Name: 간단하고 비용 효율적인 DNA 분리 방법을 사용한 루푸스 경향 마우스의 분변 미생물 역학 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: 배우세요 간단하고 비용 효율적인 DNA 분리 방법을 사용하여 루푸스 경향 마우스의 분변 미생물 역학을 분석하는 기술입니다. 이 방법은 자가면역 질환 연구에서 장내 미생물 변화를 연구하는 데 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

아르곤 국립 연구소와 협력하는 생물 정보학자의 도움에 감사드립니다. 이 작업은 다양한 NIH 및 내부 보조금으로 지원됩니다.

B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J 마우스의 Cx3cr1 gfp/gfp 유전자좌를 MRL/Lpr-CX3 CR1 gfp/gfp 마우스를 생성하기 위해 10세대 동안 MRL/MpJ-Fas lpr/J(MRL/lpr)로 역교배하였다. 단일 염기 다형성(SNP) 패널을 사용한 게놈 스크리닝은 새로 생성된 마우스의 유전적 배경이 MRL/lpr의 유전적 배경과 97% 이상 동일하다는 것을 확인했습니다. 그 후, 마우스는 버지니아 공대의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 특정 요구 사항에 따라 특정 병원체가없는 환경에서 사육되고 유지되었습니다. 마우스가 13, 14 및 15 주령이었을 때 샘플을 수집했습니다.
1. 생쥐의 미생물 검체 채취
<ol><li>케이지에서 각 마우스를 개별적으로 꺼냅니다. 항문에서 직접 대변 펠릿을 수집하고 처리 될 때까지 -80 ° C에서 보관하십시오. 멸균되고 깨끗한 집게, 튜브 및 장갑으로 샘플을 처리하십시오. 참고: 용기(예: 비커)를 사용하여 분변 샘플을 기다리는 동안 마우스를 놓을 수 있습니다. 각 마우스 전후에 에탄올로 용기를 청소하십시오.</li>
	<li>미리 계량된 2mL 스크류 캡 튜브에 냉동 펠릿을 추가합니다. 분변 중량을 그램 단위로 기록하면 분변 펠릿 당 0.02-0.05g 사이 여야합니다.</li>
	<li>0.1 mm 유리 비드, 500 μL의 용해 완충액 (50 mM NaCl, 5 mM 트리스 및 50 mM EDTA) 및 20 μL의 20 % SDS의 얇은 층을 펠릿에 첨가한다.</li>
	<li>균질화기(최대 출력에서)에서 4분 동안 튜브를 비드로 두드린 다음 3-5분 동안 와동을 일으킵니다.</li>
	<li>기포와 거품을 제거하기 위해 짧은 시간 동안 회전하십시오 (원심 분리기의 버튼을 1,000-1,200 x g에 도달 할 때까지 누른 다음 놓습니다).</li>
</ol>2. DNA 추출
<ol><li>1.5단계에서 얻은 상청액 350μL(파편이 운반되지 않도록 보장)를 새 1.5mL 스냅 캡 튜브로 옮깁니다. 500μL의 페놀-클로로포름-이소아밀 알코올(PCI; 25:24:1, v/v) 혼합물을 넣고 1분 동안 와동시킵니다. 알림: 이제부터는 샘플을 화학 후드 내부에서 처리해야합니다. PCI는 독성이 있습니다.</li>
	<li>4°C에서 3분 동안 6,000 x g 로 회전합니다. 180μL의 수성 상(최상층)을 새로운 1.5mL 스냅 캡 튜브로 옮깁니다. 클로로포름 180μL(1:1)를 넣고 뒤집어 혼합합니다. 알림: 상단 레이어를 전송할 때 하단 레이어의 오염을 최소화하십시오.</li>
	<li>4°C에서 3분 동안 18,400 x g 로 회전합니다. 180 μL의 수성 상을 새로운 스냅 캡 튜브로 옮깁니다. 알림: PCI 및 클로로포름을 폐기한 후 생물학적 안전 캐비닛에서 다음 단계를 수행할 수 있습니다.</li>
	<li>180μL의 차가운 이소프로판올과 36μL의 5M NH4Ac를 넣고 몇 번 뒤집어 혼합하고 튜브를 얼음 위에 20 분 동안 놓습니다.</li>
	<li>4°C에서 20분 동안 18,400 x g 로 회전합니다. 상청액을 버리기 위해 붓는다. 뒤집는 동안 500μL의 차가운 70% 에탄올로 펠릿을 여러 번 세척합니다. 알림: 에탄올은 이중 탈 이온수 멸균 수로 희석해야합니다.</li>
	<li>4°C에서 3분 동안 18,400 x g 로 회전합니다. 상청액을 버리고 잔류 에탄올을 제거한다.</li>
	<li>펠릿이 깨끗해질 때까지 튜브를 티슈 페이퍼에 거꾸로 20분 동안 자연 건조합니다. 펠릿을 분자 등급 물 50μL에 현탁합니다. 액체를 37°C에서 10분 동안 가열하여 큰 DNA 펠릿을 완전히 용해시킵니다.</li>
	<li>가열 후 스핀 튜브를 사용하여 뚜껑의 응결 방울을 회수합니다(1분 동안 3,400 x g ).</li>
	<li>농도를 측정하고 분광 광도계를 사용하여 260/280 비율을 구한다. 분자 등급의 물을 블랭크로 사용하십시오. 양질의 DNA는 1.8과 2 사이의 260/280 비율을 가져야 합니다. 참고: 예상 DNA 수율은 분변 펠릿당 최소 0.03g입니다.</li>
</ol>3. 16S rRNA 유전자 시퀀싱을 위한 샘플 준비
<ol><li>DNA 샘플을 아르곤 국립 연구소로 보내 도서관 준비를 거쳐 Illumina Miseq에서 시퀀싱합니다.<ol><li>샘플을 완전히 스커트된 96웰 플레이트에 보내고 샘플은 줄(A1-A12, B1-B12 등)로 배열하고 호일 플레이트 씰로 밀봉합니다.</li>
		<li>웰당 시료당 20 μL의 최종 부피를 보내며, 농도는 1-50 ng/μL입니다. 알림: 희석은 분자 등급의 물로 수행해야 합니다.</li>
		<li>샘플을 준비한 후 실온에서 1분 동안 600 x g 로 회전시킨 후 샘플을 -80°C에서 24시간 동안 동결시킵니다.</li>
		<li>드라이 아이스에서 밤새 보내십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Lee, Y. K., Mazmanian, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Has+the+microbiota+played+a+critical+role+in+the+evolution+of+the+adaptive+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Has the microbiota played a critical role in the evolution of the adaptive immune system.</a> Science. 330 (6012), 1768-1773 (2010).</li>
<li>Lee, Y. K., Menezes, J. S., Umesaki, Y., Mazmanian, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proinflammatory+T-cell+responses+to+gut+microbiota+promote+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Proinflammatory T-cell responses to gut microbiota promote experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, Suppl 1 4615-4622 (2011).</li>
<li>Yeoh, N., Burton, J. P., Suppiah, P., Reid, G., Stebbings, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+microbiome+in+rheumatic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Rheumatology+Reports%22%5BJournal%5D)">The role of the microbiome in rheumatic diseases.</a> Current Rheumatology Reports. 15 (3), 314(2013).</li>
<li>Larsen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbiota+in+human+adults+with+type+2+diabetes+differs+from+non-diabetic+adults%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Gut microbiota in human adults with type 2 diabetes differs from non-diabetic adults.</a> PLoS One. 5 (2), 9085(2010).</li>
<li>Alam, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+imbalance+in+inflammatory+bowel+disease+patients+at+different+taxonomic+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Microbial imbalance in inflammatory bowel disease patients at different taxonomic levels.</a> Gut Pathogens. 12 (1), (2020).</li>
<li>Vieira, S. M., Pagovich, O. E., Kriegel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet%2C+microbiota+and+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Lupus%22%5BJournal%5D)">Diet, microbiota and autoimmune diseases.</a> Lupus. 23 (6), 518-526 (2014).</li>
<li>Mu, Q., Zhang, H., Luo, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLE%3A+another+autoimmune+disorder+influenced+by+microbes+and+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">SLE: another autoimmune disorder influenced by microbes and diet.</a> Frontiers of Immunology. 6, 608(2015).</li>
<li>Tektonidou, M. G., Wang, Z., Dasgupta, A., Ward, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+serious+infections+in+adults+with+systemic+lupus+erythematosus%3A+a+national+population-based+study%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Care+%26+Research%22%5BJournal%5D)">Burden of serious infections in adults with systemic lupus erythematosus: a national population-based study.</a> Arthritis Care & Research. 67 (8), 1078-1085 (2015).</li>
<li>Mu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+lupus+nephritis+by+changes+of+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Control of lupus nephritis by changes of gut microbiota.</a> Microbiome. 5 (1), 73(2017).</li>
<li>Panek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodology+challenges+in+studying+human+gut+microbiota+-+effects+of+collection%2C+storage%2C+DNA+extraction+and+next+generation+sequencing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Methodology challenges in studying human gut microbiota - effects of collection, storage, DNA extraction and next generation sequencing technologies.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5143(2018).</li>
<li>Fiedorová, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+dna+extraction+methods+on+stool+bacterial+and+fungal+microbiota+community+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The impact of dna extraction methods on stool bacterial and fungal microbiota community recovery.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 821(2019).</li>
<li>Gerasimidis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+DNA+extraction+methodology+on+gut+microbiota+research+applications%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">The effect of DNA extraction methodology on gut microbiota research applications.</a> BMC Research Notes. 9, 365(2016).</li>
<li>Bukin, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+16S+rRNA+region+choice+on+bacterial+community+metabarcoding+results%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Data%22%5BJournal%5D)">The effect of 16S rRNA region choice on bacterial community metabarcoding results.</a> Scientific Data. 6 (1), 190007(2019).</li>
<li>Galloway-Peña, J., Hanson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+analysis+of+the+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+Diseases+and+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tools for analysis of the microbiome.</a> Digestive Diseases and Sciences. 65 (3), 674-685 (2020).</li>
<li>Sharpton, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+the+analysis+of+shotgun+metagenomic+data%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 209(2014).</li>
</ol>

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

균형 잡힌 장내 미생물은 질병으로부터 인체를 보호 할 수 있습니다. 이 균형이 외부 또는 내부 트리거에 의해 중단되면 결과는 치명적일 수 있습니다. 이 방법은 쥐 모델에서 장내 미생물의 역학을 분석하는 방법을 제시합니다. 이 방법은 그룹 간의 비교뿐만 아니라 시간이 지남에 따라 장내 미생물총을 추적하여 장내 미생물총을 방해하는 시간 의존적 요인을 더 잘 식별하는 데에도 적합합니다.
실험의 모든 마우스는 동일한 환경에서 처리되어야 합니다. 분변 샘플을 수집 할 때 고려해야 할 한 가지 필수 사항은 시간, 요일 및 장소와 일치해야합니다. 마우스는 공생식입니다. 이것은 필수 영양소를 얻기 위해 대변이나 주변 음식을 먹는다는 것을 의미합니다. 따라서 케이지에서 대변을 수집 할 수 없습니다. 샘플은 항문에서 직접 수집해야합니다. 가장 좋은 방법은 마우스를 잡고 마사지하거나 마우스를 용기에 넣는 것입니다. 또한 샘플을 동시에 처리하고 모든 샘플이 준비되기를 기다리는 동안 -80 ° C에서 ...

인간과 박테리아는 오랫동안 공존해 왔습니다. 그들은 양적 및 질적 방식으로 숙주 면역 반응에 영향을 미치는 상호 유익한 효과와 상호 의존적 관계를 확립했습니다1. 최근 연구에 따르면 장내 미생물총과 다발성 경화증 2, 류마티스 관절염3, 제2형 당뇨병4, 염증성 장 질환5 및 전신성 홍반성 루푸스(SLE)6를 포함하는 자가면역 질환의 발병기전이 연관되어 있습니다. 그러나 장내 미생물이 이러한자가 면역 질환의 주요 원인인지 또는 2 차 효과인지는 여전히 불분명합니다7. 잠재적으로, 장내 미생물총은 자가면역 질환의 이펙터 단계에서 질병을 악화시키거나이러한 질병의 유도를 조절하는 역할을 할 수 있다8.
암컷 루푸스 경향이 있는 MRL/Mp-Faslpr(MRL/lpr) 마우스에서 장내 dysbiosis가 보고되었으며, 락토바실러스의 상당한 고갈과 함께 장내 미생물총의변화가 관찰되었습니다9. 5 가지 락토 바실러스 균주의 혼합물을 경구 투여했을 때,이 마우스에서 루푸스와 유사한 증상이 크게 약화되어 SLE 병인을 조절하는 데 미생물 총의 필수적인 역할을 시사합니다.
다음의 DNA 추출 기술은 루푸스 경향이있는 마우스에서 쥐 SLE와 유사한 질병의 과정에서 미생물 변동을 추적하고 정 성적 및 정량적으로 분석 할 수있게합니다. 건강한 장내 미생물을 검사하든 dysbiosis를 정의하든 데이터 수집 방법과 정확하고 재현 가능한지 비판적으로 조사하는 것이 중요합니다10. 이 과정에서 모든 단계가 중요합니다. DNA 추출 과정에서 편향을 도입할 수 있는 문제가 있으면 부정확한 미생물 표현이 발생할 수 있으므로 미생물 DNA를 추출하려면 적절한 방법론을 사용해야 합니다. 페놀-클로로포름 방법이 여기에 설명되어 있지만, 특정 경우에 잘 작동하는 박테리아로부터 DNA를 추출하는 시판되는 키트가 있습니다11. 그러나 유용성은 비용과 필요한 샘플 수량에 의해 제한됩니다.
여기에 제시된 프로토콜은 비용 효율적이며 소량의 샘플 만 필요합니다. 모든 종류의 대변 샘플에서 잘 작동하며 시간이 지남에 따라 장내 미생물의 역학과 그룹 간의 비교를 연구하는 데 유용합니다. DNA는 페놀, 클로로포름 및 이소아밀 알코올을 사용하는 알코올 정제 방법으로 분리됩니다. 알코올 기반 추출은 최종 단계에서 DNA가 침전되는 단백질 및 지질 샘플을 세척하고 제거하는 데 도움이 됩니다. 제안 된 방법은 상당히 높은 효율성과 품질을 가지며 박테리아 개체군을 식별하는 데 정확한 것으로 입증되었습니다. 절차 중 한 가지 중요한 점은 DNA 오염이 발생할 수 있으므로 적절한 샘플 처리가 필요하다는 것입니다12.
그런 다음 DNA는 Illumina MiSeq와 같은 16S rRNA 유전자에 대한 차세대 시퀀싱 플랫폼에 의해 분석됩니다. 특히, V4 초가변 영역은 상위 순위 분류군(13)에 대한 더 나은 정량화를 제공하기 위해 분석된다. 후속 생물 정보학 분석은 아웃소싱되고 표준 통계 방법을 사용한 사내 분석이 이어집니다. 다운스트림 시퀀싱에 사용할 수 있는 수많은 오픈 소스 생물정보학 소프트웨어 프로그램이 있으며 수행되는 분석 유형은 관심 있는 특정 생물학적 질문에 따라 크게 달라집니다14. 이 프로토콜은 특히 시퀀싱 이전의 실험 단계에 초점을 맞추고 분변 샘플에서 DNA를 얻기 위한 보다 다양하고 비용 효율적이며 비교 가능하고 효율적인 방법을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>0.1 mm 유리 구슬</td><td>BioSpec 제품</td><td>11079101</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 스크류 캡 튜브</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3488</td><td></td></tr><tr><td>20%</td><td>SDS FisherScientific</td><td>BP1311-1</td><td>SDS 20%</td></tr><tr><td>96% 에탄올, 분자생물학 등급</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T032021000CS</td><td></td></tr><tr><td>암모늄 아세테이트(5 M)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9071</td><td>NH4AC 5M</td></tr><tr><td>B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J</td><td>Jackson Laboratory</td><td>005582</td><td></td></tr><tr><td>Bullet Blender storm 24</td><td>다음 사전</td><td>4116-BBY24M</td><td>균질화기</td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>FisherScientific</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>DEPC 처리수</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9916</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민 테트라아세트산</td><td>FisherScientific</td><td>BP118-500</td><td>EDTA</td></tr><tr><td>호일 플레이트 씰</td><td>FisherScientific</td><td>NC0302491</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes-Kimtech 34256</td><td>FisherScientific</td><td>06-666C</td><td></td></tr><tr><td>MRL/MpJ-Faslpr/J (MRL/lpr) 마우스</td><td>Jackson Laboratory</td><td>000485</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000 분광 광도체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND2000CLAPTOP</td><td></td></tr><tr><td>페놀: 클로로포름: 이소아밀알콜 (25:24:1)</td><td>FisherScientific</td><td>BP1752I-400</td><td>PCI</td></tr><tr><td>스케일 (소수점 이하 4개)</td><td>Mettler Toledo</td><td>MS205DU</td><td></td></tr><tr><td>Skirted 96-well plates</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB-0800</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>FisherScientific</td><td>15528154</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Tris Hydrochloride</td><td>FisherScientific</td><td>BP1757-100</td><td></td></tr><tr><td>소용돌이</td><td>과학 산업</td><td>SI-0236</td><td></td></tr></tbody></table>

간단하고 비용 효율적인 dna 분리 방법을 사용한 루푸스 경향 마우스의 분변 미생물 역학 분석

Analysis of Fecal Microbiota Dynamics in Lupus-Prone Mice Using a Simple, Cost-Effective DNA Isolation Method

장내 미생물총은 면역 체계를 교육하는 데 중요한 역할을 합니다. 이 관계는 유전적 요인뿐만 아니라 발병을 유발하거나 질병 경과를 악화시킬 수 있는 환경적 요인에 의해 유발되는 자가면역 질환을 이해하는 데 매우 중요합니다. 루푸스가 발생하기 쉬운 MRL/lpr 암컷 마우스에서 장내 미생물총의 역학에 대해 이전에 발표된 연구는 장내 미생물총의 변화가 질병 진행을 어떻게 변화시킬 수 있는지 보여주었습니다. 여기서는자가 면역 연구를 위해 장내 미생물 총에서 대표 샘플을 추출하기위한 프로토콜이 설명됩니다. 미생물 총을 항문에서 채취하여 처리하고, 페놀 - 클로로포름 방법을 사용하여 DNA를 추출하고 알코올 침전으로 정제합니다. PCR이 수행된 후, 정제된 앰플리콘은 아르곤 국립 연구소의 차세대 시퀀싱 플랫폼을 사용하여 시퀀싱됩니다. 마지막으로 16S 리보솜 RNA 유전자 시퀀싱 데이터를 분석합니다. 예를 들어, CX3CR1이 있거나없는 MRL / lpr 마우스의 장내 미생물 비교에서 얻은 데이터가 표시됩니다. 결과는 프로테오박테리아 문과 같은 병원성 박테리아를 포함하는 속과 건강한 공생 미생물총의 일부로 간주되는 비피도박테리움 속에서 상당한 차이를 보여주었습니다. 요약하면, 이 간단하고 비용 효율적인 DNA 분리 방법은 신뢰할 수 있으며 자가면역 질환과 관련된 장내 미생물 변화를 조사하는 데 도움이 될 수 있습니다.

아르곤 국립 연구소의 결과는 자격을 갖춘 생물 정보학자가 분석 한 다음 표준 통계 방법을 사용하여 데이터를 사내 분석합니다. 일반적인 마이크로바이옴 분석에는 샘플의 다른 미생물에 대한 프록시로서 유사한 서열을 작동 분류학적 단위(OTU) 또는 앰플리콘 서열 변이체(ASV)로 클러스터링하는 것이 포함됩니다. 그런 다음 샘플 전체의 OTU 또는 ASV 수를 사용하여 샘플 내(알파) 다양성 및 샘플 간(베타) 다이버시티의 변화를 테스트할 수 있습니다. 또한 관심 있는 메타데이터 범주에 걸쳐 차등적으로 풍부한 분류군을 테스트하는 데 사용할 수도 있습니다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 수용체CX3CR1이 결여된 마우스 균주는 상이한 장내 미생물 구성을 갖는다. 야생형 MRL/lpr과 비교하여 MRL/lpr-CX 3 CR1 gfp/gfp 마우스(CX3CR1 대신 녹색 형광 단백질...

이 프로토콜은 자가면역 질환 발병 중 쥐 장내 미생물 변화를 분석하기 위한 간단하고 비용 효율적인 DNA 분리 방법을 제공합니다.

간단하고 비용 효율적인 DNA 분리 방법을 사용한 루푸스 경향 마우스의 분변 미생물 역학 분석

Gut microbiota has an important role in educating the immune system. This relationship is extremely important for understanding autoimmune diseases that ...

제안된 DNA 분리 방법은 자가면역질환 마우스 모델에서 장내 미생물 역학을 연구하는 역할을 할 수 있습니다. 시판되는 키트에 필적하는 분변 샘플로부터 DNA를 얻기 위해 보다 다재다능하고 비용 효율적이며 효율적인 방법이 제안된다. 시작하려면 각 마우스를 케이지에서 개별적으로 꺼내 항문에서 직접 대변 펠릿을 수집하고 처리 될 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.멸균되고 깨끗한 집게, 튜브 및 장갑으로 샘플을 처리하십시오. 미리 계량 된 2 밀리리터 스크류 캡 튜브에 냉동 펠릿을 추가하고 분변 중량을 그램 단위로 기록하면 분변 펠릿 당 0.02-0.05 그램 사이 여야합니다. 펠릿에 0.1mm 유리 비드, 500 마이크로 리터의 용해 완충액 및 200 마이크로 리터의 20 % 나트륨 도데 실 설페이트의 얇은 층을 추가하십시오.비드는 균질화기에서 4분 동안 튜브를 두들긴 다음 3-5분 동안 볼텍싱을 했습니다. 기포와 거품을 제거하기 위해 짧은 시간 동안 튜브를 원심 분리하십시오. 미생물군 샘플에서 DNA를 추출하려면 350마이크로리터의 샘플 상청액을 파편 없이 새로운 1.5밀리리터 스냅 캡 튜브로 옮깁니다.500마이크로리터의 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올을 25:24:1의 비율로 추가하고 1분 동안 와동시킵니다. 원심분리 후, 180 마이크로리터의 상부 수성 상을 새로운 1.5 밀리리터 스냅 캡 튜브로 옮긴다. 180 마이크로 리터의 클로로포름을 넣고 뒤집어 혼합하십시오.이로부터 180 마이크로 리터의 수성 상을 새로운 스냅 캡 튜브로 옮깁니다. 생물 안전 캐비닛에 180 마이크로 리터의 차가운 이소프로판올과 36 마이크로 리터의 5 몰 암모늄 아세테이트를 추가하십시오. 몇 번 뒤집어 혼합하고 튜브를 얼음 위에 20분 동안 놓습니다.상청액을 버리고, 펠렛을 500 마이크로리터의 차가운 70%에탄올로 수회 세척하였다. 상청액을 버리고 펠릿이 깨끗해질 때까지 20분 동안 티슈 페이퍼에 튜브를 거꾸로 자연 건조시킵니다. 펠릿을 50마이크로리터의 분자 등급 물에 현탁하고 액체를 섭씨 37도에서 10분 동안 가열하여 큰 DNA 펠릿을 완전히 용해시킵니다.가열 후,이 튜브를 3, 400 배 G에서 1 분 동안 원심 분리하여 뚜껑에서 응축 방울을 회수하십시오. 농도를 측정하고, 분광 광도계를 사용하여 260/280 비를 구한다. 양질의 DNA에 대한 비율은 일반적으로 1.8과 2 사이입니다.준비된 샘플을 실온에서 1분 동안 600배 G로 원심분리한 후 섭씨 영하 80도에서 24시간 동안 동결시킨다. 그런 다음 시퀀싱을 위해 마이크로리터당 1에서 50나노그램 범위의 농도를 가진 20마이크로리터의 샘플을 아르곤 국립 연구소로 보냅니다. 수용체 CX3CR1이 결여된 마우스 균주는 야생형 MRL/lpr, MRL/lpr-CX3CR1 GFP/GFP 마우스와 비교하여 장내 미생물 구성이 다르며, 특정 속에서 유의미한 차이를 보이며, 이는 프로테오박테리아 문과 같은 잠재적 병원성 박테리아와 관련이 있습니다.시료 오염에 주의하십시오. 그것은 멸균되어야합니다. 또한 상청액을 새 튜브로 옮길 때 정확하게 피펫팅하는 것이 중요합니다.이 방법은 PCR, 제한 효소 소화 또는 게놈 라이브러리 구성과 같은 분자 분석에 적합합니다. 루푸스에서 우리는 장내 미생물총과 루푸스 진행 사이에 강한 관계가 있음을 입증했습니다.

analysis-fecal-microbiota-dynamics-lupus-prone-mice-using-simple-cost

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 결장 종양 보유 마우스의 대변 샘플에서 DNA 분리 프로토콜에 대해 설명합니다. 추출된 DNA는 PCR을 사용하여 증폭되고 생성물은 마그네틱 비드 기반 접근법을 사용하여 추가로 세척됩니다. 이 방법은 대장 미생물총(microbiota) 및 동물 폐사율에 대한 환경 풍부화의 영향을 결정하는 데 사용할 수 있습니다.

대변 미생물 DNA 분리: 쥐 종양 모델의 미생물 군집 다양성에 대한 환경 풍부화의 영향 연구

bm12 림프구가 C57BL/6 수용자로 이식되는 것은 전신 홍반성 루푸스의 확립된 모델입니다. 여기에서는 이 모델을 사용하여 질병을 시작하는 방법과 유세포 분석을 통해 T 여포 보조 세포, 생식 중심 B 세포 및 형질 세포를 특성화하는 방법을 설명합니다.

C57BL / 6 마​​우스의 전신 홍 반성 루푸스의 BM12 유도 성 모델 (SLE)

장 림프구의 정량적 특성화에 대한 관심이 높아지고 있는데, 이는 이러한 세포가 다양한 장 및 전신 질환에서 중요한 역할을 한다는 인식이 높아짐에 따라 발생합니다. 이 프로토콜에서는 후속 유세포 분석 특성 분석을 위해 다른 소장 구획에서 단일 세포 집단을 분리하는 방법을 설명합니다.

쥐 소장 림프구의 분리 및 유세포 특성

환경 농축 (EE) 생활, 스트레스, 질병 사이 연결의 기반이 되는 메커니즘을 공개 하는 데 사용 되는 동물 주택 환경입니다. 이 프로토콜에서는 콜론 tumorigenesis EE의 마우스 모델을 사용 하 여 특별히 microbiota 생물 다양성 동물 사망률에 영향을 줄 수 있는 변경을 정의 하는 프로시저를 설명 합니다.

마우스 결 장 종양 모델에서 콜론 미생물 생물 다양성에 환경 농축의 효과 정의 하는 방법

여기 창 자 연관 된 림프 조직 Peyer의 패치 및 배수 mesenteric 림프절을 포함 하 여 유도 사이트와 lamina propria 포함 이펙터 사이트에서 세포의 고립에 대 한 자세한 프로토콜 설명 및 작은 장 면역 시스템의 장 상피입니다.

마우스 작은 장의 면역 시스템에서 세포를 분리

여기 우리가 제공 자세한 프로토콜 항생제의 구강 관리에 대 한 쥐, 배설물 샘플, DNA 추출 및 배설물 박테리아의 정량화를 정량 하 여.

구두 항생제 치료 후 Murine 장 Microbiota의 정량적 중 합 효소 연쇄 반응-기반 분석

여기에 설명된 16S rRNA 메타게놈 시퀀싱 및 자유롭게 사용할 수 있는 도구를 사용하여 분석하는 미생물군유전체 프로파일링을 위한 간소화된 표준 작동 절차입니다. 이 프로토콜은 미생물군유전체 분야를 새로운 연구자뿐만 아니라 더 높은 해상도에서 박테리아 프로파일링을 달성하기 위한 방법에 대한 업데이트를 요구하는 연구자들에게 도움이 될 것입니다.

2단계 PCR 및 차세대 16S rRNA 유전자 시퀀싱을 사용한 미생물 분석

본 프로토콜은 마우스에서 루푸스 진행을 추적하는 방법을 기술한다. 세포 침윤과 신장에서의 단백질 침착을 기반으로 루푸스 신염을 특성화하기위한 두 가지 추가 절차가 제시됩니다.

단백뇨, 백혈구의 신장 침윤 및 루푸스가 발생하기 쉬운 MRL / lpr 마우스에서 단백질의 신장 침착 분석

여기서 목표는 심혈관 질환에서 dysbiosis의 메커니즘을 조사하기 위한 프로토콜을 설명하는 것입니다. 이 논문은 쥐 분변 샘플을 무균적으로 수집 및 이식하고, 장을 분리하고, "Swiss-roll" 방법을 사용한 다음 면역염색 기술을 사용하여 위장관의 변화를 조사하는 방법에 대해 설명합니다.

쥐 분변 분리 및 미생물군 이식

이 프로토콜은 무균 마우스를 실험용 단일 케이지 아이솔레이터(isocage)로 옮기고 수용하는 동시에 멸균 상태를 유지하기 위한 모범 사례를 설명합니다. 무균 마우스에 대변 이식 방법과 추가 적용을 위해 이러한 장내 "인간화된" 마우스에서 생존 가능한 박테리아를 수집하는 방법에 대해 논의합니다.

무균 마우스에 인간 배설물 이식을 위한 Bioexclusion IsoPositive 케이지 실험의 준비 및 유지 관리

배우세요 간단하고 비용 효율적인 DNA 분리 방법을 사용하여 루푸스 경향 마우스의 분변 미생물 역학을 분석하는 기술입니다. 이 방법은 자가면역 질환 연구에서 장내 미생물 변화를 연구하는 데 활용됩니다.

간단하고 비용 효율적인 DNA 분리 방법을 사용한 루푸스 경향 마우스의 분변 미생물 역학 분석

더 많은 동영상 탐색