Name: 마이크로패턴 견인 현미경을 위한 패턴 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: 배우세요 PDMS 스탬프를 이용한 단일 단계 단백질 미크로패턴 제작 방법으로 세포 클러스터 형태를 제어하고 견인력을 측정하는 세포역학 연구에 활용할 수 있습니다.

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저자는 데이터 분석에 대한 유용한 토론과 도움을 주신 Boston University Department of Mechanical Engineering의 Paul Barbone 박사에게 감사드립니다. 이 연구는 NSF 보조금 CMMI-1910401에 의해 지원되었습니다.

<ol><li>Pelham, R. J., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+locomotion+and+focal+adhesions+are+regulated+by+substrate+flexibility%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (25), 13661-13665 (1997).</li>
<li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+cells+feel+and+respond+to+the+stiffness+of+their+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate.</a> Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).</li>
<li>Tambe, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer+stress+microscopy%3A+limitations%2C+artifacts%2C+and+accuracy+of+recovered+intercellular+stresses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses.</a> PLoS One. 8 (2), 55172(2013).</li>
<li>Bhadriraju, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+ROCK+by+RhoA+is+regulated+by+cell+adhesion%2C+shape%2C+and+cytoskeletal+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Activation of ROCK by RhoA is regulated by cell adhesion, shape, and cytoskeletal tension.</a> Experimental Cell Research. 313 (16), 3616-3623 (2007).</li>
<li>Stricker, J., Falzone, T., Gardel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+the+F-actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Mechanics of the F-actin cytoskeleton.</a> Journal of Biomechanics. 43 (1), 9-14 (2010).</li>
<li>Ganz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+forces+exerted+through+N-cadherin+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Traction forces exerted through N-cadherin contacts.</a> Biology of the Cell. 98 (12), 721-730 (2006).</li>
<li>Chopra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+cardiomyocyte+mechanosensing+by+crosstalk+between+integrins+and+hyaluronic+acid+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Reprogramming cardiomyocyte mechanosensing by crosstalk between integrins and hyaluronic acid receptors.</a> Journal of Biomechanics. 45 (5), 824-831 (2012).</li>
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<li>Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+traction+stresses+increase+with+increasing+metastatic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential.</a> PLoS One. 7 (2), 32572(2012).</li>
<li>Lavoie, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disrupting+actin-myosin-actin+connectivity+in+airway+smooth+muscle+as+a+treatment+for+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+American+Thoracic+Society%22%5BJournal%5D)">Disrupting actin-myosin-actin connectivity in airway smooth muscle as a treatment for asthma.</a> Proceedings of the American Thoracic Society. 6 (3), 295-300 (2009).</li>
<li>Kraning-Rush, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+traction+stresses+in+adherent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantifying traction stresses in adherent cells.</a> Methods in Cell Biology. 110, 139-178 (2012).</li>
<li>Halliday, N. L., Tomasek, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+the+extracellular+matrix+influence+fibronectin+fibril+assembly+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of the extracellular matrix influence fibronectin fibril assembly in vitro.</a> Experimental Cell Research. 217 (1), 109-117 (1995).</li>
<li>Harris, A. K., Wild, P., Stopak, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silicone+rubber+substrata%3A+a+new+wrinkle+in+the+study+of+cell+locomotion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Silicone rubber substrata: a new wrinkle in the study of cell locomotion.</a> Science. 208 (4440), 177-179 (1980).</li>
<li>Aratyn-Schaus, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+complaint+matrices+for+quantifying+cellular+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3AJoVE%22%5BJournal%5D)">Preparation of complaint matrices for quantifying cellular contraction.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (46), e2173(2010).</li>
<li>Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stresses+at+the+cell-to-substrate+interface+during+locomotion+of+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).</li>
<li>Sniadecki, N. J., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+silicone+elastomeric+post+arrays+for+measuring+traction+forces+of+adherent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microfabricated silicone elastomeric post arrays for measuring traction forces of adherent cells.</a> Methods in Cell Biology. 83, 313-328 (2007).</li>
<li>Tan, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+lying+on+a+bed+of+microneedles%3A+An+approach+to+isolate+mechanical+force%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (4), 1484-1489 (2003).</li>
<li>Tseng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+micropatterning+method+of+soft+substrates+reveals+that+different+tumorigenic+signals+can+promote+or+reduce+cell+contraction+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels.</a> Lab on a Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).</li>
<li>Polio, S. R., Smith, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+hydrogels+for+simplified+measurement+of+cell+traction+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Patterned hydrogels for simplified measurement of cell traction forces.</a> Methods in Cell Biology. 121, 17-31 (2014).</li>
<li>Polio, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographical+control+of+multiple+cell+adhesion+molecules+for+traction+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Topographical control of multiple cell adhesion molecules for traction force microscopy.</a> Integrative Biology. 6 (3), 357-365 (2014).</li>
<li>Balaban, N. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+and+focal+adhesion+assembly%3A+a+close+relationship+studied+using+elastic+micropatterned+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Force and focal adhesion assembly: a close relationship studied using elastic micropatterned substrates.</a> Nature Cell Biology. 3 (5), 466-472 (2001).</li>
<li>Maloney, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+finite+thickness+and+stiffness+on+cellular+adhesion-induced+deformation+of+compliant+substrata%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review.+E%2C+Statistical%2C+Nonlinear%2C+and+Soft+Matter+Physics%22%5BJournal%5D)">Influence of finite thickness and stiffness on cellular adhesion-induced deformation of compliant substrata.</a> Physical Review. E, Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 78 (1), Pt 1 041923(2008).</li>
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<li>Butler, J. P., Tolić-Nǿrrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+fields%2C+moments%2C+and+strain+energy+that+cells+exert+on+their+surroundings%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).</li>
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</ol>

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

PAA 하이드로젤을 간접적으로 패터닝하는 개선된 방법이 본 논문에 기재되어 있다. 이 접근법은 20,35,36,37,38,39,40,41,42 이전에 사용 된 메소드를 기반으로합니다. 주요 변화는 PDMS 스탬프가 이제 단백질을 제거하고 패턴을 직접 스탬핑하는 대신 중간 기질에 원하는 패턴을 남겨 두는 데 사용된다는 것입니다. 이를 통해 고충실도 마이크로 패턴을 훨씬 더 일관되게 만들고 이전에는...

대부분의 세포 표현형은 환경에 견인력을 발휘합니다. 이러한 견인력은 액틴과 미오신의 네트워크인 세포의 수축성 세포골격, 그리고 다른 필라멘트성 바이오폴리머 및 가교결합 단백질1,2,3,4에 의해 생성된다. 세포 내에서 생성된 힘은 주로 인테그린 및 카데린과 같은 막횡단 단백질을 통해 세포외 환경 또는 인접한 세포로 전달될 수 있으며, 각각 5,6. 세포가 어떻게 퍼지거나 수축하는지, 그리고 그 움직임과 관련된 견인력의 크기는 환경과의 친밀한 대화의 결과이며, 이는 주로 세포외 기질 (ECM)7,8에 존재하는 단백질의 유형과 양 및 ECM의 강성에 달려 있습니다. 실제로, 견인력 현미경 검사는 기질 강성, 부과 된 기계적 스트레스 및 균주 또는 다른 세포와의 접촉과 같은 국소 자극에 대한 세포 반응성을 이해하는 데 귀중한 도구가되었습니다. 이 정보는 암 및 천식 9,10,11,12와 같은 질병의 이해와 직접 관련이 있습니다.
견인력을 계산하기 위해 알려진 재료 특성의 기판의 힘 유도 변형을 측정하는 데 사용할 수있는 시스템이 필요합니다. 이러한 변경 사항은 시간이 지남에 따라 추적되어야 하며 이미징 및 이미지 처리 기술이 모두 필요합니다. 세포 견인력을 결정하는 데 사용 된 첫 번째 방법 중 하나는 세포와 함께 시드 된 콜라겐 하이드로 젤의 수축을 관찰하고 분석하는 것이었지만이 방법은 반 정량적인 13 개에 불과했습니다. 또 다른, 보다 정제된 방법은 실리콘14의 얇은 시트의 변형으로부터 기인하는 힘을 결정함으로써 단일 세포에 의해 가해지는 견인력을 측정하는 것이었다. 나중에보다 정량적 인 측정 기술이 개발되었으며, 이러한 방법은 폴리 아크릴 아미드 (PAA) 12,15,16과 같은 연질 하이드로 젤의 사용을 허용했습니다. 이러한 연질 재료를 사용할 때, 견인력은 하이드로겔에 매립된 랜덤하게 변위된 비드의 힘-유도된 변위 및 겔(16,17)의 기계적 특성으로부터 결정될 수 있었다. 또 다른 발전은 연질 폴리디메틸실록산 (PDMS)으로 만들어진 마이크로 포스트 어레이의 개발과 함께 이루어졌으며, 그래서 그들의 편향이 측정되고 빔 이론(18)을 사용하여 힘으로 변환 될 수있었습니다.
마지막으로, 소프트 하이드로젤을 마이크로패터닝하는 방법은 이러한 접근법이 세포 부착을 위한 접촉 영역의 제어를 허용함에 따라 개발되었다. 세포의 접촉 영역 내에서 마이크로패턴의 변형을 측정함으로써, 무힘 기준 이미지(19)가 요구되지 않기 때문에 견인력을 쉽게 계산할 수 있었다. 이 방법은 세포 견인력(20)의 측정을 위해 PAA 겔 상으로의 미크론 크기의 분리된 형광 단백질 부착 포인트의 규칙적인 어레이의 간접 패터닝을 허용하기 때문에 널리 채택되고 있다. 이러한 힘을 계산하기 위해, 사용자 입력을 요구하지 않고 각 마이크로 패턴화된 점의 움직임을 추적할 수 있는 이미지 처리 알고리즘(21)이 개발되었다.
이 방법은 도트 패턴의 전체 격자를 만드는 데는 간단하지만 도트의 격리 된 패치 (또는 섬) 패턴이 필요한 경우 더 복잡합니다. 마이크로 패턴화 된 섬은 세포 군집의 모양과 어느 정도의 크기 조절이 필요할 때 유용합니다. 이러한 섬을 만들기 위해 앞서 언급한 마이크로 접촉 인쇄 방법은 두 가지 별개의 단계를 필요로 합니다: i) 하나의 PDMS 스탬프를 사용하여 커버슬립에 점들의 고충실도 패턴을 생성한 다음, ii) 두 번째 다른 PDMS 스탬프를 사용하여 대부분의 점들을 제거하여 점들(21)의 고립된 섬들을 남겨 둡니다. 이 독창적 인 방법으로 섬을 만드는 어려움은 프로세스의 첫 번째 단계에서 일관된 그리드 패턴을 만드는 것이 그 자체로 어렵다는 사실에 의해 더욱 복잡해집니다. 마이크로 프린팅 스탬프는 원형 마이크로 포스트 배열로 구성되며, 직경은 원하는 도트 크기에 해당합니다. 그런 다음이 스탬프는 균일 한 단백질 층으로 코팅 된 다음 처리 된 커버 슬립에 정확한 양의 압력으로 스탬프되어 원하는 패턴을 만듭니다. 한편으로 스탬프에 너무 많은 압력을 가하면 기둥 좌굴 또는 기둥 사이의 처짐으로 인해 단백질 전달이 고르지 않고 패턴 충실도가 저하되어 유리와의 접촉이 발생할 수 있습니다. 반면에 너무 적은 압력을 가하면 단백질 전달이 거의 또는 전혀 이루어지지 않고 패턴 충실도가 떨어집니다. 이러한 이유로, 단 한 단계만으로 도트의 고립된 섬들의 고품질 마이크로패턴을 일관되게 생성하는 데 사용될 수 있는 전달 공정이 요구된다.
본원에서, 미크론 크기의 형광 단백질 부착 포인트가 PAA 겔 상으로의 점들의 간접적인 마이크로패터닝에 대해 기술되어 있으며, 이는 이전에 개발된 방법들보다 더 일관되고 다재다능하다. 오래된 간접 마이크로 패터닝 방법은 PDMS 스탬프에서 중간 기질로의 단백질 패턴 전달에 의존하는 반면, 여기에 도입 된 방법은 추가가 아닌 단백질 제거를위한 용기로 PDMS 스탬프를 사용합니다. 이것은 먼저 사용 된 PDMS 스탬프의 구조를 근본적으로 변경함으로써 수행됩니다. 균등하게 이격 된 원형 기둥의 패턴으로 구성된 우표를 만드는 대신,이 방법에서 균등하게 간격을 둔 원형 구멍의 패턴으로 구성됩니다.
이 새로운 구조로, 이러한 PDMS 스탬프의 표면은 이전에 기술된 바와 같이 글루타르알데히드로 처리될 수 있고, 20,29,30, 스탬프가 단백질과 공유적으로 결합할 수 있게 한다. 형광 단백질로 고르게 코팅된 유리 커버슬립에 사용될 때, 이러한 글루타르알데히드 처리된 PDMS 스탬프는 커버슬립의 표면에서 대부분의 단백질을 제거하기 위해 사용되며, 스탬프 상의 미크론 크기의 구멍의 위치에 의해 미리 결정된 원하는 도트 패턴만을 남긴다. 이러한 변화는 거의 연속적인 점 격자로 구성된 패턴을 생성하고 단 한 단계만 통해 격리된 도트 섬을 만드는 성공률을 높입니다.

<table><tbody><tr><td>(3-아미노프로필)트리메톡시실란</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#281778</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>#05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원추형 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>#05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>4 x 4 in 0.060 Quartz LR Chrome Photomask</td><td>Advance Reproductions Corporation</td><td>N/A</td><td>맞춤형 마스크</td></tr><tr><td>6 웰 플레이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>#07-200-83</td><td></td></tr><tr><td>아세톤</td><td>Fisher Scientific</td><td>#A18P-4</td><td></td></tr><tr><td>아크릴아미드 용액, 40%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#A4058</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>#A20000</td><td></td></tr><tr><td>과황산 아미노늄</td><td>Fisher Scientific</td><td>#BP179-25</td><td></td></tr><tr><td>비사크릴아미드</td><td>Fisher Scientific</td><td>#PR-V3141</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>그린필드 글로벌</td><td>#111000200C1GL</td><td></td></tr><tr><td>유리 커버슬립, 25mm 라운드</td><td>Fisher Scientifc</td><td>#12-545-102</td><td></td></tr><tr><td>유리 커버슬립, 30mm 라운드</td><td>워너</td><td>#64-1499</td><td></td></tr><tr><td>하마마츠 ORCA-R2 카메라</td><td>하마마츠</td><td>#C10600-10B</td><td></td></tr><tr><td>인간 플라즈마</td><td>밸리 생물의학</td><td>#HP1051P</td><td>분리에 사용 피브로넥틴</td></tr><tr><td>염산, 1.0 N</td><td>밀리포어 시그마</td><td>#1.09057</td><td></td></tr><tr><td>이미지J</td><td>웨인 래스밴드</td><td>#1.53n</td><td></td></tr><tr><td>교체 가능한 커버슬립 접시 세트</td><td>Bioptechs</td><td>#190310-35</td><td></td></tr><tr><td>Kim Wipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>#06-666-11C</td><td></td></tr><tr><td>마스크 Alinger</td><td>Karl Suss</td><td>#MA6</td><td></td></tr><tr><td>Matlab 2021</td><td>Mathworks</td><td>#R2021a</td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph Basic</td><td>Molecular Devices</td><td>#v7.7.1.0</td><td></td></tr><tr><td>N-하이드록시숙신이미드 에스테르</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#130672-5G</td><td></td></tr><tr><td>NucBlue Live Cell Stain</td><td>Thermo Fisher</td><td>#R37605</td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX2-ZDC 도립 현미경</td><td>Olympus</td><td>#IX81</td><td></td></tr><tr><td>PD-10 탈염 컬럼</td><td>GE Healthcare</td><td>#52-1308-00</td><td></td></tr><tr><td>포토레지스트 스피너 후드</td><td>Headway Research</td><td>#PWM32</td><td></td></tr><tr><td>플라즈마 세정기</td><td>Harrick</td><td>#PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>플라즈마 에칭기</td><td>TePla</td><td>#M4L</td><td></td></tr><tr><td>Prior Lumen 200Pro 광원</td><td>Prior Scientific</td><td>#L200</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 웨이퍼, 100mm</td><td>University Wafer</td><td>#809</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2005</td><td>Kayaku 고급 재료 Inc.</td><td></td><td></td>#NC9463827</tr><tr><td>SU-8 개발자</td><td>Kayaku Advanced Materials Inc.</td><td></td><td></td>#NC9901158</tr><tr><td>Sylgard 184 실리콘 엘라스토머</td><td>Essex Brownell</td><td>#DC-184-1.1</td><td></td></tr><tr><td>테트라메틸에틸렌디아민</td><td>Fisher Scientific</td><td>#BP150-20</td><td></td></tr><tr><td>트리클로로(1H,1H,2H,2H-퍼플루오로옥틸)실란</td><td>시그마 알드리치</td><td>#448931</td><td></td></tr><tr><td>UAPON-40XW340 대물렌즈</td><td>올림푸스</td><td>#N2709300</td><td></td></tr><tr><td>UV 홍수 노출</td><td>Newport</td><td>#69910</td><td></td></tr><tr><td>웨이퍼 캐리어 트레이, 110 x 11 mm</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>#의 19395-40</td><td></td></tr></tbody></table>

마이크로패턴 견인 현미경을 위한 패턴 생성

Pattern Generation for Micropattern Traction Microscopy

마이크로패턴 견인 현미경 검사는 단일 세포 및 세포 클러스터의 모양을 제어할 수 있게 해줍니다. 또한, 마이크로미터 길이 스케일로 패턴화하는 능력은 각 마이크로패턴화된 도트가 부드럽고 근본적인 하이드로겔을 변형시키는 단일 초점 접착의 형성을 허용하기 때문에 견인력의 측정을 위해 이러한 패턴화된 접촉 구역의 사용을 허용한다. 이러한 접근법은 내피 세포, 평활근 세포, 섬유아세포, 혈소판 및 상피 세포를 포함하는 광범위한 세포 유형에 사용되어 왔다. 
이 리뷰는 미리 지정된 크기와 간격의 점들의 규칙적인 배열에서 폴리아크릴아미드 하이드로젤 상에 세포외 매트릭스 단백질을 인쇄할 수 있게 하는 기술의 진화를 설명한다. 마이크로 미터 크기의 패턴은 부드러운 기판에 직접 인쇄하기가 어렵 기 때문에 단단한 유리 커버 슬립에서 패턴이 먼저 생성 된 다음 겔화 중에 패턴을 하이드로 겔로 전달하는 데 사용됩니다. 먼저, 커버슬립 상에 작은 점들의 어레이를 생성하기 위한 원래의 마이크로컨택트 인쇄 접근법이 설명된다. 작은 점의 섬을 떠나기 위해 대부분의 패턴을 제거하는 두 번째 단계는 패턴화 된 점의 배열에서 셀과 셀 클러스터의 모양을 제어해야합니다. 
다음으로, 단일 감산 패터닝 단계를 사용하여 점들의 섬들을 생성할 수 있게 하는 이러한 접근법의 진화가 설명된다. 이 접근법은 사용자를 위해 크게 단순화되었지만 패턴을 만드는 데 필요한 마스터 몰드의 수명이 감소하는 단점이 있습니다. 마지막으로, 변위된 점들의 이미지 분석과 후속 세포 생성 견인 필드의 분석을 위해 개발된 계산 접근법이 설명되고, 이러한 분석 패키지의 업데이트된 버전이 제공된다.

E = 3.6 kPa의 영 모듈러스와 ν = 0.445의 푸아송 비율을 갖는 PAA 하이드로젤은 이러한 감산 마이크로패터닝 방법에 의해 사용하기 위해 제조되었다. 하이드로젤은 두께가 ~100μm로 제작되어 여기에 사용된 이미징 설정으로 이미징할 수 있으며 셀이 젤 아래의 단단한 커버슬립을 감지하는 것을 방지하여 세포 강성 감지23,33에 초점을 맞춘 연구에서 문제를 일으킬 수 있습니다. 다른 많은 강성 수준(최대 30kPa)의 겔은 간접 마이크로패터닝 방법(34)을 사용하여 성공적으로 제조되고 이미징되었으므로, 이 방법은 단지 3.6 kPa 하이드로젤의 사용에만 국한되지 않는다. 커버슬립은 글루타르알데히드로 미리 처리되어 상단 패턴화된 커버슬립을 제거할 때 젤이 하부 커버슬립에 고정된 상태로 유지되도록 합니다(그림...

우리는 소프트 하이드로젤 상의 세포외 매트릭스 단백질의 도트 어레이의 단일 감산 패터닝 단계를 사용한 마이크로접촉 프린팅을 기반으로 세포 견인력을 측정하는 표준 방법에 대한 개선을 설명합니다. 이 방법은 세포 군집 모양을 제어하는 데 필수적인 섬 패턴을보다 간단하고 일관되게 제작할 수 있습니다.

Micropattern traction microscopy allows control of the shape of single cells and cell clusters. Furthermore, the ability to pattern at the micrometer ...

이 프로토콜은 원하는 모양, 특히 세포 클러스터의 연구를위한 패턴의 고립 된 섬의 고충실도 단백질 마이크로 패턴의 일관된 생성을 허용합니다. 이 기술은 한 단계만으로 모든 모양과 크기의 고립 된 섬 마이크로 패턴을 만드는 데 사용할 수 있지만 이전에는 이러한 패턴을 만드는 데 두 개의 별도 단계가 필요했습니다. 먼저 PDMS를 제조자의 지침에 설명된 대로 올바른 경화제 대 염기 비율로 혼합한다.실온에서 15분 동안 가압 인큐베이션하고, 이어서 혼합물을 진공 하에 15분 동안 탈기시킨다. PDMS를 마스터 몰드에 붓고 섭씨 37도까지 설정된 인큐베이터로 옮겨 밤새 경화시킵니다. 인큐베이터에서 마스터 몰드를 제거하고 실온까지 식히십시오.마스터 몰드가 냉각되는 동안 초음파 처리 25 밀리미터 커버슬립을 에탄올에서 10 분 동안 커버 슬립합니다. 준비 중인 스탬프의 수만큼 커버슬립을 사용하십시오. 커버슬립을 DI 물로 완전히 헹구고 여과된 에어건을 사용하여 건조시킵니다.커버슬립을 높은 진공 하에서 플라즈마 클리너를 사용하여 일분 동안 플라즈마로 처리하십시오. 커버 슬립이 챔버 내부로 이동하는 것을 방지하기 위해 처리 후 진공을 천천히 해제하십시오. 각 커버슬립을 직사광선이나 오버헤드 조명이 없는 방에 형광 표지 단백질 용액 100마이크로리터로 코팅합니다.빛으로부터 추가 보호를 위해 샘플을 덮고 실온에서 20 분 동안 배양하십시오. 각 커버슬립을 DI 물로 완전히 헹구십시오. 각 커버슬립의 측면을 종이 타월 또는 유사한 흡수성 물질에 부드럽게 두드려 표면에서 과도한 물을 제거하십시오.커버 슬립을 적어도 30 분 동안 어둠 속에서 덮지 않은 채로 두어 완전히 말리십시오. 단백질 코팅 커버슬립이 건조되는 동안 메스 또는 날카로운 블레이드로 절단하여 마스터 몰드에서 PDMS 스탬프를 제거합니다. PDMS 스탬프를 높은 진공 하에서 두 분 동안 플라즈마로 처리하십시오.흄 후드 아래 뚜껑이있는 용기에 우표를 넣은 다음 각 스탬프를 100 % 에탄올에 희석 된 10 % 3-APTMS의 얇은 층으로 코팅하십시오. 우표로 용기를 덮고 실온에서 다섯 분 동안 배양하십시오. 양쪽의 각 스탬프를 DI 물로 철저히 헹구십시오.우표를 깨끗한 용기에 넣고 DI 물에서 준비한 2.5 % 글루타르 알데히드로 코팅하십시오. 우표를 덮고 실온에서 30 분 동안 배양하십시오. DI 물로 스탬프를 완전히 헹구십시오.앞서 설명한 것처럼 표면에서 과도한 물을 제거하고 스탬프가 30 분 동안 덮이지 않고 건조되도록하십시오. 30분 후에 단백질이 코팅된 커버슬립이나 스탬프가 완전히 건조되지 않으면 여과된 에어건을 사용하여 완전히 건조시킵니다. 스탬프의 패턴 측면을 커버슬립에 밀어 넣어 완전히 접촉할 수 있도록 충분한 압력을 가합니다.15 분 동안 방해받지 않고 그대로 두십시오. 그런 다음 PDMS 스탬프를 커버 슬립에서 조심스럽게 벗겨냅니다. 적절한 필터와 함께 형광 현미경을 사용하여 패턴화된 커버슬립의 충실도를 확인합니다.패턴화된 커버슬립을 즉시 사용하거나 나중에 사용할 때까지 직사광선으로부터 멀리 떨어뜨려 보관하십시오. PAA 하이드로겔 전구체를 제조하기 전에, 개방되기 전에 실온에 도달하도록 냉장고로부터 아크릴산 NHS 에스테르를 제거한다. 70 % 에탄올로 멸균하여 교환 가능한 커버슬립 접시 세트를 준비한 다음 사용 전에 적어도 30 분 동안 생물 안전 캐비닛에서 자외선 하에서 배양하십시오.흄 후드 아래에서 DI 물에서 준비된 40 % 아크릴 아미드 1.25 밀리리터를 15 밀리리터 원뿔형 튜브에 첨가하십시오. 동일한 튜브에 DI 물에서 준비된 비스 아크릴 아미드 용액 175 마이크로 리터를 첨가하십시오. 그런 다음 500 마이크로 리터의 10X PBS를 넣은 다음 2.915 밀리리터의 DI 물을 첨가하십시오.이 전구체의 피펫 969 마이크로리터를 1.5 밀리리터 마이크로원심분리 튜브에 넣고 나머지는 섭씨 4도에서 최대 2주 동안 보관한다. 신선한 마이크로 원심분리 튜브에서 50 ~ 100 밀리그램의 APS를 측정하고 DI 물에서 밀리리터 당 100 밀리그램으로 희석하십시오. 후드에서 NHS 에스테르를 열고 마이크로 원심 분리 튜브에서 최대 세 밀리그램의 NHS를 조심스럽게 측정하십시오.NHS 에스테르를 1X PBS에서 밀리리터 당 1 밀리그램으로 희석하십시오. 흄 후드 아래에서, 두 마이크로리터의 TEMED를 PAA 전구체의 969 마이크로리터 분취량을 함유하는 마이크로원심분리 튜브에 첨가한다. 1 몰 HCL의 15 마이크로리터를 첨가하여 하이드로겔 용액의 pH를 감소시키고 NHS 에스테르의 가수분해를 피한다.NHS 에스테르 용액 10 마이크로리터를 튜브에 첨가한다. 생물 안전 캐비닛에서 다음 단계를 수행하십시오. 30mm 커버슬립을 3-APTMS와 글루타르알데히드 처리면이 있는 커버슬립 접시 세트의 중간 부분에 조심스럽게 놓고 플라스틱 링을 위에 조이십시오.최소 광 노출로 패턴화된 커버슬립을 설정하여 다음 단계를 준비합니다. 다섯 마이크로리터의 APS 용액을 PAA 전구체 분취량 튜브에 피펫한 다음, 반전시키고 혼합한다. 즉시이 용액 35 마이크로 리터를 30 밀리미터 커버 슬립에 피펫하십시오.패턴화 된 커버 슬립을 단백질 쪽을 아래로 내려 놓은 용액에 놓습니다. 하이드로젤에 기포가 생기지 않도록 주의하십시오. 하이드로 겔을 빛으로부터 보호하고 90 분 동안 중합 할 수 있도록하십시오.하이드로겔이 중합되면 면도날이나 메스를 사용하여 상부 커버슬립을 제거하고, 커버슬립이 겔 표면의 패턴을 망치지 않도록 한 번 제거한 후 겔에서 떨어지거나 미끄러지지 않도록 하십시오. 하이드로겔 내에 남아있는 NHS 에스테르를 부동태화시키기 위해, 두 밀리리터의 멸균 PBS를 겔에 첨가하고, 섭씨 37도에서 45분 동안 인큐베이션한다. 즉시 실험을 위해 겔을 준비하거나 추가 사용 시까지 섭씨 네 도의 멸균 PBS에 밤새 보관한다.하이드로젤은 형광 피브로넥틴으로 간접적으로 패터닝되어 클러스터 내의 세포 견인력을 시각화하고 측정하고 미리 결정된 크기와 모양의 섬 패턴을 만들었습니다. 패턴 품질은 PDMS 스탬프가 주조 된 마스터 몰드의 충실도와 직접 관련이있었습니다. 이 방법은 미리 결정된 모양의 고립되고 잘 정의 된 섬 패턴을 제조 할 수 있습니다.피브로넥틴 부착 도트는 섬의 원하는 영역 내에서만 존재하였다. 접착 점의 이러한 고립 된 섬은 클러스터 모양을 더 잘 제어 할 수있었습니다. 두 개의 작은 3-APTMS로 PDMS 스탬프를 코팅하는 것은 제거 방법의 효과를 제한하지만 너무 많으면 스탬프 표면에 주황색 잔류 물이 생성되기 때문에 중요합니다.여기서 만들어진 패턴은 개별 세포와 클러스터 모두에서 세포 견인력을 결정하는 데 사용할 수 있으며, 이는 기계적 항상성을 유지하는 능력에 대한 통찰력을 제공합니다.

pattern-generation-for-micropattern-traction-microscopy

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

골드에 긴 사슬 alkane thiols의 형성에서 자기 조립 monolayers은 (샘스) 단백질 패턴 및 셀 감금의 형성을위한 잘 정의된 기판을 제공합니다. 와 backfilling 다음 polydimethylsiloxane (PDMS) 스탬프를 사용하여 hexadecanethiol의 Microcontact 인쇄 글리콜 - 종료 alkane thiol 모노머는 스탬프 hexadecanethiol 지역에 단백질과 세포 adsorb 패턴을 생산하고 있습니다.

단백질과 세포 교도소에 대한 2 차원 문양의 기판 만들기

micropunching 리소그래피 방식이 생성하는 마이크로와 submicron 패턴 위, 측벽 및 폴리머 기판의 바닥 표면을 개발하고 있습니다. 그것은 patterning이 폴리머를 실시하고 측벽 패턴을 생성하는 장애물을 극복. 이 방법은 여러 기능의 신속한 제조가 가능하며 적극적인 화학 무료입니다.

마이크로 및 Submicron 패턴 폴리머 기판을 생성하기위한 리소그래피를 Micropunching

이 비디오는 세포 표현형 사양을 연구하기 위한 마이크로패턴 기질의 준비에 대해 설명합니다. 단백질 코팅된 마이크로패턴 PDMS 스탬프는 PDMS 코팅된 커버슬립에서 마이크로패턴을 전송하는 데 사용됩니다. 그런 다음 커버슬립을 계면활성제로 처리하여 원치 않는 표면에서 세포 부착을 방지합니다. 그런 다음 세포를 추가하여 패턴에 정착시키고 추가 분석을 위해 배양합니다.

Schwann 세포 표현형 연구를 위한 마이크로패턴 기질의 준비

이 원고는 단방향 스트레칭을 사용하여 부착 세포 나 조직에 힘을 적용하거나 해제하는 방법을 제시한다.

PDMS 막에 마이크로 패턴 세포를 스트레칭

이 프로토콜은 참조가 없는 견인력 현미경으로 사용하기 위해 폴리(에틸렌 글리콜) 기반 하이드로겔에 내장된 형광 선한 마커의 3차원 배열을 제작하기 위해 다광자 리소그래피를 구현하기 위한 지침을 제공합니다. 플랫폼. 이 지침을 사용하여 3D 재료 변형률 측정 및 셀룰러 견인 계산이 단순화되어 고처리량 견인력 측정을 촉진합니다.

레퍼런스 프리 견인력 현미경 플랫폼 제작 및 구현

개발에 집단 세포 이동, 상처 치유, 그리고 암 전이 종종 성장 인자 또는 신호 분자의 그라데이션에 의해 유도. 여기에 설명된 견인 현미경과 미세 유체 시스템을 결합한 실험 시스템과 생화학 구이도하에서 집단 이동의 역학을 정량화하는 방법에 대한 데모입니다.

화학적 집단 이동을 위한 미세 유체와 통합된 견인 현미경 검사법

여기에 제시된 프로토콜은 포유류 세포 내의 세포골격 구조를 연구하기 위하여 세포 모양을 표준화하는 micro패턴의 자동화된 제조를 가능하게 합니다. 이 사용자 친화적 인 기술은 시판되는 이미징 시스템으로 설정할 수 있으며 표준 세포 생물학 실험실에 접근 할 수없는 특수 장비를 필요로하지 않습니다.

적외선 레이저 보조 마이크로패터닝을 통한 세포 지오메트리 제어

이 프로토콜의 목표는 극저온 전자 현미경 검사법을 위한 그리드의 표적 영역에 세포 접착 및 성장을 지시하는 것입니다. 이는 세포 종자 전에 패턴화된 영역에서 세포외 매트릭스 단백질의 증착에 따라 사용자 지정 패턴에서 절제되는 항 파울링 층을 적용함으로써 달성된다.

전세포 극저온-전자 단층 촬영 워크플로우 내의 직접 세포 위치지정에 마이크로패턴 전송 전자 현미경 검사기 그리드

거의 UV 리소그래피 및 견인력 현미경 검사법은 마이크로패턴 하이드로겔의 세포력을 측정하기 위해 결합됩니다. 단일 셀의 표적 광 유도 방출은 동일한 샘플에서 많은 수의 측정을 가능하게 합니다.

견인력 현미경 검사법의 응용을 위한 하이드로겔 패터닝 기술을 사용하여 세포 접착 제어

우리는 미세 유체 플랫폼에서 모세혈관 보조 어셈블리를 사용하여 박테리아 및 콜로이드와 같은 액체에 매달려있는 미세 크기의 물체를 폴리디메틸실록산 기판에 규정 된 배열로 패턴화하는 기술을 제시합니다.

순차모세혈관 보조 어셈블리를 통한 미생물 및 미생물 입자의 패터닝

전통적으로, 세포 배양은 생체 내에서 세포의 자연 환경을 잘 모방하지 못하는 평면 기질에서 수행됩니다. 여기서 우리는 생리적으로 관련된 곡선 기하학과 미세 패턴화 된 세포 외 단백질을 가진 세포 배양 기질을 생산하는 방법을 설명하여 이러한 세포 외 단서의 세포 감지에 대한 체계적인 조사를 가능하게합니다.

삼차원 세포 배양 기질의 UV-광패터닝에 의한 다큐 세포 미세환경 생성

배우세요 PDMS 스탬프를 이용한 단일 단계 단백질 미크로패턴 제작 방법으로 세포 클러스터 형태를 제어하고 견인력을 측정하는 세포역학 연구에 활용할 수 있습니다.

마이크로패턴 견인 현미경을 위한 패턴 생성

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