Name: 엑소좀 기반 도파민 운반체 시스템의 공식화 및 특성화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: 배우세요 Wharton's jelly 중간엽줄기세포에서 도파민 적재 엑소좀을 분리하고 특성화하는 방법을. 이 프로토콜은 세포독성 평가를 포함한 약물 전달 시스템 연구에 활용됩니다.

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이 작업은 주로 Yıldız Technical University Scientific Research Projects(TSA-2021-4713)에서 제공한 연구 자금으로 지원되었습니다.

알림: 이 프로토콜에 사용된 모든 재료 및 장비와 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
1. Wharton's jelly 중간엽 줄기세포의 배양 및 동결 보존
<ol><li>-80°C 냉동고에서 WJ-MSC(ATCC에서)를 꺼냅니다. 10% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 DMEM-F12 배지가 들어 있는 플라스크에 세포를 파종합니다. 37 ° C에서 5 % CO2 를 함유 한 인큐베이터에서 배양합니다.</li>
	<li>배양 배지는 2일마다 교체합니다. 세포가 80% 합류점에 도달하면 세포를 통과시킵니다. 통과할 세포를 5mL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척합니다. 알림: 트립신을 첨가하기 전에 PBS로 세척하면 플라스크 표면에서 세포를 쉽게 분리할 수 있습니다.</li>
	<li>PBS를 제거하고 플라스크에 트립신-EDTA 용액 5mL를 추가합니다. 플라스크를 37 ° C에서 5 분 동안 5 % CO2 가 들어있는 인큐베이터에서 배양합니다.</li>
	<li>상층액을 튜브에 모으고 1,500 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 상층액을 제거하고 피펫팅을 통해 1mL의 DMEM-F12 + 10% FBS를 튜브에 추가합니다.</li>
	<li>세포를 더 큰 플라스크로 옮기고 충분한 엑소좀이 얻어질 때까지 DMEM-F12 + 10% FBS를 첨가하여 배양을 계속합니다35. 참고: 배양된 세포는 10% 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 사용하여 100만/mL의 밀도로 동결하고 -80°C에서 보관합니다.</li>
</ol>2. Wharton's Jelly 중간엽 줄기세포에서 엑소좀 생산
참고: 엑소좀은 배양된 WJ-MSC에서 분리됩니다. 엑소좀 분리는 세포가 플라스크 표면을 덮고 약 80% 밀도에 도달할 때 수행됩니다.
<ol><li>플라스크에서 10% FBS가 포함된 상층액 배지를 제거하고 5mL의 PBS로 세포를 세척합니다. PBS로 헹군 후 무혈청 DMEM-F12 배지를 세포에 추가합니다. 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 48시간 동안 플라스크를 배양합니다. 배양 후 무혈청 배지를 튜브에 모아 -20°C에서 보관합니다. 참고: 2.1단계에서 180mL의 무혈청 배지를 수집하여 -20°C에서 보관합니다. 해동 후, 아래에 설명된 대로 배치 원심분리 공정이 시작됩니다.</li>
	<li>엑소좀의 분리<ol><li>수집된 무혈청 배지를 300 x g 에서 +4°C에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 조심스럽게 빼내어 다른 튜브로 옮깁니다.</li>
		<li>수집된 상층액을 2,000× g 에서 +4°C에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 조심스럽게 빼내어 다른 튜브로 옮깁니다.</li>
		<li>수집된 상층액을 10,000× g 에서 +4°C에서 30분 동안 원심분리합니다. 상층액을 조심스럽게 빼내어 다른 튜브로 옮깁니다.</li>
		<li>수집된 상층액을 초원심분리기 튜브와 초원심분리기로 110,000× g 에서 130분 동안 이송합니다. 상층액을 천천히 제거하고 펠릿에 PBS 1mL를 추가합니다.</li>
		<li>펠릿과 초원심분리기를 110,000× g 에서 +4°C에서 70분 동안 소용돌이칩니다36(그림 1). 상층액을 천천히 제거하고 펠릿에 PBS 1mL를 추가합니다. 참고: 초원심분리 단계가 완료된 후 얻은 엑소좀은 -80°C에서 보관할 수 있습니다. 얻은 펠릿은 이제 특성화 준비가 되었습니다.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63624/63624fig01.jpg"> 그림 1: 엑소좀 분리. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63624/63624fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
3. 엑소좀의 특성 분석
<ol><li>나노 입자 추적 분석(NTA) 참고: 나노 입자 추적 분석은 분리된 엑소좀의 크기와 농도를 결정하기 위해 수행됩니다. 1x PBS 용액에 사용되는 정제는 pH 7.3-7.5 범위에 있어야 합니다. 1x PBS 용액에는 10mM 인산염 완충액, 137mM 염화나트륨 및 2.7mM 염화칼륨이 포함되어 있습니다. 용액은 증류수 100mL에 PBS 정제 1개를 첨가하여 제조됩니다. 이 준비된 용액은 오토클레이브에 의해 멸균됩니다.<ol><li>엑소좀 10μL에 PBS 990μL를 첨가하여 엑소좀을 100배 희석합니다. 희석된 현탁액을 일회용 주사기에 넣습니다.</li>
		<li>NTA 장치를 켜고 컴퓨터를 연결합니다. 소프트웨어를 엽니다.</li>
		<li>주사기의 샘플을 장치의 카세트 섹션에 있는 튜브에 주입합니다. 장치의 카세트 커버를 닫습니다.</li>
		<li>소프트웨어가 열리면 분석 시작 버튼을 클릭합니다. 를 눌러 얻은 결과를 저장합니다 기록 버튼을 누릅니다.</li>
	</ol></li>
	<li>동적 광산란 분석 참고: 제타 전위 및 크기 측정을 위해 분리된 엑소좀도 NTA 분석과 동일한 방식으로 희석됩니다.<ol><li>엑소좀 20μL에 PBS 980μL를 추가합니다.</li>
		<li>제타 사이징 장치와 연결된 컴퓨터를 엽니다. 소프트웨어를 엽니다.</li>
		<li>3.2.1단계의 서스펜션을 일회용 큐벳에 추가합니다. 장치의 덮개를 열고 큐벳을 카세트에 넣은 다음 덮개를 닫습니다.</li>
		<li>장치의 소프트웨어에서 큐벳 유형을 선택합니다. 제타 전위 및 차원 분석을 위해 분석 시작 버튼을 클릭합니다. 참고: 분석은 치수 분석과 제타 전위에 대해 별도로 수행됩니다.</li>
	</ol></li>
</ol>4. 엑소좀에 도파민 로딩
NOTE: WJ-MSC 엑소좀의 특성 분석이 완료된 후, 약물 전달 시스템으로 도파민이 함유된 엑소좀을 수득했습니다. 엑소좀에 약물을 로딩하는 것은 배양 방법을 사용하여 수행됩니다.
<ol><li>2.2.5단계의 엑소좀 현탁액에 PBS 3mL를 추가합니다. 0.22μm 필터를 사용하여 여과하여 희석된 현탁액을 멸균합니다. 멸균된 엑소좀 현탁액 500μL를 다른 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>증류수로 도파민 용액(0.5mg/mL)을 준비합니다. 엑소좀이 들어 있는 튜브에 도파민 용액 500μL를 넣습니다.</li>
	<li>4.2단계에서 현탁액에 사포닌을 추가합니다. 준비된 엑소좀-도파민 현탁액을 37°C에서 24시간 동안 배양합니다. 알림: 사포닌 농도는 총 용액의 0.002%를 초과해서는 안 됩니다.</li>
	<li>현탁액을 90,000× g 에서 70분 동안 초원심분리하여 배지에서 유리 도파민과 사포닌을 제거합니다. 분리된 엑소좀은 추가 분석을 위해 사용할 때까지 -20°C에서 보관합니다37. 참고: 준비된 도파민 용액의 안정성을 위해 0.02% 아스코르브산을 첨가하십시오.</li>
</ol>5. 도파민이 함유된 엑소좀의 특성 분석
<ol><li>나노 입자 추적 분석(NTA) 참고: 나노 입자 추적 분석은 분리된 엑소좀의 크기와 농도를 결정하기 위해 수행됩니다.<ol><li>3.1.1-3.1.4단계에 따라 엑소좀을 희석하고 NTA를 수행합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>동적 광산란 분석 참고: 제타 전위 및 크기 측정을 위해 분리된 엑소좀도 NTA 분석과 유사하게 희석됩니다.<ol><li>3.2.1-3.2.4단계에 따라 엑소좀을 희석하고 동적 광산란 분석을 수행합니다. 참고: 각 용액(사포닌, 도파민, 엑소좀-도파민)의 크기 및 제타 전위는 별도로 분석됩니다.</li>
	</ol></li>
</ol>6. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)
참고: 엑소좀에 로드된 도파민의 양은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 방법으로 측정됩니다. 얻어진 제형 내에서 도파민의 존재를 감지하기 위해 엑소좀은 특수 공정에 의해 폭발합니다.
<ol><li>제형을 75°C 히터에 넣어 증발시킵니다. 아세토니트릴(50:50 비율)을 서스펜션과 와류에 추가합니다. 용액을 10분 동안 초음파 처리합니다.</li>
	<li>용액을 10,000× g에서 10분 동안 원심분리합니다. 0.22μm 필터를 통해 상층액을 여과합니다.</li>
	<li>30°C에서 1mL/분의 유속으로 C18 컬럼을 사용하여 모든 분석물을 분석합니다(이동상 H2O/아세토니트릴). 230nm에서 흡광도를 측정한다38.</li>
</ol>7. 약물 로딩 용량(DL) 측정 및 체외 약물 방출 역학
<ol><li>약물 적재 용량(DL) 참고: 엑소좀에 로드된 도파민의 양은 UV-Vis 분광광광도계를 사용하여 정량화됩니다. 흡광도는 280nm에서 판독됩니다. 합성 중에 수집된 상청액은 무부하 약물의 양을 측정하는 데 사용됩니다. 상층액의 도파민 농도는 도파민에 대한 표준 보정 곡선을 통해 결정됩니다.<ol><li>도파민 1mg/mL의 원액을 준비합니다. 증류수를 사용하여 원액에서 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 및 0.5mg/mL의 농도를 준비합니다. 참고: 준비된 도파민 용액의 안정성을 위해 0.02% 아스코르브산을 첨가하십시오.</li>
		<li>UV 분광 광도계에서 280nm에서 각 도파민 희석의 흡광도를 측정하여 표준 검량선을 생성합니다.</li>
		<li>280nm에서 상층액의 흡광도를 측정합니다.</li>
		<li>Eq (1)39를 사용하여 도파민의 약물 로딩 용량을 계산합니다. DL (%) = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63624/63624eq01.jpg" style="margin: auto;"> 100 (1) 참고: 분석은 세 번에 걸쳐 수행됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>In vitro 약물 방출 역학 참고: 도파민이 함유된 엑소좀의 약물 방출 역학은 투석막을 사용하여 수행됩니다. PBS, pH 7.4는 생리학적 미세환경을 시뮬레이션하기 위한 방출 매체로 사용됩니다.<ol><li>도파민이 함유된 엑소좀 1mL를 투석막에 추가합니다. 멤브레인을 비커에 넣습니다. PBS 15mL를 비커에 추가합니다.</li>
		<li>0.5시간, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 8시간 동안 비커에 1mL의 방출 배지를 샘플링합니다. 각 시점에서 샘플의 부피를 새 PBS로 교체합니다. UV-Vis 분광계를 사용하여 280nm에서 지정된 간격으로 채취한 샘플을 분석합니다.</li>
		<li>식 (2)40을 사용하여 결과를 계산합니다. 릴리스(%) = <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63624/63624eq02.jpg" style="margin: auto;"> 100(2) 참고: 체외 약물 방출 역학을 측정하기 위해 보정 곡선이 준비되었습니다. 도파민 용액은 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5 및 5.0mg/mL 농도로 제조됩니다. 각 농도의 UV 흡광도 값은 UV-Vis 분광광도계를 사용하여 280nm에서 측정됩니다.</li>
	</ol></li>
</ol>8. 시험관 내 세포 독성 시험
<ol><li>섬유아세포의 활성화와 배양<ol><li>-80°C 냉동실에서 섬유아세포를 제거합니다. DMEM-F12 + 10% FBS가 들어 있는 플라스크에 세포를 심습니다.</li>
		<li>37 ° C에서 5 % CO 2 를 함유 한 인큐베이터에서 세포를 배양합니다. 배양 배지는 2일마다 교체합니다.</li>
		<li>세포가 80% 합류점에 도달할 때까지 세포를 통과시킵니다. 1.3-1.5단계를 따릅니다. 1,500 × g 에서 5분 동안 원심분리한 후 상층액을 제거하고 DMEM-F12 + 10% FBS 1mL를 첨가하고 96웰 플레이트에 웰당 10,000개의 세포를 시드합니다.<ol><li>DMEM-F12 배지 + 10 % FBS를 첨가하고 5 % CO2 가 함유 된 인큐베이터에서 37 ° C에서 18 시간 동안 세포를 배양합니다. 배양이 끝날 때 우물의 배지를 변경하십시오.</li>
		</ol></li>
		<li>도파민이 함유된 엑소좀 현탁액을 준비합니다. 도파민이 함유된 엑소좀 제형을 배지로 희석하여 100μL/mL, 250μL/mL, 500μL/mL, 1,000μL/mL의 농도를 얻습니다.</li>
		<li>준비된 농도를 96웰 플레이트의 각 웰 내에 있는 세포에 추가합니다. 플레이트를 37°C에서 5%CO241을 함유하는 인큐베이터에서 18시간 동안 배양합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>MTT 세포 생존율 분석 참고: 배양이 끝나면 세포의 생존율 비율은 MTT 테스트에 의해 결정됩니다.<ol><li>PBS로 MTT 용액(5mg/mL)을 준비합니다. 각 웰에 10μL의 MTT 용액을 추가합니다. 37°C에서 4시간 동안 배양합니다.</li>
		<li>배양이 끝나면 각 웰에 100μL의 DMSO를 추가합니다. 어두운 곳에서 실온에서 30분 동안 플레이트를 배양합니다. 570nm42,43에서 ELISA 리더의 흡광도 값을 측정합니다. 참고: MTT 생존력 테스트는 세 번에 걸쳐 수행됩니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

엑소좀은 크기가 40-200nm인 작은 막 소포체로, MSC1과 같은 대부분의 세포 유형에서 분비됩니다. 세포 간 통신을 가능하게 하는 엑소좀은 세포내이입(endocytosis), 식세포작용(phagocytosis), 마이크로피노사이토시스(micropinocytosis), 지질 매개 내재화(lipid-mediated internalization), 융합(fusion) 33,44 등 다양한 방식으로 세포에 들어갈 수 있습니다. 다른 나노캐리어 시스템과 비교했을 때, 엑소좀 표면에서 발견되는 지질과 콜레스테롤은 친수성 분자와 소수성 분자를 모두 운반할 수 있는 능력을 부여하며, 콜레스테롤 말단의 수소 결합으로 단단한 포장이 가능합니다45.
본 연구에서는 MSC 유래 엑소좀의 분리, 약물 로딩 실...

엑소좀은 중요한 특징을 가진 생체 활성 소포체로, 크기는 40nm에서 200nm까지 다양합니다. 엑소좀은 세포막에서 유래하며 엔도솜의 방출로 인해 형성된다1. 이러한 구조는 세포 간 통신기 역할을 하며 이웃 세포와 상호 작용하여 활성 분자의 전달을 촉진합니다. 엑소좀은 다양한 출처에서 분리할 수 있습니다. 여기에는 혈장, 소변, 뇌척수액, 타액과 같은 체액과 체외 조건에서 배양된 세포주가 포함됩니다. 엑소좀은 지질, 단백질, 핵산과 같은 생체 거대분자를 함유하고 있기 때문에 신경 손상을 제거하는 데 중요한 역할을 합니다2. 신경계의 지지세포인 글리아(Glia)3는 엑소좀(exosome)4을 통해 단백질과 마이크로 RNA를 뉴런의 축삭돌기로 전달한다.
신경 전도의 특징인 미엘린 수초를 형성하는 지질도 엑소좀 4,5를 통해 희소돌기아교세포에서 방출됩니다. 엑소좀은 또한 시냅스 가소성, 신경 스트레스 반응, 세포 간 통신 및 뇌의 신경 발생과 같은 과정에도 관여합니다 6,7. 엑소좀은 나노 차원을 가지고 있기 때문에 BBB를 통과할 수 있습니다. 간질액에서 뇌척수액으로 이 막을 통과한 후 뇌척수액으로 전이되는 특별한 경로가 있다8. 엑소좀은 표면 특성으로 인해 약물 전달 시스템으로서 표적 세포와 효율적으로 상호 작용하고 로드된 약물을 능동적으로 전달할 수 있습니다.
엑소좀 표면에 다양한 접착 단백질(테트라스파닌 및 인테그린)이 발현되기 때문에 이러한 세포외 소포체는 숙주 세포막과 쉽게 상호 작용하고 융합할 수 있습니다9. 엑소좀은 BBB를 침투할 수 있는 능력과 표면 특성으로 인해 특히 중추신경계 질환 치료에 약물 전달 시스템으로 사용될 수 있다고 생각됩니다. 중간엽줄기세포(MSC) 유래 엑소좀은 동종 세포 치료제에 비해 면역 거부 반응 위험이 낮으며, 이러한 점에서 무세포 치료 응용 분야의 중요한 구성 요소가 될 수 있습니다10.
도파민은 파킨슨병(PD)의 특징인 뇌 결핍 분자로, 나날이 악화되고 있다11,12,13. PD는 중뇌의 흑질(substantia nigra)에서 도파민 뉴런의 퇴화 및 운동 뉴런 기능의 손실과 관련이 있는 것으로 알려져있다 14,15. 도파민성 뉴런의 사멸은 신경전달물질인 도파민이 뇌선조체에 공급되는 것을 막는다. 그 결과 PD 특이적 증상이 나타난다16. 파킨슨병의 증상은 서운동증, 자세 불안정, 경직, 특히 안정시 떨림12,13이다. 파킨슨병은 2세기 전에 처음 기술되었지만, 이 질병의 병리와 원인을 이해하기 위한 연구는 여전히 진행 중이며, 현재 파킨슨병이 복잡한 전신 질환이라는 것이 받아들여지고 있다17. 도파민 결핍이 발생할 것으로 예측되며, 뉴런의 80% 이상이 퇴화될 때 임상적 PD 증상이 관찰된다18. 질병 치료에서 불완전한 도파민 보충은 운동 증상을 줄이기 위해 선호됩니다. 생체 내 연구에 따르면 뇌에 도파민을 직접 주입하면 동물의 증상이 크게 감소하는 것으로 나타났습니다19. L-DOPA(L-3,4-디히드록시페닐알라닌)와 같은 도파민 전구체와 도파민 수용체 약물은 인간에서 뇌에 도파민을 직접 주입하는 것이 불가능하고 시스템에 들어가는 도파민이 BBB20을 통과할 수 없기 때문에 임상에서 사용됩니다. 이러한 유형의 약물은 시간이 지남에 따라 효과를 잃습니다. 그러나 파킨슨병에 대한 치료법은 아직 없습니다. 따라서 질병의 병태생리를 밝히고 파킨슨병이 환자에게 미치는 영향을 줄이기 위한 새로운 치료 전략과 치료 방식을 개발할 필요성이 매우 높습니다.
엑소좀 기반 연구는 최근 신경계 질환의 치료적 접근과 병리학에 대한 정보를 수집해 주목받고 있다. MSC 유래 엑소좀은 신경 손상의 염증을 줄이고 신경 재생에 기여하는 것으로 나타났습니다21,22,23. 또한, MSC 유래 엑소좀 분비체는 특히 도파민성 뉴런에 대한 신경 영양 및 신경 보호 효과를 보여줌으로써 세포 사멸을 감소시키는 것으로 보고되었습니다24,25. 최근 엑소좀을 치료제 전달 시스템으로 사용하는 플랫폼에 대한 연구가 집중적으로 가속화되고 있습니다. 수많은 연구에서 관련 약물을 엑소좀에 쉽게 캡슐화하고 표적 세포, 조직 및 장기에 안전하게 전달할 수 있는 것으로 관찰되었습니다26,27. 배양, 동결/해동 주기, 초음파 처리 및 압출과 같은 다양한 방법을 엑소좀에 약물을 로딩하는 데 사용할 수 있습니다28.
엑소좀 또는 엑소좀 유사 소포와의 배양은 친유성 소분자가 이러한 전달 시스템28,29,30에 수동적으로 캡슐화될 수 있도록 합니다. 특히 커큐민 31, 카탈라아제 30, 독소루비신32, 파클리탁셀33 등 다양한 분자가 엑소좀에 효과적으로 로딩됐다. 항산화 활성을 가진 카탈라아제 함유 엑소좀은 뇌의 뉴런과 미세아교세포에 효율적으로 축적되어 강력한 신경보호 활성을 나타내는 것이 관찰되었습니다30. 동일한 연구에서, 로딩 효율을 높이기 위해 복합체에 첨가 된 사포닌은 배양 중 약물 로딩 비율을 증가시키는 것으로 밝혀졌습니다30,34. 그러나 엑소좀에 약물을 로딩하는 기준을 확립하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다.
본 논문은 WJ-MSC에서 분리한 엑소좀에 도파민을 캡슐화하여 나노캐리어 시스템을 개발하는 방법을 설명합니다. WJ-MSC의 배양, 엑소좀의 분리 및 특성 분석, 약물 로딩 실험, 다양한 기법을 이용한 도파민 로딩 엑소좀의 특성 분석, in vitro 세포독성 분석 등 모든 단계를 상세히 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>0.22 & 마이크로; m 멤브레인 필터</td><td>Aisimo</td><td></td><td>살균 공정에 사용</td></tr><tr><td>0.45 &micro; m 주사기 필터</td><td>Aisimo</td><td></td><td>살균 과정에 사용</td></tr><tr><td>15 mL 팔콘 튜브</td><td>둥지</td><td></td><td>세포 배양 단계에 사용</td></tr><tr><td>25 cm2 세포 배양 플라스크 (Falcon, TPP 조직 배양 플라스크</td><td>둥지</td><td></td><td>세포 배양 단계에 사용</td></tr><tr><td>50 mL 팔콘 튜브</td><td>둥지</td><td></td><td>세포 배양 단계에 사용</td></tr><tr><td>75 cm2 세포 배양 플라스크 (Falcon, TPP 조직 배양 플라스크</td><td>Nest</td><td></td><td>세포 배양 단계</td></tr><tr><td>96 웰 플레이트에 사용됨 (Falcon, TPP microplates)</td><td>Merck Millipore</td><td></td><td>세포 배양 단계에 사용됨</td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Sigma</td><td>271004-1L</td><td>HPLC 분석에 사용됨</td></tr><tr><td>오토클레이브</td><td>NUVE-OT 90L</td><td></td><td>멸균 공정에 사용됨</td></tr><tr><td>Cell Culture Cabin</td><td>Hera Safe KS</td><td></td><td>세포 배양 과정에 사용됨</td></tr><tr><td>원심</td><td>히타치</td><td>CF16RN</td><td>엑소좀 분리 단계에 사용됨</td></tr><tr><td>Safe Cell UV가 있는 CO2 인큐베이터 Panasonic</td><td></td><td></td><td>세포 배양 과정에 사용됨</td></tr><tr><td>도파민 염산염 H8502-10G</td><td>Sigma</td><td>H8502-10G</td><td>엑소좀 도파민 로딩</td></tr><tr><td>에 사용됨Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12</td><td>Sigma</td><td>RNBJ7249</td><td>세포배양액으로 사용</td></tr>, <tr><td>소태아혈청-FBS</td>, <td>염소자리</td><td>FBS-16A</td><td>, 세포배양액에 첨가하여 사용하였다.</td></tr><tr><td>냉동고 -80 &deg; C</td><td>Panasonic</td><td>MDF-U5386S-PE</td><td>세포 및 생성된 엑소좀을 저장하기 위해</td></tr><tr><td>냉장고</td><td>Panasonic</td><td>MPR-215-PE</td><td>세포 배양 및 기타 물질을 저장하는 데 사용</td></tr><tr><td>고성능 액체 크로마토그래피-HPLC</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>얻어진 제형의 함량에서 도파민의 존재를 조사했습니다.</td></tr><tr><td>현미경 - Primovert</td><td>Zeiss</td><td></td><td>세포 배양에서 세포를 관찰하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>MTT Assay</td><td>Biomatik</td><td></td><td>세포 생존율 측정에 사용</td></tr><tr><td>NanoSight NS300</td><td>Malvern 파날리티칼</td><td>Malvern 파날리티</td>컬 <td>엑소좀 특성화에 사용</td></tr><tr><td>Optima XPN-100 초원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>엑소좀 분리 단계에 사용</td></tr><tr><td>PBS 정제</td><td>Biomatik</td><td>43602</td><td>PBS 용액</td></tr><tr><td>제조 시 Penicilin/ 스트렙토 마이신 용액</td><td>염소 자리</td><td>PB-S</td><td>세포 배양시 오염을 방지하기 위해 배지에 첨가되었습니다.</td></tr><tr><td>Pipette Aid</td><td>Isolab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Precision balance-Kern</td><td>Kern-ABJ220-4NM</td><td></td><td>용액</td></tr><tr><td>Q500 Sonicator</td><td>Qsonica, LLC</td><td></td><td>용액 제조에 사용 HPLC 분석에서 엑소좀을 분해하는 데 사용</td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma</td><td>47036-50G-F</td><td>엑소좀 도파민 로딩 과정에서 총 용액에 첨가하여 사용되었습니다.</td></tr><tr><td>Spectrostar-Nano-Spectrophotometry</td><td>BMG LABTECH</td><td></td><td>MTT 및 약물 방출에 사용</td></tr><tr><td>SPSS 22</td><td></td><td></td><td>통계 패키지 프로그램</td></tr><tr><td>분석 Vorteks-FinePCR</td><td>FinePCR-FineVortex</td><td></td><td>용액을 균일하게 혼합하는 데 사용</td></tr><tr><td>수조 37 &deg; C-Senova</td><td>Senova</td><td></td><td>세포 배양 단계</td></tr><tr><td>Wharton에 사용 s 젤리 중간엽 줄기세포</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZetaSizer</td><td>Malvern Nano ZS</td><td>Malvern Nano ZS 엑</td><td>소좀 특성화에 사용</td></tr></tbody></table>

엑소좀 기반 도파민 운반체 시스템의 공식화 및 특성화

Formulating and Characterizing an Exosome-based Dopamine Carrier System

크기가 40nm에서 200nm 사이인 엑소좀은 세포외 소포체의 가장 작은 하위 그룹을 구성합니다. 세포에서 분비되는 이러한 생체 활성 소포는 세포 간 화물 및 통신에 적극적인 역할을 합니다. 엑소좀은 주로 혈장, 뇌척수액, 소변, 타액, 양수, 초유, 모유, 관절액, 정액, 흉산 등의 체액에서 발견됩니다. 엑소좀의 크기를 고려할 때 혈액뇌장벽(BBB)을 통과할 수 있기 때문에 중추신경계 질환에 중요한 역할을 할 수 있을 것으로 생각됩니다. 따라서 본 연구는 와튼의 젤리 중간엽 줄기세포(WJ-MSC)에서 분리한 엑소좀에 도파민을 캡슐화하여 엑소좀 기반 나노캐리어 시스템을 개발하는 것을 목표로 했다. 특성화 과정을 통과한 엑소좀은 도파민으로 배양되었습니다. 도파민이 함유된 엑소좀은 배양이 끝날 때 재특성화되었습니다. 도파민이 함유된 엑소좀은 약물 방출 및 세포 독성 분석에서 조사되었습니다. 그 결과, 도파민이 엑소좀 내에 성공적으로 캡슐화될 수 있으며, 도파민이 함유된 엑소좀이 섬유아세포 생존력에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났습니다.

엑소좀 분리 및 특성 분석 Wharton 젤리 줄기 세포는 배양액이 충분한 밀도에 도달하면 무혈청 배지에서 48시간 동안 배양 및 배양됩니다. 배양 종료 후 상층액은 -20°C에서 보관됩니다. 수집된 상층액은 PBS로 희석되고 초원심분리를 거칩니다(그림 1). 얻어진 용액은 NTA 및 DLS 분석으로 분석됩니다. 엑소좀은 0.22μm 필터를 통과하여 멸균됩니다. 얻어진 엑소좀의 평균 크기는 98nm로 확인되었습니다(동영상 1). 원심분리 막바지에 약 100억 개의 엑소좀 입자가 수득되었습니다. NTA 및 DLS 분석에서 밝혀진 나노 입자의 수는 서로 일치합니다. 또한 WJ-MSC에서 유래한 엑소좀의 제타 전위는 -15.7mV로 측정되었습니다(그림 2 및 그림 3).
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여기서 우리는 Wharton의 젤리 중간엽 줄기세포에서 줄기세포의 분리된 엑소좀을 도파민 로딩에 의해 제형을 얻는 것을 목표로 했습니다. 엑소좀 분리 및 특성 분석, 결과 엑소좀에 대한 약물 로딩, 개발된 제형의 세포독성 활성이 이 프로토콜에 설명되어 있습니다.

Exosomes between 40 and 200 nm in size constitute the smallest subgroup of extracellular vesicles. These bioactive vesicles secreted by cells play an ...

엑소좀은 크기가 14나노미터에서 200나노미터 사이의 세포에서 분비되는 소포에 반응할 수 있으며, 세포 내 화물과 통신에서 분리되어 세포외 소포체의 가장 작은 하위 그룹에 도달합니다. 엔도솜의 분화로 형성되는 엑소좀은 세포막에서 유래합니다. 줄기 세포는 골수 또는 지방 조직과 같은 다양한 출처에서 분리할 수 있습니다.하지만 성체 조직 건조 줄기세포는 면역원성 잠재력이 더 높다 단점 엑소좀의 크기로 혈액뇌장벽을 통과할 수 있기 때문에 중추신경계 질환에 중요한 역할을 한다고 한다. 먼저 씨를 뿌린 Wharton의 젤리 중간엽 줄기 세포를 5ml의 PBS로 씻습니다. 그런 다음 플라스크를 인큐베이터에 넣기 전에 5ml의 트립신 EDTA 용액을 추가합니다.배양 후에, 세포를 모으고 1, 5 분 동안 500 G에 분리한다. 그런 다음 상층액을 제거하고 12% FBS가 포함된 DMEM-F10 밀리리터를 튜브에 추가합니다. 배양된 세포를 PBS로 세척합니다.세척 후 혈청이 없는 DMEM-F12 배지를 세포에 추가하고 인큐베이터에 넣습니다. 엑소좀을 분리하기 위해 혈청이 없는 배지를 채취하고 섭씨 4도에서 300G에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 다른 튜브로 옮기고 더 빠른 속도로 연속 원심분리하여 처리합니다.최종 원심 분리 후 상층액을 천천히 제거하고 펠릿을 1 밀리리터 PBS에 용해시킵니다. 소용돌이에 의하여 섞고 110에 ultracentrifugation, 4 섭씨 온도에 70 분 동안 000 G로 진행하십시오. 초원심분리로 먼저 채취한 엑소좀 현탁액에 PBS 3mL를 첨가하고 0.22미크론 필터를 이용한 여과로 희석된 현탁액을 멸균한다.그런 다음 멸균된 엑소좀 현탁액 500마이크로리터를 다른 튜브로 옮깁니다. 다음으로 순차적으로 500 마이크로 리터의 0.5 밀리리터 도파민 용액과 사포닌을 멸균 된 현탁액에 첨가합니다. 배양 후 현탁액을 초원심 분리하십시오.이 샘플은 도파민이 함유된 엑소좀의 특성을 분석하기 위한 NTA 및 DLS 분석에 사용되거나 나중에 사용할 때까지 섭씨 영하 20도에서 보관할 수 있습니다. NTA 분석에서 와튼 젤리 유래 엑소좀의 평균 크기는 98나노미터, 도파민이 함유된 엑소좀은 110나노미터로 확인됐다. NTA와 DLS 분석에서 밝혀진 나노 입자의 수는 서로 일치했습니다.와튼 젤리 유래 엑소좀의 제타 전위는 마이너스 15.7, 도파민이 함유된 엑소좀은 마이너스 17.6밀리볼트로 측정되었습니다. 도파민이 함유된 엑소좀의 HPLC 분석 결과 도파민의 피크가 6.45분에 검출되었습니다. 누적 약물 방출 프로파일에 따르면 캡슐화된 도파민의 74.8%가 첫 8시간 이내에 엑소좀에서 방출되었습니다.섬유아세포에 있는 도파민이 적재되고 유리된 엑소좀의 세포독성을 조사했습니다. 도파민이 함유된 엑소좀은 세포독성 효과를 나타내지 않았지만, 사포닌은 섬유아세포의 생존력을 감소시켰습니다. MTT 분석은 섬유아세포를 도파민이 함유된 엑소좀으로 처리했을 때 세포 생존율이 증가했음을 보여주었습니다.결과의 통계적 유의성은 일원 분산 분석을 수행하여 평가되었습니다. 또한 섬유아세포에 대한 다양한 농도의 유리 엑소좀의 세포독성 효과를 조사했습니다. 섬유아세포 생존율은 유리 엑소좀이 밀리리터당 25마이크로리터 농도에서 더 높았습니다.중추 신경계에 정말 중요한 것은 환자의 크기, 가소성, 신경 반응, 좌우 의사 소통 및 뇌의 신경 발생과 같은 과정에서 역할을 한다는 것입니다. 또한, 엑소좀의 표면 덕분에 표적세포와 상호작용할 수 있는 것으로 관찰되었으며, 약물 투여 시 전달된 활성이 완성되는 것으로 나타났다. 이번 연구에서 처음으로 줄기세포 유래 엑소좀에 도파민을 캡슐화한 신약 제형을 개발했다.그는 이 제형이 파킨슨병 치료에 매우 유망할 것이라고 제안했습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

amperometric 기술은 자연 도파민의 산화에 의해 생성 된 산화 전류를 검출하여 하나의 세포에서 도파민 릴리스를 측정합니다. 동시 전압 클램프 및 amperometry 방법론은 도파민 수송과 도파민의 역방향 전송에서이 활동의​​ 규제 역할의 전체 '활동'사이의 기계론의 관계를 알 수있다.

동시 전압 클램프 및 Amperometry과 도파민 릴리스의 단일 세포 측정

출처: Yavuz, B., et al. 엑소좀 기반 도파민 운반체 시스템 공식화 및 특성화. J. Vis. 경험. (2022년)이 비디오는 엑소좀 내에서 도파민 캡슐화를 향상시키기 위해 사포닌 유도 막 투과화에 초점을 맞춘 도파민 로드 엑소좀의 제형을 보여줍니다.

도파민 부하 엑소좀 캐리어 시스템 공식화 

이 프로토콜의 목표는 양친매성 블록 공중합체로 구성된 미셀 약물 전달 시스템에서 물리적으로 갇힌 수용성이 낮은 약물의 준비 및 특성화를 설명하는 것입니다.

준비 및 개인의 특성과 다중 약물은 물리적으로 고분자 미셀을 포획로드

친 유성 독소루비신 전구 약물의 제조 및 특성화를위한 프로토콜 1,2- distearoyl- SN -glycero -3- phosphoethanolamine- N로드 - [아미노 (폴리에틸렌 글리콜) -2000 (PEG-DSPE) 미셀 설명한다.

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액정 나노 입자 (LCNP) nanocarrier는 살아있는 세포의 세포막에 소수성화물의 제어 전달을위한 수단으로 이용된다.

액정 나노 입자 캐리어의 소수성화물 캡슐화의 대상 플라즈마 멤브레인 배달

이 문서에서는 falcarindiol 지질 코팅 74 nm 나노 입자에 캡슐화를 설명합니다. 인간 줄기 세포 지질 작은 물방울에 의해 나노 입자의 세포질 통풍 관 그리고 confocal 형광 이미징에 의해 모니터링 됩니다. 나노 입자 용 매 변화, 급속 한 주입 방법으로 조작 하 고 그들의 크기는 동적 산란 기법으로 측정 된다.

Falcarindiol 인간 중간 엽 줄기 세포에 의해 포함 된 새로운 지질 코팅 나노 입자의

여기에서는 엔도솜 유래 나노소포체의 대규모 생산을 위한 자기 분리 보조 고속 균질화 방법을 생물학적 기원과 천연 세포외 소포체(EV)의 생물학적 기원과 유사한 구조, 형태 및 단백질 조성을 공유하는 새로운 유형의 엑소좀 모방체(EM)로 설명합니다.

엔도솜 유래 소포의 대규모 생산을 위한 자기 분리 보조 고속 균질화 방법

엑소좀은 상당한 임상적 잠재력을 가지고 있지만, in vivo clearance가 쉽고 안정성이 낮아 실제 적용에는 한계가 있습니다. 마이크로니들은 생리적 장벽을 뚫고 건조 상태 보존을 통해 국소 전달을 가능하게 함으로써 엑소좀 투여의 한계를 해결하고 임상적 유용성을 확대하는 솔루션을 제시합니다.

엑소좀의 로딩 및 전달을 위한 Microneedle patches의 제작 및 특성 분석

세포외 소포(EV)의 치료적 적용은 암 치료 및 약물 전달에 혁명을 일으킬 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 분리된 키메라 항원 수용체(CAR) 세포 유래 EV(CAR-EV)는 화물 용량이 증가하여 기능적 효능을 크게 향상시킵니다. 이 연구는 생물학적 활성과 치료 가능성을 밝히기 위해 CAR-EV를 추가로 특성화합니다.

키메라 항원 수용체-세포외 소포(CAR-EV) 기술 강화: 암 치료의 미래

생물막은 주변 환경과 복잡한 상호 작용을 합니다. 생물막-환경 상호 작용을 종합적으로 조사하기 위해 여기서는 생물막 개발을 위한 이질적인 화학적 환경을 조성하고, 국소 유속을 정량화하고, 생물막 군집 내부 및 주변의 질량 수송을 분석하는 일련의 방법을 제시합니다.

바이오 필름 및 서식지의 이질성의 공동 개발을 특성화하기위한 방법

배우세요 Wharton's jelly 중간엽줄기세포에서 도파민 적재 엑소좀을 분리하고 특성화하는 방법을. 이 프로토콜은 세포독성 평가를 포함한 약물 전달 시스템 연구에 활용됩니다.

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