 단백질 분획에서는 EV에 비해 더 적은 입자가 검출되었습니다.제어 및 처리 조건에 대해 동일한 샘플 부피를 갖는 것이 중요하므로 다른 처리의 EV를 쉽게 비교할 수 있습니다. 조건 세포 배양 배지에서 EV를 분리한 후 단백질체학 RNA 시퀀싱 및 지질체학을 사용하여 소포의 단백질, RNA 및 지질 함량을 특성화할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

출처: Watson, DC, et al. 대장균 및 기타 박테리아로부터 세포외 소포의 확장 가능한 분리 및 정제. J. Vis. 경험. (2021년)이 비디오는 박테리아 배양 여과액에서 박테리아 세포외 소포(EV)를 분리하기 위해 다공성 수지 비드를 사용한 크기 배제 크로마토그래피를 사용하는 방법을 보여줍니다. 더 큰 EV는 수지 기공을 우회하여 조기에 용리되는 반면, 더 작은 단백질은 기공으로 들어가 나중에 용리됩니다.

크기배제 크로마토그래피를 이용한 박테리아 세포외 소포의 분리 

이 동영상은 뇌 면역 세포인 미세아교세포에서 유래한 세포외 소포체 또는 EV를 분리하기 위해 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 기반으로 하는 방법을 설명합니다. EV는 면역 반응을 조절하는 매개체를 전달하는 분자 화물 역할을 합니다. 따라서 분리된 EV는 뉴런 면역 반응 중 미세아교세포-뉴런 누화를 연구하기 위한 체외 모델로 사용할 수 있습니다.

SEC 기반 Microglia 유래 세포 외 소포의 분리: Microglia Conditioned Culture Media에서 세포 외 소포를 분리하는 기술

이 동영상은 특성화 연구에 적합한 세포외 소포체의 하위 집단을 분리하기 위한 밀도 구배 초원심분리 기반 정제 방법을 보여줍니다.

Purification of subpopulations of extracellular vesicles: A technique to purify subpopulations of extracellular vesicles using Density Gradient Ultracentrifugation(밀도 구배 초원심분리를 사용하여 세포외 소포의 하위 집단을 정제하는 기술)

이 비디오에서는 박테리아에서 유래한 외막 소포 또는 OMV의 이질적인 집단을 분리하는 기술(크기 배제 크로마토그래피)을 시연합니다. 이러한 소포는 나노 크기의 구형 구조이며 크기 배제 크로마토그래피를 통해 크기에 따라 크고 작은 하위 모집단으로 분리됩니다.

Size Exclusion Chromatography Based Separation of Bacterial Extracellular Vesicles: A technique to separateing of gram-negative bacterial outer membrane vesicles (박테리아 세포외 소포체의 이질성 집단을 크기에 따라 분리하는 기술)

이 동영상은 결핵균(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)의 배양 여과액에서 박테리아 세포외 소포체(EV)를 정제하기 위한 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 기술을 보여줍니다. 이 기술은 다공성 수지 충전 컬럼을 사용하여 EV의 정제된 분획을 얻습니다. 다공성 입자는 더 작은 단백질이 기공으로 들어가도록 선택적으로 허용하여 용리 속도를 늦춥니다. 동시에 EV는 크기가 크기 때문에 모공으로 들어가는 것이 배제되고 먼저 용출됩니다.

Mycobacterial Extracellular Vesicles를 정제하기 위한 크기 배제 크로마토그래피 기술

이 기사에서는 예쁜꼬마선충을 세포외 소포를 생성, 정화 및 정량화하는 방법을 제시합니다.

예쁜꼬마선충의 정화 및 분석 세포외 소포

세균성 소포는 병인에 중요한 역할을 하고 유망한 생명 공학 응용 프로그램이 있습니다. 소포의 이질성은 분석과 사용을 복잡하게 합니다. 따라서 다양한 크기의 소포를 분리하는 간단하고 재현 가능한 방법이 필요합니다. 여기에서, 우리는 Aggregatibacter actinomycetemcomitans에의해 생성된 이기종 소포를 분리하기 위하여 크기 배제 크로마토그래피의 사용을 보여줍니다.

크기 배제 크로마토그래피는 세균 외부 막 소포 이질성을 분석

박테리아는 생리 활성 생물학적 분자를 운반하는 나노 미터 크기의 세포 외 소포 (EV)를 분비합니다. EV 연구는 생물 발생, 미생물-미생물 및 숙주-미생물 상호 작용 및 질병에서의 역할, 잠재적 인 치료 응용 프로그램을 이해하는 데 중점을 둡니다. EV 연구의 표준화를 촉진하기 위해 다양한 박테리아로부터 EV를 확장 가능한 분리를 위한 워크플로우가 제시됩니다.

대장균 및 다른 박테리아로부터의 세포외 소포의 확장 가능한 분리 및 정제

세포외 소포체는 생물의학 응용 분야에 엄청난 가능성을 가지고 있지만, 현재의 분리 방법은 시간이 많이 걸리고 임상적으로 사용하기에는 비실용적입니다. 이 연구에서는 최소한의 단계로 연속적으로 많은 양의 생체 유체에서 세포외 소포체를 직접 분리할 수 있는 미세유체 장치를 제시합니다.

분기된 A4F 미세유체 장치를 사용한 대용량 시료에서 세포외 소포의 단일 단계 분리

이 프로토콜은 중간엽 기질 세포에서 방출되는 세포외 소포체(EV)를 분류하는 방법에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 특히 기기 설정 및 분류 조건의 최적화에 중점을 둡니다. 목표는 세포외 소포체의 특성을 보존하면서 분류하는 것입니다.

세포외 소포 격리를 위한 성공적인 분류 설정

이 프로토콜은 효소 소화 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 소변 골격근과 골수에서 작은 세포외 소포를 분리하여 구조적으로 복잡하고 저수율 조직에서 소포 농축 분획을 재현 가능하게 회수하여 하위 분자 분석에 활용할 수 있도록 합니다.

크기 배제 크로마토그래피를 이용한 쥐 골격근 및 골수에서 작은 세포외 소포 분리

배우세요 조절된 세포 배양 배지에서 크기 배제 크로마토그래피를 이용한 세포외 소포 분리 방법을. CD 마커 분석을 통해 세포 간 신호 전달 메커니즘 연구에 활용할 수 있습니다.

조절된 세포 배양 배지에서 세포외 소포를 분리하기 위한 크기 배제 크로마토그래피

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