Name: 광학 핀셋과 디포커싱 현미경을 사용한 적혈구의 점탄성 특성에 대한 정량적 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: 배우세요 광학 핀셋과 디포커싱 현미경을 이용한 적혈구 점탄성 특성 분석 방법을. 이 단일 세포 기반 프로토콜은 생리학적 및 병리학적 조건에서 적혈구의 점성 및 탄성 특성을 정량적으로 측정하여 연구자들이 세포 역학을 심층적으로 이해할 수 있게 합니다.

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저자는 가장 중요한 도움을 주신 CENABIO 고급 현미경 시설의 모든 구성원에게 감사를 표합니다. 이 작업은 브라질 기관인 Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) - Financial Code 001, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) 및 Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Fluidos Complexos (INCT-FCx)와 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)의 지원을 받았습니다. BP는 FAPERJ의 JCNE 보조금으로 지원되었습니다.

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</ol>

저자는 이 원고에 설명된 제품에 대한 재정적 이해관계가 없으며 공개할 다른 내용도 없습니다.

이 프로토콜에서는 광학 핀셋과 디포커싱 현미경을 기반으로 하는 통합 방법을 제시하여 RBC의 점탄성 특성을 정량적으로 매핑합니다. 저장 및 손실 전단 계수에 대한 결과와 RBC의 연질 유리 유변학을 특징짓는 스케일링 지수가 결정됩니다. 생리학적 상황8 또는 P. falciparum intra-erythrocyticcycle9 의 각 단계와 같은 다양한 실험 조건에 대한 이 프로토콜의 적용은 이미 수행되었다.
문헌의 참고 문헌은 RBC 유변학의 불일치를 지적하며, 부분적으로는 측정 6,7 동안 적절하게 고려되지 않은 세포 형태의 변화에 기인합니다. 동적 광 산란을 사용하여 RBC 저장 및 손실 계수에 대한 값은 1-100Hz6의 주파수...

적혈구라고도 알려진 성숙한 적혈구(RBC)는 인체의 가장 좁은 모세혈관을 통과할 때 크기가 두 배 이상 확장될 수 있습니다1. 이러한 용량은 외부 하중을 받을 때 변형되는 고유한 능력에 기인합니다.
최근 몇 년 동안, 다른 연구들은 적혈구 표면 2,3에서 이 특징을 특징지었다. 외부 하중으로 인한 재료의 탄성 및 점성 반응을 설명하는 물리학 영역을 유변학이라고합니다. 일반적으로 외력이 가해지면 재료의 특성에 따라 변형이 발생하며, 에너지를 저장하는 탄성 변형 또는 에너지를 소산하는 점성 변형으로 나눌 수 있다4. 적혈구를 포함한 모든 세포는 점탄성 거동을 나타냅니다. 즉, 에너지는 저장되고 소산됩니다. 따라서 전지의 점탄성 반응은 복소 전단 계수 G*(ω) = G'(ω) + iG"(ω)로 특성화될 수 있으며, 여기서 G'(ω)는 탄성 거동과 관련된 저장 탄성률이고, G"(ω)는 점도와 관련된 손실 계수이다4. 더욱이, 현상학적 모델은 세포 반응을 기술하기 위해 사용되어 왔으며, 가장 많이 사용되는 것 중 하나는 하중 주파수에 따른 복잡한 전단 계수의 멱법칙 의존성을 특징으로 하는 연질 유리질 유변학 모델5라고 합니다.
단일 셀 기반 방법은 힘을 가하고 부과 된 하중 2,3의 함수로 변위를 측정함으로써 적혈구의 점탄성 특성을 특성화하는 데 사용되었습니다. 그러나, 복잡한 전단 계수의 경우, 문헌에서 거의 결과를 찾을 수 없다. 동적 광 산란을 사용하여 RBC 저장 및 손실 계수 값은 1-100Hz6의 주파수 범위에서 0.01-1Pa로 변하는 것으로 보고되었습니다. 광학 자기 비틀림 세포분석법을 사용하여 겉보기 복합 탄성률(complex elastic modulus)을 얻었으며7, 비교 목적으로, 불일치를 명확히 하기 위해 곱셈 계수(multiplicative factor)를 주장했다.
보다 최근에, 시간 의존적 하중에 대한 인간 적혈구의 전단 계수의 저장 및 손실을 정량적으로 매핑하는 통합 도구로서 광학 핀셋(OT)과 디포커싱 현미경(DM)을 기반으로 하는 새로운 방법론이 확립되었습니다 8,9. 또한, 부드러운 유리질 유변학 모델을 사용하여 결과를 피팅하고 RBC 8,9를 특징짓는 멱법칙 계수를 얻었습니다.
전반적으로, 개발된 방법론(8,9)에 대한 프로토콜은 아래에 상세히 기술되어 있으며, RBC 표면의 응력 및 변형에 대한 힘 및 변형을 관련시키는 폼 팩터 Ff에 대한 측정값을 사용하여 이전의 불일치를 명확히 하고, 상이한 혈액을 가진 개인으로부터 얻어진 적혈구의 점탄성 파라미터 및 연질 유리질 특징을 정량적으로 결정할 수 있는 새로운 진단 방법으로서 활용될 수 있다 병리학. 아래에 설명된 프로토콜을 사용하는 이러한 특성화는 기계생물학적 관점에서 적혈구의 거동을 이해할 수 있는 새로운 가능성을 열 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>35mm 배양 접시</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>니트 유리</td><td>VD12460Y1A.01 및 VD12432Y1A.01</td><td></td></tr><tr><td>유리 바닥 접시</td><td>MatTek Life Sciences</td><td>P35G-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>포도당</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td></tr> <tr><td>침지 오일</td><td>Nikon</td><td>MXA22165</td><td></td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TE300</td><td></td></tr><tr><td>KaleidaGraph</td><td>Synergy 소프트웨어</td><td>https://www.synergy.com/</td><td></td></tr> <tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>현미경 카메라</td><td>Hamamatsu</td><td>C11440-10C</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer 챔버</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR717805-1EA</td><td></td></tr><tr><td>대물 렌즈</td><td>Nikon</td><td>계획 APO 100X 1.4 NA DIC H; PLAN APO 60x 1.4 NA DIC H 및 Plan APO 10x XXNA PH2</td><td></td></tr><tr><td>광학 테이블</td><td>Thorlabs</td><td>T1020CK</td><td></td></tr><tr><td>OT 레이저</td><td>IPG Photonics</td><td>YLR-5-1064-LP</td><td></td></tr><tr><td>폴리스티렌 마이크로스피어</td><td>Polysciences</td><td>17134-15</td><td></td></tr><tr><td>고무 링</td><td>Forever Seals</td><td>NBR O-Ring</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 그리스</td><td>Dow Corning</td><td>Z273554</td><td></td></tr><tr><td>스테이지 포지셔닝</td><td>PI</td><td>P-545.3R8S</td><td></td></tr><tr><td>피펫</td><td>Gilson</td><td>P1000</td><td></td></tr></tbody></table>

광학 핀셋과 디포커싱 현미경을 사용한 적혈구의 점탄성 특성에 대한 정량적 분석

Quantitative Analysis of Viscoelastic Properties of Red Blood Cells Using Optical Tweezers and Defocusing Microscopy

적혈구의 점탄성 특성은 다양한 기술에 의해 조사되었습니다. 그러나 보고된 실험 데이터는 다양합니다. 이것은 세포의 정상적인 가변성뿐만 아니라 세포 반응의 방법과 모델의 차이에 기인합니다. 여기서, 광학 핀셋 및 디포커싱 현미경을 사용하는 통합 프로토콜은 1 Hz 내지 35 Hz의 주파수 범위에서 적혈구의 유변학적 특징을 얻기 위해 사용된다. 광학 핀셋은 적혈구 복합 탄성 상수를 측정하는 데 사용되지만, 디포커싱 현미경은 복잡한 탄성 상수를 복잡한 전단 계수로 변환할 수 있는 매개변수인 세포 높이 프로파일, 부피 및 폼 팩터를 얻을 수 있습니다. 또한, 부드러운 유리질 유변학 모델을 적용하면 두 모듈리에 대한 스케일링 지수를 얻을 수 있습니다. 개발 된 방법론은 적혈구의 기계적 거동을 탐구하여 여러 생리 학적 및 병리학 적 조건에 대해 잘 정의 된 실험 조건에서 얻은 점탄성 매개 변수를 특성화 할 수 있습니다.

그림 1은 유변학 측정에 사용되는 OT 시스템의 개략도를 나타냅니다. 도 2에는 두 구체 및 대표적인 RBC를 이용한 미세유변학 실험의 개략도가 도시되어 있다. 그림 3은 정현파 운동이 압전 스테이지에 의해 생성될 때의 시간 함수로서 두 구체의 진폭에 대한 일반적인 곡선을 보여줍니다. 기준 구(그림 3 - 빨간색 곡선)는 스테이지 이동에 따라 진동하는 반면, RBC 구(그림 3 - 파란색 곡선)는 다른 진폭과 위상으로 진동합니다. 이러한 파라미터를 측정함으로써, 샘플의 상이한 적혈구에 대한 복소수 탄성 상수 K*(ω)를 결정할 수 있다. 도 4는 손실 탄성 상수 K"</em...

여기에서는 세포의 유변학적 특성을 측정하기 위해 광학 핀셋과 디포커싱 현미경을 기반으로 하는 통합 프로토콜이 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 다양한 생리병리학적 조건에서 적혈구의 점탄성 특성을 연구하는 데 광범위하게 적용할 수 있습니다.

The viscoelastic properties of erythrocytes have been investigated by a range of techniques. However, the reported experimental data vary. This is not ...

이 방법론은 적혈구의 기계적 거동을 탐구하여 여러 생리적 및 병리학 적 조건에 대한 점탄성 매개 변수와 부드러운 유리 기능을 특성화합니다. 당사의 단일 셀 기반 방법은 적혈구 표면의 힘과 변위, 응력 및 긁힘과 관련된 폼 팩터에 대한 금속 값을 사용하여 비디오 참조를 확인합니다. 전체 둘레를 덮는 방식으로 고무 링 표면에 실리콘 그리스를 붓는 것으로 시작합니다.그런 다음 그리스 면이 커버슬립을 향하도록 고무 링을 커버슬립에 놓습니다. 적절한 부착을 위해 5분 동안 기다리면 샘플 홀더가 세포 배양을 받을 준비가 됩니다. 다음으로, 작성된 프로토콜에 따라 미리 준비된 세포 용액을 사용하여 샘플 홀더에 세포를 시드합니다.0.2 마이크로리터의 10 부피% 폴리스티렌 구 용액을 샘플에 첨가한다. 두 번째 커버슬립을 고무 링 위에 놓습니다. 설정을 닫고 샘플 준비를 마칩니다.마지막으로 전체 샘플을 현미경으로 옮깁니다. 실험을 시작하려면 OT 시스템을 사용하고 OT 레이저로 구체를 가둔 다음 셀에 가까운 커버 슬립에 부착합니다. 그런 다음 다른 구를 트랩하고 구를 셀 표면, 상단 표면 근처 및 셀 가장자리 가까이로 눌러 동일한 부착 절차를 반복합니다.진폭과 다양한 주파수의 정현파 함수를 추가합니다. 그런 다음 압전 스테이지를 사용하여 시작 버튼을 눌러 압전 변위를 허용합니다. RBC 구를 트랩에 보관하고 이전에 설정된 정현파 함수를 사용하여 샘플을 이동 주기에 제출합니다.분석을 위해 ImageJ 소프트웨어를 열고 정현파 이동 중에 얻은 전체 동영상을 가져옵니다. adjust(조정)를 클릭한 다음 옵션 임계값(option threshold)을 선택합니다. 두 스크롤 막대로 임계값을 조정하고 파일을 클릭한 다음 사각형을 클릭하여 참조 구를 선택합니다.그런 다음 분석 탭에서 측정 설정"을 클릭하고 질량 중심을 선택합니다." 옵션을 선택합니다. 분석(analyze) 탭을 다시 클릭하고 파티클 분석(analyze particles)을 선택합니다. 질량 중심에 대한 xy 좌표가 있는 테이블이 포함된 새 창이 나타납니다.RBC 표면에 부착된 다른 구에 대해 이 절차를 반복합니다. 분석 소프트웨어를 열고 이전에 얻은 txt 파일을 가져옵니다. 질량 중심이 y축에 있고 시간이 x축에 있는 플롯을 생성합니다.손실 상수에 대한 x축(K 이중 소수로 표시됨)과 저장 상수에 대한 y축(K 소수로 표시됨)을 사용하여 그래프에 결과를 플로팅합니다.

quantitative-analysis-viscoelastic-properties-red-blood-cells-using

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 짧은 DNA 분자의 기계적 성질을 탐험 할 수있는 일정한 힘을 축 광 핀셋의 사용을 보여줍니다. 축 방향으로 DNA를 스트레칭함으로써, 우리는 우리 ~ 100 nm의 짧은으로 DNA 분자를 연구 할 수 있습니다 steric hindrances 및 종래의 측면 조작하여 발생하는 유물을 최소화합니다.

상수 강제 축 방향 광학 족집게로 DNA의 짧은 시퀀스를 스트레칭

이 논문은 원자 힘 현미경 (AFM)을 사용하여 microindentation을 통해 살아있는 세포의 기계적 특성을 특성화 할 수있는 프로토콜을 보여줍니다.

원자 힘 현미경을 사용하여 살아있는 세포의 기계적 특성을 측정

명시야와 미분 간섭 대비 이미지의 조합을 통해 세포 질량, 부피 및 밀도의 정량적 측정을 수행하기 위해 표준 광학 현미경을 사용하는 방법을 설명합니다.

양이 광학 현미경 : 세포 생물 물리학의 측정​​ 표준 광학 현미경과 특징

프로토콜은 화상 처리 기술에 기초하여 상세를 제어하고 일정한 전단 속도 하에서 적혈구 (RBC) 응집체 정량화 실험 방법을 설명했다. 이 프로토콜의 목적은 제어 된 미세 환경에서 대응하는 전단 속도로 RBC 집합체 크기를 관련시키는 것이다.

적혈구 집계 동적 조사를위한 미세 유체 제어 환경

여기 선물이 레드 셀 deformability 및 세포질이 ektacytometry에 의해 측정 하는 기법. 이러한 기술은 붉은 세포 deformability의 일반적인 조사 및 혈액 질병 낫 세포 빈 혈 등 혈액 순환에 견고 하 고 변형 세포의 존재에 의해 특징의 특정 조사에 적용 됩니다.

Deformability 및 Ektacytometry에 의해 혈액이 질 레드 셀 측정

선물이 빛 시트 현미경을 초파리 태아에 구슬 없이 셀 역학을 구현 결합 광학 족집게의 설치.

초파리 배아에 구슬 없는 광학 핀셋으로 셀 역학 조사

여기서 우리는 B 세포에 견인력 현미경 실험을 수행하는 데 사용되는 프로토콜을 제시한다. 우리는 연약한 폴리 아크릴아미드 젤의 준비와 그 기능성, 현미경에서의 데이터 수집 및 데이터 분석의 요약을 설명합니다.

B 림프구 활성화를 연구하는 견인력 현미경 검사법

여기서, 우리는 광학 트랩에 의한 직접 힘 측정을 통해 3차원 감금에서 격리된 배아 제브라피쉬 세포의 세포내 기계적 특성을 조사하는 프로토콜을 제시한다.

광학 핀셋을 사용하여 감금된 세포 전 역학의 직접 힘 측정

프로토콜은 세포외 매트릭스 점성 및 단백질 조성 또는 환경 요인에 대한 의존성 연구를 위한 방법을 설명합니다. 대상 매트릭스 시스템은 마우스 구역입니다. 이 방법의 성능은 야생식 구역 섬유의 점탄성 거동을 미세피브릴 관련 당단백질-1이 부족한 것과 비교하여 입증된다.

구역 섬유의 점탄성 특성을 결정하기 위한 생물학적 제제 및 기계적 기술

미세 유체 챔버를 통해 연구 된 시각적 단일 분자 생화학은 유리 배럴, 기밀 주사기, 튜브와 플로우 셀의 안정적인 연결 및 주사기와 튜브 사이에 스위칭 밸브를 배치하여 기포 제거를 사용하여 크게 촉진됩니다. 이 프로토콜은 DNA 거래 및 분자간 상호 작용의 시각화를 가능하게 하는 이중 광학 트랩을 설명합니다.

단일 분자 연구를 위한 이중 광학 핀셋 및 미세 유체 공학 사용

적출된 적혈구의 단백질 활성화의 동적 변화를 포착하는 것은 추후 평가를 위해 급성 자극에 대한 동적 변화를 보존하는 것과 같은 방법론적 문제를 제기합니다. 제시된 프로토콜은 관련 단백질 변화의 보존 및 분석과 후속 검출을 가능하게 하는 샘플 준비 및 염색 기술을 설명합니다.

적혈구 단백질의 동적 변화에 대한 면역염색 기반 검출

배우세요 광학 핀셋과 디포커싱 현미경을 이용한 적혈구 점탄성 특성 분석 방법을. 이 단일 세포 기반 프로토콜은 생리학적 및 병리학적 조건에서 적혈구의 점성 및 탄성 특성을 정량적으로 측정하여 연구자들이 세포 역학을 심층적으로 이해할 수 있게 합니다.

광학 핀셋과 디포커싱 현미경을 사용한 적혈구의 점탄성 특성에 대한 정량적 분석

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