말초 신경 공학을 위한 그래핀 기반 3D 바이오하이브리드 하이드로겔 바이오잉크의 준비 및 특성화

줄기 세포 시스템은 중요한 구성 요소의 영향을 받고 있습니다. 줄기 세포의 보존과 분화는 미세 환경의 존재 없이는 생각할 수 없습니다. 줄기 세포 틈새라고 불리는 이 미세 환경은 세포와 스캐폴드로 구성됩니다.

말초 신경병증은 때때로, 상완 신경총의 손상, 다양한 외상, 종양, 자율신경 기형, 면역 정의 및 대사성 질환 등이 될 수 있다. 줄기 세포에 더 좋고 자연스러운 틈새를 제공하기 위해 다양한 3D 배양 방법이 개발되었습니다. 스페로이드 형성 및 3D 바이오프린팅은 3D 배양을 위한 비교적 새롭고 유망한 방법입니다.

3D 바이오프린팅은 신경공학 연구에도 사용할 수 있습니다. 결과적으로, 이 연구에서 그래핀 기반 및 알지네이트/젤라틴 기반 바이오잉크가 개발되고 재생 기능에 대해 연구되었습니다. 먼저 Wharton의 젤리 중간엽 줄기 세포 또는 WJMSC를 실온에서 멸균 층류 하에서 10% 태아 송아지 혈청 또는 FBS, 1% pen/strep 및 1%L-글루타민을 포함하는 DMEM F12 배지에서 배양합니다.

배양된 세포가 플라스크에서 80% 합류하면 배지를 붓고 5밀리리터의 PBS로 세포를 세척합니다. 그런 다음 0.25 % 트립신 5 밀리리터와 EDTA 2.21 밀리몰 나트륨을 넣고 섭씨 37도에서 배양합니다. 5분 후, 10%FBS를 함유한 DMEM F12 배지 10밀리리터를 셀에 첨가한다.

세포를 현탁하고 배지를 모아 원심 분리기 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 세포를 원심분리하고 상층액을 버리고 10%FBS를 함유한 신선한 영양 배지를 사용하여 새 플라스크에 세포를 다시 시딩합니다. 그래핀이 없는 대조군의 바이오잉크를 제조하기 위해 알지네이트 4.5mg과 젤라틴 1.5mg의 무게를 달아 원심분리관으로 옮긴다.

그런 다음 10% FBS를 포함하는 DMEM F12 배지 50밀리리터를 튜브에 추가합니다. 다시 알긴산 염 4.5mg과 젤라틴 1.5mg의 무게를 측정하여 원심 분리기 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 50마이크로리터의 0.1% 그래핀을 튜브에 넣고 10% FBS를 포함하는 DMEM F12 배지로 부피를 50밀리리터로 만듭니다.

섭씨 121도에서 1.5도 미만의 오토클레이브하기 전에 피펫팅과 볼텍싱으로 바이오잉크를 혼합합니다. 20 분 동안 대기압. 오토클레이빙 후, 용액을 원심분리하여 형성된 기포를 제거하고 세포가 준비될 때까지 바이오잉크를 섭씨 37도에 놓습니다.

세포 바이오잉크 상호작용의 경우 바이오잉크 그룹을 생성합니다. 그룹 1에는 바이오프린팅을 위해 바이오잉크로 인쇄된 3D-B 및 3D-G가 포함됩니다. 그룹 2에는 바이오프린팅 후 스페로이드가 형성된 3D-BS 및 3D-GS 바이오잉크가 포함됩니다.

그룹 1의 경우, 0.5 밀리리터의 배지에서 세포를 1 대 10 내지 일곱 번째 세포로 계수한다. 그런 다음 4.5 밀리리터의 바이오 잉크를 첨가하십시오. 주사기를 사용하여 혼합물을 멸균 캐비닛의 카트리지로 옮깁니다.

바이오프린터의 해당 압출기 섹션에 카트리지를 설치합니다. 두 번째 그룹의 경우 각 바이오 잉크 그룹에서 5 밀리리터의 바이오 잉크를 가져 와서 인젝터를 사용하여 멸균 카트리지로 옮깁니다. 두 개의 동축 프린트 헤드와 공압 구동 압출 기술이 있는 바이오프린터를 사용하십시오.

마이크로 스텝당 XYZ 분해능을 1.25마이크로미터로, 압출 폭을 400마이크로미터로, 압출 높이를 200마이크로미터로 설정합니다. 20 x 20 x 5mm 그리드를 사용하여 3D 모델을 만듭니다. 오픈 소스 웹 기반 CAD 프로그램을 사용하여 3D 모델을 만들 수 있습니다.

3D 바이오프린팅 공정의 경우 프린터의 평균 압력을 7.5psi로 설정합니다. 그런 다음 카트리지와 베드 온도를 섭씨 37도로, 속도를 60%로 설정합니다쓰기 단계에서 시스템을 홈 위치에 놓습니다. 바이오프린팅 프로세스를 시작하기 전에 축을 자동으로 배치하고 압출기를 선택 및 설정합니다.

인쇄 후 샘플을 제거하고 층류 캐비닛 아래에 놓습니다. 다음으로, 바이오잉크에 0.1 일반 염화칼슘 용액을 분무하거나 실온에서 피펫으로 1밀리리터 용액을 첨가하고 10-20초 동안 기다립니다. 그런 다음 인쇄된 패턴을 칼슘과 마그네슘이 함유된 PBS로 두 번 세척합니다.

바이오잉크 그룹을 포함하는 각 셀 위에 10% FBS가 있는 DMEM F12 배지 2밀리리터를 추가하고 플레이트를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소와 함께 30분 동안 배양합니다. 다음으로, 1 x 10을 함유하는 현탁 배지 2 밀리리터를 각 그룹의 여섯 번째 세포에 첨가하고 플레이트를 배양한다. 24시간 후, 대조군을 제외한 뉴런 유사 세포로의 WJMSC 분화를 위해 도립 현미경으로 스페로이드 형성을 위한 모든 바이오잉크 배치를 관찰하고 사진을 찍습니다.

웰 당 2 밀리리터의 신경성 분화 배지를 추가하고 2 일마다 새로 고칩니다. 신경 분화를 관찰하기 위해 7일 동안 추적합니다. 다음으로, 타임랩스 이미징을 사용하여 그래핀이 줄기 세포에 미치는 영향을 조사하고 바이오잉크 내에서 세포 상호 작용을 모니터링합니다.

세포 증식에 대한 그래핀 농도의 영향이 여기에서 입증됩니다. 대조군과 비교하여, 0.001%그래핀 농도에 대해 유의한 감소가 관찰되었다. 다른 그룹과 대조군 사이에는 유의미한 차이가 없었다.

세포 그래핀 상호작용은 그래핀이 2D 시스템에서 내성이 있고 엔도사이토시스를 통해 세포에 의해 채취되었음을 보여주었습니다. 타임랩스 이미징은 3D 그래핀 배지에서 살아남은 세포가 배양이 끝날 때까지 GFP 밝기를 통해 활력을 유지하는 것으로 나타났습니다. 3D-B 및 3D-G 바이오잉크 그룹의 SEM 이미지와 FIIR 분석이 여기에 표시됩니다.

Bioink 세포 상호 작용은 표면과 내부 모두에서 입증되었습니다. 세포는 형태학적으로 둥글고 물질에 부착되었습니다. 3차원 뉴런 분화에서는 두 그룹의 스페로이드 세포의 경계가 투명하고 활발한 것으로 간주되었으며, 그래핀 그룹의 스페로이드는 상대적으로 더 커서 세포 내부에 그래핀을 갇힌 것으로 간주되었습니다.

2D 및 3D 세포의 면역염색이 여기에 나와 있습니다. 녹색 이미지는 뉴런과 같은 구조를 나타냅니다. 2D 양성 대조군 샘플은 3D 샘플보다 더 적은 뉴런 유사 구조 마커를 발현했습니다.

우리는 그래핀 기반 바이오잉크가 줄기 세포를 뉴런 유사 세포로 분화하는 측면에서 더 성공적이라는 것을 발견했습니다. 우리는 그래핀 기반 바이오잉크가 추가 연구에서 말초 신경 장애 치료를 위한 훌륭한 도구가 될 것이라고 제안합니다. 오늘날, 줄기세포 시스템은 천연 및 합성 생체 재료로 조직공학을 통해 만들어질 수 있으며, 이러한 조직의 재생에 사용될 수 있는 생체 조직을 대체할 수 있는 인공조직을 만들고, 손상을 제거하고, 조직공학에 의해 기능을 제공할 수 있다.