Name: 염소 스티플 관절의 슬개골 하 지방 패드에서 중간엽 줄기 세포의 분리, 확장 및 분화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: 배우세요 염소 슬개골 하 지방 패드에서 중간엽 줄기 세포(IFP-MSCs)를 분리, 확장 및 분화시키는 방법을. 이 기술은 연골 재생 및 조직 공학 연구에 활용됩니다.

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SH는 IIT Kanpur의 Institute Post-Doctoral Fellowship 및 DST (SEED Division) (SP / YO / 618 / 2018)의 SYST 보조금의 지원을 인정합니다. AM은 인도 공과 대학-칸푸르 (IIT-Kanpur)를 연구소 펠로우십으로 인정합니다. DSK는 Gireesh Jankinath 석좌 교수직 및 인도 생명 공학과에 자금 지원을 인정합니다 (BT / PR22445 / MED / 32 / 571 / 2016). AM, SH 및 DSK는 IIT-Kanpur의 의학 공학을위한 메타 가족 센터의 관대 한 지원에 감사드립니다.

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

본 프로토콜에서, 염소 IFP로부터 MSC의 단리를 위한 간단하고 신뢰할 수 있으며 재현 가능한 방법이 제공되었다. 이 방법을 사용하여 분리 된 세포는 시험관 내 조직 재생을위한 이전 연구에서 성공적으로 사용되었습니다. 단리된 세포는 증식하고, 다양한 성장 인자에 반응하며, 전기방사 섬유 및 스캐폴드25,26 상에 파종될 때 이들의 생물학적 활성을 유지하는 것으로 관찰되었다. 또한, 시험관 내 관절 연골을 설계하기 위해 주사 가능한 하이드로겔에서 연골세포와 많은 고품질 MSC를 얻고 공동 배양할 수 있는 것으로 관찰되었습니다 27,28,29. 세포의 해부 및 분리 절차는 간단하지만 IFP에서 MSC를 성공적으로 분리하고 확장하기...

중간엽 줄기세포(MSC)는 재생 의학 1,2에서 세포 기반 요법의 매력적인 후보입니다. 골수, 탯줄, 태반, 치수 및 피하 지방 조직과 같은 다양한 조직 공급원에서 수확 할 수 있습니다3. 그러나 성인에서 줄기 세포의 가용성이 제한적이고 분리 절차가 종종 침습적이기 때문에 (기증자 부위 이환율을 초래) 이러한 문제를 피할 수있는 대체 줄기 세포 공급원을 갖는 것이 바람직합니다.
무릎 관절은 슬개하부 지방 패드 유래 MSC, 활막 유래 MSC, 활액 유래 MSC, 인대 섬유아세포, 관절 연골세포 등다양한 세포 유형의 저장소입니다. 이 세포는 근골격계 조직 공학 기반 연구에서 널리 탐구 될 가능성이 있습니다. 따라서 무릎 관절은 여러 유형의 MSC의 가능하고 신뢰할 수있는 공급원이 될 수 있습니다. 슬개골 하 지방 패드 (IFP) 또는 Hoffa의 지방 패드로 알려진 무릎 관절에 위치한 지방 저장소는 MSC 저장소의 유망하고 대안적인 선택입니다. IFP는 무릎 관절경 검사 또는 개복 무릎 수술 중에 수술 폐기물로 일상적으로 절제되고 폐기되기 때문에 비교적 쉽게 접근 할 수 있고 임상 적으로 얻을 수있는 MSC 공급원입니다. IFP의 제거는 최소 기증자 부위 이환율과 관련이 있으며, 이는 또한 매력적인 조직 공급원이됩니다. 유사한 표현형 프로파일을 가지고 있지만, IFP의 MSC (IFP-MSCs)는 골수 유래 중간 엽 줄기 세포 (BM-MSC)와 비교할 때 클론 생성 잠재력이 향상되고 피하 지방 유래 줄기 세포 (ADSC)에 비해 더 나은 증식 능력을 가지고 있습니다 7. 흥미롭게도 활액 유래 MSC (SF-MSC)와 비교하여 IFP-MSC는 늦은 계대에서 증식 능력을 잃지 않으며 늦은 계대에서 배가 시간이 증가하지도 않습니다. 이는 세포 확장 동안, IFP-MSC가 이들의증식 속도(8)를 손상시키지 않으면서 시험관내 조직 공학 응용을 위해 충분히 많은 수의 세포를 달성할 수 있음을 시사한다. 최근 연구에 따르면 IFP-MSC는 골수 유래 MSC (BMSC) 및 지방 유래 MSC (ADSC)에 비해 우수한 연골 생성 분화 잠재력을 가지고 있으며, 이는 아마도 관절 연골에 대한 해부학 적 근접성으로 인해 연골 조직 공학에 대한 적합성을 나타냅니다 6,7,9,10. 또한, 그들은 또한 연령 독립적 인 골 형성 분화 잠재력을 가지고 있습니다11. IFP-MSC의 관절 내 주사는 골관절염 (OA) 환자의 통증을 줄이고 무릎 관절 기능을 향상시키는 것으로 나타났습니다12,13. 또한, 병리학 적 조건 동안 염증성 사이토 카인의 존재하에 IFP-MSC의 강력한 면역 억제 반응 및 개선 된 면역 조절 특성이보고되었다6.
IFP-MSC는 MSC의 유망하고 대체 소스입니다. 그러나 조직 공학 및 재생 의학에서의 치료 적 이점은 상대적으로 덜 탐구됩니다. IFP-MSC에 대한 기존 연구는 주로 인간 기증자의 세포를 활용했습니다. 이 중 최근 몇 가지 연구에서는 건강한 인간 기증자 (비 관절염 환자, 17-60 세)의 IFP-MSC를 조사한 반면,14 대부분의 연구에서는 무릎 교체 수술을받는 노인 환자 (질병 환자, 70-80 세)의 IFP-MSC를 사용했습니다. 나이와 질병 모두 줄기 세포의 정상적인 기능을 변화시키는 것으로 알려져 있기 때문에 (수 감소 및 기능적 잠재력 상실), 이는 잠재적으로 MSC 기반 연구 7,15,16,17의 결과에 불일치를 초래할 수 있습니다. 그 외에도 병태생리학적 상태(예: 관절염 및 비만)가 있는 환자의 IFP-MSC를 사용하면 시험관 내에서 건강한 세포의 기본 특성을 이해하는 데 어려움이 있어 중간엽수 기반 치료법 개발에 제한 요소로 작용합니다. 이러한 문제를 극복하기 위해서는 건강한 기증자의 IFP-MSC를 사용하는 것이 중요합니다. 건강한 인간 기증자에 대한 접근이 어렵 기 때문에 동물 모델이 더 나은 대안이 될 수 있습니다. 이와 관련하여 IFP가 마우스18에서 분리 된 몇 가지 연구가 있습니다. 그러나, 정상 마우스에서 지방 패드의 크기가 작기 때문에, 다수의 동물로부터의 지방 조직이 정교한 실험 절차(19)를 실행하기에 충분한 조직을 얻기 위해 결합되었다. 따라서, 더 많은 수의 세포에 대한 요구 사항을 충족시키고 동시에 동물 연구20에서 3R 원칙 (정제, 교체 및 감소)을 준수 할 수있는 대형 동물 모델이 필요합니다. 큰 동물의 사용은 중개 연구에서 중요한 의미를 갖는다. 특히, 근골격계 조직 공학에서는 개, 돼지, 양, 염소 및 말과 같은 다양한 대형 동물이 조사되었습니다21. 염소 (Capra aegagrus hircus)는 질식 관절이 인간의 무릎 관절22,23,24에 가장 가까운 해부학 적 구조를 가지고 있기 때문에 큰 동물의 탁월한 선택입니다. 염소의 연골하 골 섬유주 구조와 연골하 뼈 두께는 인간과 유사하며 연골과 뼈의 비율도 인간에 가까운 것으로 보고됩니다21. 또한 염소는 전 세계적으로 널리 길들여져 골격이 성숙했을 때 쉽게 구할 수 있습니다. 또한 유지 보수 비용이 낮고 취급이 용이하여 연구22에 매력적인 동물 모델이되었습니다.
본 연구에서, Capra aegagrus hircus (염소)의 질식 관절로부터 IFP-MSC를 분리하기위한 간단한 프로토콜과 이들의 확장 및 분화를위한 시험관 내 배양 조건이 입증된다. 분리된 세포는 부착되어 있고, MSC 유사 형태를 가지며, CFU-F(콜로니 형성 단위-섬유아세포) 콜로니를 형성하고, 지방형성, 연골성 및 골형성 분화 잠재력을 가지고 있습니다. 따라서 IFP-MSC는 생물 의학 응용 분야를위한 MSC의 대체 공급원으로서의 잠재력을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>&beta;-글리세로인산</td>염 <td>Sigma-Aldrich</td><td>G9422-10G</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>0.25% Trypsin- 0.02% EDTA</td><td>Hi-Media</td><td>TCL049</td><td></td></tr><tr><td>15-mL 원심분리관</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt</td><td>Sigma</td><td>49752-10G</td><td>50 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>2-프로판올</td><td>시그마-알드리치</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES)</td><td>HiMedia</td><td>TCL021-50ml</td><td>10mM</td></tr><tr><td>50mL 원심분리관</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue</td><td>Hi-Media</td><td>RM471</td><td>sufated gycosaminoglycans 염색용</td></tr><tr><td>Alizarin Red S</td><td>S D Fine-Chem Limited</td><td>26048-25G</td><td>칼슘 증착을 위해</td></tr><tr><td>암포테리신 B</td><td>HiMedia</td><td>A011</td><td>2.5 &마이크로; g/mL</td></tr><tr><td>염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)</td><td>Sino Biologicals</td><td>10014-HNAE</td><td>5 ng/mL</td></tr><tr><td>BCIP/NBT ALP 기판</td><td>시그마</td><td>B5655-5TAB</td><td>ALP 염색용</td></tr><tr><td>생물학적 안전 캐비닛</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>HiMedia</td><td>MB-083</td><td>긴 이름: 소 혈청 알부민(1.25 mg/mL)</td></tr> <tr><td>세포 여과기</td><td>HiMedia</td><td>TCP-182</td><td>70 &마이크로; m</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>REMI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ciprofloxacin</td><td>RANBAXY LAB. 2.5</td> &<td>마이크로B17407T1</td> 제한<td>; g/mL</td></tr><tr><td>크리스탈 바이올렛</td><td>S D Fine-Chem Limited</td><td>42555</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-글루코스</td><td>Merck</td><td>1.94925.0521</td><td>25 mM</td></tr><tr><td>덱사메타손</td><td>시그마-알드리치</td><td>D2915</td><td>1 &마이크로; M</td></tr><tr><td>DMEM LG</td><td>SIGMA</td><td>D5523</td><td>긴 이름: Dulbecco' 의 변형된 독수리' s 미디어 저당</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>머크</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td>긴 이름 : 소 태아 혈청</td></tr><tr><td>포름 알데히드 용액 37 % -41 %</td> <td>머크</td><td>61780805001730</td><td></td></tr><tr><td>인도 메타신</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>I7378</td><td>100 &마이크로; M</td></tr><tr><td>인슐린</td><td>시그마-알드리치</td><td>I9278</td><td>10 &마이크로; g / mL</td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>Nikon Eclipse TS 100</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ITS + 1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2521-5mL</td><td>긴 이름 : 인슐린, 트랜스페린, 아셀렌산나트륨 + 리놀레산-BSA</td></tr><tr><td>L-프롤린</td><td>HiMedia</td><td>TO-109-25G</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>염화 마그네슘</td><td>Merck</td><td>61751605001730</td><td>용해 완충액</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Meck</td><td>1.07018.2521</td><td></td></tr><tr><td>마이크로피펫 및 멸균 팁(20 &micro; L, 200 &마이크로; L, 1000 &마이크로; L)</td> <td>Thermoscientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MUSE 세포 분석기</td><td>Merck Millipore</td><td></td><td>세포 계수</td></tr><tr><td>OCT 화합물</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td>긴 이름 : 최적 절삭 온도</td></tr><tr><td>오일 레드 O 염료</td><td>S D Fine-Chem Limited</td><td>54304</td><td>지질 액포 염색</td></tr><tr><td>용 페니실린-스트렙토 마이신</td><td>HiMedia</td><td>A007</td><td>100 U / mL</td></tr><tr><td>페트리 접시 (150mm 및 90mm)</td><td>NEST</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Safranin O</td><td>S D Fine-Chem</td><td>Limited 50240</td><td>sufated gycosaminoglycans 염색</td></tr><tr><td>용 구연산</td>나트륨 <td>Sigma-Aldrich</td><td>C3434</td><td>3.4 % (w/v)</td></tr><tr><td>멸균 가위, 겸자 및 메스</td><td></td><td></td><td>IFP-MSC</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Merck</td><td>1.94953.0521</td><td>35 % (w/v)</td></tr><tr><td>TGF- &베타; 1</td><td>Sino Biologicals</td><td></td><td>긴 이름 : 변형 성장 인자 - &beta; 1 (10 ng/mL)</td></tr><tr><td>조직 배양 인큐베이터 37 &deg; C, 5% CO2</td><td>Thermoscientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris 버퍼</td><td>Merck</td><td>61771405001730</td><td>용해 버퍼</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>S D Fine-Chem Limited</td><td>40632</td><td>용해 버퍼</td></tr><tr><td>유형 II 콜라겐분해 효소</td><td>Gibco</td><td>17101015</td><td>1.5 mg/mL</td></tr><tr><td>비타민 D3</td><td>Sigma</td><td>C9756-1G</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>웰 플레이트(6 -WP 및 24-WP)</td><td>둥지</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

염소 스티플 관절의 슬개골 하 지방 패드에서 중간엽 줄기 세포의 분리, 확장 및 분화

Isolation, Expansion, and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from the Infrapatellar Fat Pad of the Goat Stifle Joint

무릎 관절에 존재하는 IFP는 MSC의 유망한 공급원 역할을합니다. IFP는 관절경 시술 및 무릎 교체 수술 중에 일상적으로 절제되고 폐기되기 때문에 쉽게 접근할 수 있는 조직입니다. 또한, 그 제거는 최소 기증자 부위 이환율과 관련이 있습니다. 최근 연구에 따르면 IFP-MSC는 시험관 내 확장 중에 증식 능력을 잃지 않으며 연령 독립적 인 골 형성 분화 잠재력을 가지고 있음이 입증되었습니다. IFP-MSC는 골수 유래 중간엽줄기세포(BMSC) 및 지방유래 줄기세포(ADSC)에 비해 우수한 연골성 분화 잠재력을 가지고 있습니다. 이러한 세포는 노화되고 병에 걸린 환자에게서 쉽게 얻을 수 있지만 그 효과는 제한적입니다. 따라서 건강한 기증자의 IFP-MSC를 사용하는 것은 생물 의학 응용 분야에서 효능을 결정하는 데 중요합니다. 건강한 인간 기증자에 대한 접근이 어렵 기 때문에 동물 모델은 근본적인 이해를 가능하게하는 더 나은 대안이 될 수 있습니다. 개, 말, 양, 염소와 같은 큰 동물은 중개 연구에서 중요한 역할을 합니다. 이 중 염소의 질식 관절이 인간의 무릎 관절에 가장 가까운 해부학을 가지고 있기 때문에 염소가 선호되는 모델이 될 수 있습니다. 또한 goat-IFP는 조직 재생 응용 분야에 필요한 더 높은 MSC 수치를 충족할 수 있습니다. 또한 저렴한 비용, 가용성 및 동물 연구를 위한 3R 원칙 준수로 인해 매력적인 모델입니다. 이 연구는 IFP-MSC를 염소의 질식 관절과 확장 및 분화를 위한 시험관 내 배양 조건에서 분리하기 위한 간단한 프로토콜을 보여줍니다. 염소로부터 무균적으로 단리된 IFP를 세척하고, 다지고, 효소적으로 소화시켰다. 여과 및 원심분리 후, 수집된 세포를 배양하였다. 이 세포는 부착되었고 MSC와 유사한 형태를 가지고 있으며 놀라운 클론 생성 능력을 보여주었습니다. 또한, 그들은 지방 형성, 연골 형성 및 골 형성 계통으로 분화하여 다분화능을 입증했습니다. 결론적으로이 연구는 조직 공학 및 재생 의학 응용 분야에서 잠재력을 보여주는 MSC의 분리 및 확장을 보여줍니다.

염소의 대퇴골 관절에서 IFP-MSC의 분리 염소의 질식 관절에서 IFP-MSC를 분리하는 단계는 그림 1에 나와 있습니다. 슬개골의 내부 비 관절 표면에 존재하는 지방 패드를 제거하고, 다지고, 효소 적으로 소화시켰다. IFP-MSC를 성공적으로 분리하고 시험관 내에서 배양하였다(도 2A).
IFP-MSC의 확장 및 클론 생성 능력 분리된 세포를 확장 배지에서 시험관내 배양하였다. 세포는 파종 후 12시간 이내에 조직 배양 플레이트에 부착되기 시작했으며 0일째에 대부분 둥근 모양이었습니다. 그들은 플레이트에 균질하게 부착되었고 24시간 이내에 길쭉한 형태를 얻었습니다. 이 형태는 배양 기간 동안 유지되었습니다. 세포는 배양에서 효율적으로 증식했으며 확장 후 6일 이내에 ...

슬개골 지방 패드 중간엽 줄기세포(IFP-MSC)는 무릎 관절의 슬개골하 지방 패드에서 쉽게 분리할 수 있습니다. 그들은 시험관 내에서 잘 증식하고 CFU-F 콜로니를 형성하며 지방 형성, 연골 형성 및 골 형성 계통으로 분화합니다. 본원에서, 염소 스티플 조인트로부터 IFP-MSC의 분리, 확장 및 분화를 위한 방법론이 제공된다.

The IFP, present in the knee joint, serves as a promising source of MSCs. The IFP is an easily accessible tissue as it is routinely resected and discarded ...

슬개골 하부 지방 패드 유래 중간엽 줄기 세포 또는 간단히 IFP-MSC는 상대적으로 덜 연구된 줄기 세포 유형입니다. 이 프로토콜은 염소 스티플 조인트에서 IFP-MSC의 분리를 입증하는 간단하고 신뢰할 수 있으며 재현 가능한 방법입니다. 이 기술의 주요 장점은 많은 수의 고품질 IFP-MSC를 얻을 수 있다는 것입니다.분리된 IFP-MSC는 여러 계통으로 분화할 수 있으며 광범위한 재생 잠재력을 가지고 있습니다. 해부학 적 위치로 인해 IFP-MSC는 연골 결함을 복구하고 골관절염의 연골 분해를 완화하는 데 관심을 갖게되었습니다. 이 방법은 조직 공학 및 재생 의학 분야의 세포 기반 치료에 영향을 미칩니다.IFP-MSC의 분리, 확장 및 분화 절차는 Sugata Hazra 박사와 Aman Mahajan에 의해 시연 될 것입니다. 슬개골 하부 지방 패드 중간엽 줄기 세포(IFP-MSC)의 분리를 시작하려면 멸균된 수집 샘플 상자에서 뒷다리의 대퇴골 및 경골 부위의 약 15cm를 포함하는 염소 대퇴골 관절을 수집합니다. 추가 처리를 위해 실험실로 운반하기 위해 샘플을 섭씨 4도에 보관하십시오.샘플을 150mm 페트리 접시에 놓고 절차 전반에 걸쳐 샘플을 무균 상태로 처리하고 생물 안전 캐비닛을 처리해야 합니다. 항생제가 보충 된 오토 클레이브 PBS로 철저히 헹굽니다. PBS를 사용하여 샘플을 수화시킵니다.샘플의 해부학 적 영역을주의 깊게 검사하십시오. 쉽게 접근 할 수 있도록 한 손으로 대퇴골의 끝면을 잡고 날카로운 가위를 사용하여 관절쪽으로 세로로 절단하여 긴 뼈에서 여분의 조직을 완전히 제거합니다. 그런 다음 관절낭을 둘러싼 조직을 방해하지 않고 뼈에서 근육과 지방 조직을 제거하십시오.유사하게, 샘플의 경골 끝에서 다른 절개를하고 경골 뼈에서 근육과 지방 조직을 제거하십시오. 긴 뼈가 완전히 노출되고 관절낭이 보이는지 확인하십시오. 다음으로, 활막의 양쪽에서 절개하여 관절 관절을 잘라냅니다.신선한 멸균 된 가위와 집게를 사용하여 활막과 슬개골 인대에서 슬개골을 잘라냅니다. 분리 된 슬개골을 PBS가 들어있는 페트리 접시에 즉시 넣으십시오. 분리 된 슬개골에서 가위와 집게를 사용하여 내부 표면에있는 전체 지방 패드를 제거하십시오.다른 신선한 페트리 접시에 모으고 메스를 사용하여 말하십시오. 약 2-3 밀리미터의 작은 지방 부분을 얻기 위해 다른 수술 도구를 포함하십시오. 주걱을 사용하여 다진 조직을 50 밀리리터 원심 분리 튜브로 옮기고 시험관 믹서를 사용하여 실온에서 15 분 동안 항생제가 보충 된 PBS로 세 번 씻습니다.효소 소화를 위해 Dulbecco의 변형 된 독수리 배지 (DMEM), 유형 II 콜라게나제 1.5 밀리그램 및 섭씨 37도에서 2 % FBS를 포함하는 저혈당 배지에서 다진 조직 약 5g을 섭씨 37도에서 12-16 시간 동안 배양하십시오. 소화된 조직을 조심스럽게 흡인하고 70미크론 세포 여과기로 여과하여 소화되지 않은 부분을 제거합니다. 여과액을 150 회 g의 150 밀리리터 원심 분리 튜브에서 5 분 동안 원심 분리합니다.세포 펠렛을 DMEM 저혈당으로 2회 세척하기 전에 상청액을 제거한다. 확장 매체라고도 하는 완전한 DMEM에 펠릿을 다시 현탁합니다. 세포를 150mm 페트리 접시에 놓고 기본 섬유 아세포 성장 인자 (BFGF) 밀리리터 당 5 나노 그램과 밀리리터 당 50 마이크로 그램 2- 포스 포 -L- 아스코르브 산 삼 나트륨 염이 보충 된 확장 배지에서 배양합니다.세포가 부착되고 증식할 수 있도록 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도의 세포를 배양합니다. 매일 세포의 부착과 성장을 모니터링하십시오. IFP-MSC의 적절한 유지 관리 및 확장을 위해 3일마다 미디어를 교체하십시오.배지를 교체하는 동안 BFGF 밀리리터당 신선한 5나노그램과 밀리미터당 50마이크로그램의 2-Phospho-L-아스코르브산 삼나트륨 염을 페트리 접시에 직접 추가합니다. 세포가 80%에서 90% 합류하면 페트리 접시에서 확장 배지를 제거하고 1X PBS로 세포를 세척하여 계대 배양합니다. 그런 다음 접시에 0.25 % 트립신 -EDTA 4 밀리리터를 넣고 5 % 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다.4분 후 플레이트를 옆으로 두드려 세포를 제거합니다. 현미경으로 모든 세포의 완전한 분리를 확인하십시오. 확인되면 동일한 양의 확장 배지를 추가하여 트립신을 중화합니다.피펫을 사용하여 해리 된 세포를 새로운 15 밀리리터 폴리 프로필렌 튜브에 모으고 실온에서 5 분 동안 150 회 g으로 원심 분리합니다. 상청액을 버리고 원하는 부피의 팽창 배지에 펠릿을 재현탁합니다. 표준 세포 계수 방법을 사용하여 세포를 계수하고 150 밀리리터 페트리 접시에서 평방 센티미터 당 10, 000 세포의 파종 밀도로 추가 확장을 위해 계대 배양하십시오.모든 분석에 대해, 계대 번호 P2 내지 P5의 세포의 합류 단층을 사용한다. 확장된 세포가 80%에서 90% 컨플루언시에 도달하면 트립신-EDTA 용액을 사용하여 세포를 해리한 후 150회 g의 15밀리리터 원심분리 튜브에서 5분 동안 펠릿화합니다. 그런 다음 펠릿을 염소 혈장에 50 마이크로 리터 당 2 백만 세포의 밀도로 재현 탁시킵니다. 멸균 된 90mm 페트리 접시에 세포를 포함하는 50 마이크로 리터의 혈장을 첨가 한 다음 최종 농도 0.3 %의 염화칼슘을 첨가하여 잘 섞어 가교 혈장 하이드로 겔을 제조합니다.제작된 하이드로겔을 섭씨 37도에서 40분 동안 배양한 후, 하이드로겔을 연골성 배지가 포함된 24웰 조직 배양 플레이트로 옮깁니다. 14일 동안 3일마다 미디어를 교체합니다. TGF-베타 1이 없는 완전한 DMEM 배지에서 배양된 하이드로겔은 유도되지 않은 대조군으로 간주됩니다.혈장 하이드로겔에서 세포의 연골생성 분화 14일 후, 하이드로겔을 PBS로 각각 5분 동안 3회 세척하고, 시료를 중성 완충 포르말린에 3시간 동안 고정하였다. 분리된 IFP-MSC는 균질적으로 부착되었고, 시험관내 배양 후 24시간 이내에 길쭉한 형태를 얻었다. 세포는 확장 후 6일 이내에 80%에서 90%의 컨플루언시를 효율적으로 증식하고 클론 생성 능력을 나타내어 효율적인 증식 및 자가 재생 능력을 나타냅니다.지방원성 계통으로 분화하도록 처리하였을 때, 분리된 세포는 지질 방울을 생성하였고, 이는 14일 및 21일에 Oil Red O 염색에 의해 확인되었다. 이러한 오일 방울은 지방생성 유도 인자 없이 세포에서 보이지 않았다. 분리된 세포는 혈장 하이드로젤에 캡슐화되어 연골형성 가능성을 보인 유도군에서 14일 후에 백색 및 광택 신조직의 형성을 보였다.유도되지 않은 그룹은 광택이 감소된 창백한 흰색 조직을 가졌습니다. 또한, 유도 된 그룹에서 Alcian Blue 및 Safranin O에 대한 양성 조직 학적 염색은 세포가 연골 기질의 주요 구성 요소 중 하나 인 황산화 글리코 사 미노 글리 칸을 분비 할 수 있음을 나타냅니다. 대조적으로, 유도되지 않은 그룹의 하이드로 겔 섹션은 Safranin O 및 Alcian Blue 염색에 대해 음성이었으며, 연골 성 자극이있는 경우에만 중간 엽 줄기 세포의 연골 분화 가능성을 확인했다.골형성 배지로 유도된 분리된 세포는 알칼리성 포스파타제에 대해 양성 염색을 나타내어 14일 말에 광물화를 확인했습니다. 골형성 유도 28일 후, 석회화된 침착을 알리자린 레드 S 염색으로 관찰하였다. 결과는 유도 된 세포의 지방 형성, 연골 형성 및 골 형성 계통으로의 분화 가능성을 강조했습니다.오염을 피하기 위해 무균 조건에서 샘플을 처리하는 것이 필수적입니다. 슬개골의 정확한 위치를 식별하는 것도 중요합니다. 이 절차는 관절 연골 세포, 인대 섬유 아세포, 활액 및 활액에서 줄기 세포와 같은 다양한 세포 유형을 분리 할 수있는 길을 열어 재생 의학에 광범위하게 적용됩니다.이 기술을 사용하여 IFP-MSC를 분리 한 후, 스캐 폴드 및 스캐 폴드가없는 접근법을 사용하여 연골, 뼈 및 인대와 같은 근골격계 조직의 재생에 대한 효과를 특히 조사했습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

토끼의 무릎 관절 연골 결손의 치료를위한 실험 기법을 설명합니다. 연골 결손에 동종 간엽 줄기 세포의 이식은 조직 공학 분야의 유망한 개발을 제공합니다. 섬유소 세포 혈전의...

섬유소 혈전의 동종 간엽 줄기 세포의 주입에 의한 토끼의 무릎 관절의 골 연골 결함의 치료

중간엽 줄기세포(MSC)는 용해성 인자 또는 특정 생체 물질로 자극될 때 조골세포 계통으로 분화 가능성이 있습니다. 이 연구는 소 뼈 기질 Nukbone(NKB)을 골격으로 사용하는 인간 양막(AM-hMSC)에서 MSC를 전달하기 위한 새로운 옵션을 제시합니다.

인간 중간 엽 줄기 세포의 분리 및 다공성 뼈 매트릭스에 자신의 재배

미니피그의 활액과 골수에서 분리하고 주사기 흡인을 사용하여 비침습적으로 채취한 중간엽 줄기세포(MSC)를 확립하는 프로토콜이 제시됩니다. 세포 표현형분석은 세포 분리 후 유세포 분석을 사용하여 수행되었으며 MSC에서 유래한 골수 및 활액의 체외 배양을 수행했습니다.

Minipigs의 활액과 골수 유래 중간 엽 줄기 세포의 분리 및 세포 표현형

여기에서 우리는 고립과이 조직에서 중간 엽 줄기 / 간질 세포 (MSC)의 확장 다음에 인간의 장기 태반에서 태아와 모체 조직의 절개 방법을 설명합니다.

인간 태반 조직에서 추출 분리 및 중간 엽 줄기의 확장 / 기질 세포

이 종이 준비와 쥐에서 양측 슬 개 골 힘 줄 결함 모델 탯 매트릭스 유래 중간 엽 줄기 세포 spheroids의 평가 설명합니다. 이 모델 수용 병 적 상태와 관련 되었다와 치료 및 치료 힘 줄 사이의 차이 검출 하기 위하여 발견 되었고 2 개의 처리 사이 테스트.

쥐에서 양측 슬 개 골 힘 줄 부상 모델에서 줄기 세포 치료의 평가

이 문서 간단 분리와 뉴질랜드 백색 토끼 활 액 액체에서 중간 엽 줄기 세포의 정화에 대 한 간단 하 고 경제적인 프로토콜을 제공합니다.

마그네틱 활성화 전략을 분리 하 고 정화 활 액 액체 파생 된 중간 엽 줄기 세포는 토끼 모델에서 정렬 셀

여기, 우리가 격리, 확장, 및 개 난소 조직 으로부터 간 엽 줄기 세포의 분화 하는 방법을 설명합니다.

파생 및 개 난소 중간 엽 줄기 세포의 분화

이 프로토콜은 Sprague Dawley 쥐에서 지방 조직 유래 중간엽 줄기 세포(MSC)를 분리하고 식별하는 방법론을 설명합니다.

Sprague Dawley 쥐의 지방 조직에서 유래한 중간엽 줄기 세포의 분리 및 식별

지방 조직은 중간엽 줄기 세포의 훌륭한 공급원입니다. 여기에서는 스위스 생쥐 부고환 지방 조직에서 지방 조직 유래 줄기 세포(ADSC)의 단계별 추출, 배양 및 특성 분석을 제공합니다.

Isolation, In Vitro Expansion, and Characterization of Mesenchymal Stem Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissue(마우스 부고환 지방 조직에서 중간엽 줄기 세포의 분리, 체외 확장 및 특성 분석)

이질적인 인간 UC-MSC를 구성하는 세 가지 주요 하위 그룹 중 하나인 BAMBI높은MFGE8높은 MSC의 분리는 특정 질병에 대한 임상 효능을 개선하기 위한 향후 적용을 위해 이 하위 유형의 특성과 기능을 완전히 이해하는 데 도움이 됩니다. 여기에서는 BAMBIhighMFGE8high UC-MSC를 분류하는 방법을 제시합니다.

Human BAMBIhighMFGE8high Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells의 분리

배우세요 염소 슬개골 하 지방 패드에서 중간엽 줄기 세포(IFP-MSCs)를 분리, 확장 및 분화시키는 방법을. 이 기술은 연골 재생 및 조직 공학 연구에 활용됩니다.

염소 스티플 관절의 슬개골 하 지방 패드에서 중간엽 줄기 세포의 분리, 확장 및 분화

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