간단하고 비용 효율적인 DNA 분리 방법을 사용한 루푸스 경향 마우스의 분변 미생물 역학 분석
2022년 5월 2일
이 프로토콜은 자가면역 질환 발병 중 쥐 장내 미생물 변화를 분석하기 위한 간단하고 비용 효율적인 DNA 분리 방법을 제공합니다.
제안된 DNA 분리 방법은 자가면역질환 마우스 모델에서 장내 미생물 역학을 연구하는 역할을 할 수 있습니다. 시판되는 키트에 필적하는 분변 샘플로부터 DNA를 얻기 위해 보다 다재다능하고 비용 효율적이며 효율적인 방법이 제안된다. 시작하려면 각 마우스를 케이지에서 개별적으로 꺼내 항문에서 직접 대변 펠릿을 수집하고 처리 될 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.
멸균되고 깨끗한 집게, 튜브 및 장갑으로 샘플을 처리하십시오. 미리 계량 된 2 밀리리터 스크류 캡 튜브에 냉동 펠릿을 추가하고 분변 중량을 그램 단위로 기록하면 분변 펠릿 당 0.02-0.05 그램 사이 여야합니다. 펠릿에 0.1mm 유리 비드, 500 마이크로 리터의 용해 완충액 및 200 마이크로 리터의 20 % 나트륨 도데 실 설페이트의 얇은 층을 추가하십시오.
비드는 균질화기에서 4분 동안 튜브를 두들긴 다음 3-5분 동안 볼텍싱을 했습니다. 기포와 거품을 제거하기 위해 짧은 시간 동안 튜브를 원심 분리하십시오. 미생물군 샘플에서 DNA를 추출하려면 350마이크로리터의 샘플 상청액을 파편 없이 새로운 1.5밀리리터 스냅 캡 튜브로 옮깁니다.
500마이크로리터의 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올을 25:24:1의 비율로 추가하고 1분 동안 와동시킵니다. 원심분리 후, 180 마이크로리터의 상부 수성 상을 새로운 1.5 밀리리터 스냅 캡 튜브로 옮긴다. 180 마이크로 리터의 클로로포름을 넣고 뒤집어 혼합하십시오.
이로부터 180 마이크로 리터의 수성 상을 새로운 스냅 캡 튜브로 옮깁니다. 생물 안전 캐비닛에 180 마이크로 리터의 차가운 이소프로판올과 36 마이크로 리터의 5 몰 암모늄 아세테이트를 추가하십시오. 몇 번 뒤집어 혼합하고 튜브를 얼음 위에 20분 동안 놓습니다.
상청액을 버리고, 펠렛을 500 마이크로리터의 차가운 70%에탄올로 수회 세척하였다. 상청액을 버리고 펠릿이 깨끗해질 때까지 20분 동안 티슈 페이퍼에 튜브를 거꾸로 자연 건조시킵니다. 펠릿을 50마이크로리터의 분자 등급 물에 현탁하고 액체를 섭씨 37도에서 10분 동안 가열하여 큰 DNA 펠릿을 완전히 용해시킵니다.
가열 후,이 튜브를 3, 400 배 G에서 1 분 동안 원심 분리하여 뚜껑에서 응축 방울을 회수하십시오. 농도를 측정하고, 분광 광도계를 사용하여 260/280 비를 구한다. 양질의 DNA에 대한 비율은 일반적으로 1.8과 2 사이입니다.
준비된 샘플을 실온에서 1분 동안 600배 G로 원심분리한 후 섭씨 영하 80도에서 24시간 동안 동결시킨다. 그런 다음 시퀀싱을 위해 마이크로리터당 1에서 50나노그램 범위의 농도를 가진 20마이크로리터의 샘플을 아르곤 국립 연구소로 보냅니다. 수용체 CX3CR1이 결여된 마우스 균주는 야생형 MRL/lpr, MRL/lpr-CX3CR1 GFP/GFP 마우스와 비교하여 장내 미생물 구성이 다르며, 특정 속에서 유의미한 차이를 보이며, 이는 프로테오박테리아 문과 같은 잠재적 병원성 박테리아와 관련이 있습니다.
시료 오염에 주의하십시오. 그것은 멸균되어야합니다. 또한 상청액을 새 튜브로 옮길 때 정확하게 피펫팅하는 것이 중요합니다.
이 방법은 PCR, 제한 효소 소화 또는 게놈 라이브러리 구성과 같은 분자 분석에 적합합니다. 루푸스에서 우리는 장내 미생물총과 루푸스 진행 사이에 강한 관계가 있음을 입증했습니다.
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개요
본 프로토콜은 자가면역 질환의 발생 과정 중 마우스 장내 미생물군의 변화를 분석하기 위한 간단하고 비용 효율적인 DNA 분리 방법을 제공합니다. 이 방법은 자가면역 질환 마우스 모델에서 장내 미생물군의 역학을 연구하기 위해 설계되었습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 미생물학
- 자가면역
배경
- 장내 미생물군집을 이해하는 것은 자가면역 질환 연구에서 매우 중요합니다.
- 현재의 DNA 분리 방법은 비용이 많이 들고 복잡할 수 있습니다.
- 본 연구는 더욱 효율적이고 비용 효율적인 대안을 제시합니다.
- 미생물군집의 변화를 분석하기 위해 분변 샘플이 사용됩니다.
연구 목적
- 분변 시료에서 DNA를 추출하기 위한 신뢰할 수 있는 방법을 제공함.
- 자가면역 질환 모델에서 장내 미생물군집 연구를 용이하게 함.
- 새로운 방법의 효율성을 상용 키트와 비교함.
사용된 방법
- 마우스로부터 개별 분변 펠릿 수집.
- -80 °C에서 시료 보관.
- 시료 처리를 위해 멸균 도구 사용.
- 용해 버퍼와 유리 구슬을 이용한 시료 준비.
주요 결과
- 제시된 방법은 상용 키트와 대등한 수준의 DNA 품질을 제공합니다.
- 미생물군집 분석에 있어 비용 효율적이며 효율적입니다.
- 자가면역 질환 기전에 대한 추가 연구를 용이하게 합니다.
결론
- 이 DNA 분리 방법은 연구자들에게 매우 유용한 도구입니다.
- 질환 환경에서의 장내 미생물군 조사를 지원합니다.
- 자가면역 분야에서 더욱 접근성 높은 연구를 장려합니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
자가면역 질환 모델에서 장내 미생물 군집 역학에 대한 신뢰할 수 있는 분석은 질병 진행에 기여하는 환경적 및 유전적 요인을 이해하는 데 매우 중요합니다. 이 비용 효율적인 DNA 분리 프로토콜은 마우스 분변 샘플로부터 미생물 DNA의 확장 가능하고 재현 가능한 추출을 가능하게 하여, 전임상 연구의 고처리량 마이크로바이옴 연구를 지원합니다. 이 방법은 미생물 군집의 변화와 자가면역 표현형 간의 연결에 대한 예측 신뢰도를 높여, 초기 발견 및 중개 전략 수립에 유용한 정보를 제공합니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 질병 관련 마우스 모델에서 미생물군-면역 체계 상호작용의 분석을 가능하게 합니다.
- 장내 미생물 구성에 의해 영향을 받는 후보 경로의 기능적 검증을 지원합니다.
- 미생물 변화와 자가면역 진행의 연관성을 통해 기전적 리스크 감소를 용이하게 합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 후속 시퀀싱 및 분자 분석을 위해 표준화되고 재현 가능한 DNA 샘플을 제공합니다.
- PCR 및 차세대 시퀀싱 워크플로우에 적합한 정량적인 고품질 DNA를 보장합니다.
- 실험군 간의 비교 마이크로바이옴 연구를 위해 확장 가능한 샘플 처리를 가능하게 합니다.
중개 및 전임상 연구
- 전임상 마이크로바이오타 프로파일링을 질병 진행 및 바이오마커 발굴 노력과 일치시킵니다.
- 발굴 단계의 결과물부터 자가면역 모델에서의 중개 검증까지의 연속성을 지원합니다.
- 환경적 트리거와 질병 표현형 간의 연결에서 생물학적 모호성을 줄여줍니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
본 DNA 분리 프로토콜은 초기 발견부터 전임상 단계까지의 과정에 적용 가능하며, 루푸스 취약 마우스 모델의 강력한 마이크로바이옴 분석을 가능하게 하여 리드 물질 발굴 및 기전 연구를 지원합니다.
- 발견 생물학: 자가면역 질환에서 미생물군집에 의한 면역 조절에 대한 가설 검증을 용이하게 합니다.
- 스크리닝: 시퀀싱 기반의 마이크로바이옴 프로파일링을 위해 재현 가능하고 정량적인 DNA 출력물을 제공합니다.
- 분석: 유전형 또는 처리군 간의 미생물 군집 변화에 대한 통계적 비교를 위한 고품질의 입력 데이터를 제공합니다.
- 중개 연구: 전임상 마이크로바이옴 연구 결과와 자가면역 질환의 잠재적 바이오마커 개발을 연결합니다.
- 기업적 재사용: 다양한 마우스 모델과 실험 설계에 적용 가능한 확장 가능하고 비용 효율적인 프로토콜을 제공합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 미생물 군집-질병 연관성에 대한 예측 신뢰도와 타겟 검증 능력을 향상시킵니다.
- 운영적 가치: DNA 추출 과정을 표준화하여 연구 간 재현성과 확장성을 개선합니다.
- 전략적 가치: 질병 기전에 대한 마이크로바이옴의 기여도를 명확히 하여 정보에 기반한 추진 여부(go/no-go) 결정을 가능하게 합니다.
- 포트폴리오 영향: 자가면역 질환 파이프라인에서 마이크로바이옴 조절 중재법의 리스크 조정 우선순위 설정을 지원합니다.
실행 시 고려 사항
- 멸균 시료 취급 및 분자 생물학 워크플로에 대한 기술적 전문 지식이 필요합니다.
- 품질 관리를 위해 균질기, 원심분리기 및 분광광도계의 사용이 가능해야 합니다.
- 오염과 변동성을 최소화하기 위해 팀 간의 엄격한 표준화가 요구됩니다.
- 다양한 마우스 모델에 적용 가능하지만, 시료 유형에 따라 최적화가 필요할 수 있습니다.
- 데이터 무결성을 보장하기 위해 정확한 파이펫팅과 멸균 기술이 필수적입니다.
