Name: 간단한 생물 분석법에 의한 바다 아네몬의 조추출물에서 용혈성 및 포스포리파아제 활성의 확인 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 12 s
Description: 배우세요 바다 아네모네 조추출물에서 용혈성 및 포스포리파아제 활성을 확인하는 생물 분석법을. 효율적인 추출과 독소 식별을 위한 재현 가능한 프로토콜을 통해 신경과학 및 독성학 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 작품은 Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT)에 의해 지원되었으며, 보조금 번호 IT200819가 있습니다. 저자는이 원고의 영어 문법을 확인하기 위해 Tom Musselman, Rock Paper Editing, LLC에게 인정합니다. Samanta Jiménez (CICESE, Ensenada)와 Juan Manuel Barbosa Castillo (Instituto de Fisiología Celular, UNAM)의 기술 지원. 우리는 또한 양의 피를 얻은 Augusto César Lizarazo Chaparro (CEPIPSA) 박사에게 감사드립니다. 우리는 특히 ICAT-UNAM의 José Saniger Blesa박사에게 비디오 녹화를 위한 실험실의 시설에 대해 감사드립니다.

바다 말미잘은 멕시코 연방 정부의 양식, 수산 및 식품에 대한 국가위원회의 지침에 따라 수집되었습니다 (허가 번호 PPF / DGOPTA 07332.250810.4060). 멕시코 국립 자치 대학 생명 공학 연구소의 생명 윤리위원회는 바다 말미잘을 이용한 모든 실험을 승인했습니다. 양 혈액 샘플은 동물 생산 및 건강 실무 교육 및 연구 센터 (CEPIPSA, 멕시코 국립 자치 대학)에서 구입했습니다.
1. 유기체 수집
<ol><li>바다 말미잘을 수집 A. dowii. 참고: 여기에서, 유기체는 멕시코주 캘리포니아주 엔세나다 바하 해안의 조간대 지역에서 썰물 기간 동안 수집되었다(그림 1A,B).</li>
	<li>생물을 바닷물이 있는 용기에 있는 실험실로 운반합니다(그림 1C).</li>
	<li>실험실에서는 손으로 증류수로 유기체를 청소하여 신체에 부착되는 큰 기질 입자를 제거하십시오.</li>
	<li>유기체를 즉시 -80°C에서 72시간 동안 울트라 냉동고에서 동결시킨다.</li>
	<li>생물을 동결 건조를위한 특수 안경에 넣고 동결 건조 조건을 -20 °C, 0.015 psi, 48 시간 동안 두십시오.</li>
	<li>동결건조된 유기체를 사용 전까지 -20°C에서 보관한다.</li>
</ol>2. 조직 수분 공급
<ol><li>동결건조된 유기체의 건조 중량 20g을 50mM 인산나트륨 완충액 60mL(1/3w/v), pH 7.5 및 1억제제 칵테일 정제(표 of Materials)로 재구성한다.</li>
	<li>자기 교반기에서, 샘플을 ∼800 rpm, 4°C, 12 h 동안 연속적으로 교반한다.</li>
</ol>3. 독소 방출
<ol><li>세포 용해 및 선충류 배출을 유도하기 위해, 샘플을 -20°C에서 12시간 동안 동결시킨 다음, 용기를 90%까지 해동될 때까지 실온(RT)의 물에 넣는다. 이 절차를 세 번 반복하십시오. 참고: 샘플은 100% 해동하지 않습니다. 단백질 분해를 방지하기 위해 샘플을 ~ 4 °C로 유지하는 것이 중요합니다.</li>
	<li>공초점 현미경으로 배출 된 선충류를 관찰하십시오. 10 μL의 샘플을 슬라이드에 가져 와서 그 위에 커버 슬립을 놓습니다. 공초점 현미경으로 100x 및 60x 배율로 관찰하십시오. 여기에는 염료가 필요하지 않았습니다.</li>
	<li>ImageJ 소프트웨어(버전 1.53c, Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA, https://imagej.nih.gov/ij)에서 공초점 현미경으로 캡처한 이미지를 처리합니다.</li>
	<li>선충 낭종 내부의 세뇨관이 풀리고 밖에 있으면 선충류가 배출됩니다. 그런 다음 다음 단계를 계속하십시오. 그렇지 않으면 동결 - 해동 사이클을 한 번만 더 수행하십시오.</li>
	<li>추출물을 명확히 하기 위해, 샘플을 25,400 x g 에서 40분 동안, 4°C에서 원심분리하고, 상층액을 회수하고, 이를 다시 원심분리한다. 이 단계를 3-4 번 반복하십시오.</li>
	<li>상청액을 회수하고 펠렛을 버린다. 상청액 또는 조 추출물은 독 성분(독소) 및 다른 세포 분자, 예컨대 지질, 탄수화물 및 핵산을 함유한다.</li>
</ol>4. 총 단백질의 정량
<ol><li>상용 브래드포드 비색 분석15 키트를 사용하여 조 추출물의 단백질 농도를 결정한다 (표 of Materials).</li>
	<li>염료 시약 (염료의 한 부분을 증류수의 네 부분으로 희석)을 희석하십시오.</li>
	<li>소 혈청 알부민 (BSA) 분획 V (물질 표) 용액을 인산염 완충액 (50 mM 인산나트륨, pH 7.5)에서 1 mg / mL 농도로 준비하십시오.</li>
	<li>표 1에 열거된 용액을 삼중으로 준비한다.</li>
	<li>각 용액을 4 초 동안 쉐이커에 격렬하게 혼합하십시오.</li>
	<li>샘플을 흔들지 않고 RT에서 5분 동안 인큐베이션한다.</li>
	<li>595 nm에서 흡광도(AU)를 측정합니다.</li>
	<li>시료의 평균인 BSA 흡광도(AU 대 단백질 농도)를 플로팅하고, 그래프의 방정식을 결정한다(수학식 1). <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63630/63630eq01.jpg" style="margin: auto;">     수학식 1 여기서 y는 흡광도, m은 선의 기울기, x는 단백질 농도, b는 y-절편입니다. 조 추출물 농도를 계산하려면 x에 대해 다음과 같이 해결하십시오. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63630/63630eq02.jpg" style="margin: auto;">     수학식 2
</li>
</ol>5. 폴리펩티드 독의 복잡성 결정
<ol><li>설명서에 따라 수직 겔 전기 영동을위한 유리 용기를 조립하십시오.</li>
	<li>아크릴아미드 믹스 (30%)를 준비한다: 아크릴아미드 29.2 g, 비스아크릴아미드 0.8 g, 최종 부피 100 mL. 용액을 0.45 μm 멤브레인을 사용하여 여과한다. 용액을 4°C의 어두운 병에 보관한다. 이어서, 용해성 겔을 위한 혼합물을 준비한다(표 2).</li>
	<li>SDS-PAGE 젤은 분해능 겔과 스태킹 젤로 구성됩니다. 표 2에 정의된 용액 부피에 따라 겔을 준비한다. 준비 동안, 중합 시간을 감소시키기 위해 각각의 혼합을 4°C에서 유지하도록 보장한다. 참고 : 각 혼합물의 부피는 사용 된 장비의 브랜드에 따라 다릅니다. 이 프로토콜에 대해, 부피는 수직 전기영동 챔버에 대한 0.75 mm 두께의 15% 아크릴아미드 겔의 제조에 상응한다(표 재료).</li>
	<li>아크릴 아미드가 중합 된 후, ∼10 분, 스태킹 겔의 혼합물을 첨가한다.</li>
	<li>스태킹 겔을위한 혼합물을 준비하고 즉시 유리 판에 넣고 빗을 배치하여 샘플을로드하기위한 웰을 형성하십시오.</li>
	<li>스태킹 겔이 중합되면 (~ 15 분), 빗을 제거하고 유리 용기를 수직 전기 영동을위한 챔버에 놓습니다.</li>
	<li>200 mL의 전극 완충액(0.25 M 트리스, 0.192 M 글리신, 0.1% SDS)을 전기영동 챔버에 넣는다.</li>
	<li>조추출물 분석: 조추출물 30μg을 단백질 로딩 완충액 5μL(25% 글리세롤, 15% 도데실 설페이트 나트륨, 25% 2-메르캅토에탄올, 0.125mM 트리스 pH 7, 브로모페놀 블루 0.1mg/mL)와 혼합하여 단백질을 변성시킵니다. 최종 부피는 &lt;50 μL이어야 한다.</li>
	<li>90°C에서 5분 동안 가열하고, 냉각하고, 1,400 x g에서 3초 동안 원심분리한다.</li>
	<li>샘플을 스태킹 젤의 웰에로드하십시오. 표준 분자량 사다리를 로드합니다.</li>
	<li>1 h 30 분 동안 25 mA 상수에서 전기영동을 실행한다.</li>
	<li>전기영동 챔버로부터 유리 용기를 제거하여 겔 단백질의 염색을 진행한다.</li>
</ol>6. 단백질 염색
<ol><li>겔을 증류수 50 mL에 헹구어 완충 전극으로부터 이물질을 제거한다.</li>
	<li>물을 버리십시오.</li>
	<li>겔 단백질의 확산을 피하려면 고정 용액 (에탄올 60 mL, 아세트산 20 mL, 증류수 20 mL, 최종 부피 100 mL)을 첨가하십시오. RT에서 40분 동안 인큐베이션하고 80 rpm에서 진탕한다. 해결책을 데칸트하십시오.</li>
	<li>단백질 가교 용액(에탄올 15 mL, 글루타르알데히드 0.25 mL, 증류수 50 mL, 최종 부피 65.25 mL)을 첨가하고, 80 rpm에서 진탕하면서 RT에서 30분 동안 인큐베이션한다. 솔루션을 제거합니다.</li>
	<li>겔을 증류수 100 mL로 5분 동안 세척하고, 물을 제거하였다. 이 절차를 네 번 반복하십시오.</li>
	<li>쿠마시 브릴리언트 블루 R-250 여과액 50 mL(40% 메탄올, 10% 아세트산, 50% 증류수, 0.1% 염료, 최종 부피 100mL)로 단백질 염색을 수행하고, RT의 실험실 회전 발진기에서 60rpm으로 15분 동안 교반한다.</li>
	<li>다른 젤을 염색하는 데 사용할 수있는 용액을 회수하십시오.</li>
	<li>과도한 염료를 제거하려면 탈지 용액 (메탄올 40 mL, 아세트산 10 mL, 증류수 50 mL)을 첨가하십시오. 밴드(염색된 단백질)가 시각화될 때까지 RT에서 교반(80rpm)을 유지하십시오.</li>
	<li>젤을 증류수 50mL에 보관하고 Gel 문서화 시스템에서 이미지를 스캔합니다.</li>
</ol>7. 적혈구 용액 준비
<ol><li>양의 경정맥에서 1 mL의 혈액을 추출하십시오.</li>
	<li>주사기에서 바늘을 제거하고 즉시 50 mL의 Alsever 용액 (항응고제로서 0.002 M 시트르산, 0.07 M NaCl, 0.1 M 덱스트로스 및 0.027 M 시트르산 나트륨)이있는 튜브로 혈액을 배출하십시오.</li>
	<li>천천히 용액을 세 번 뒤집습니다.</li>
	<li>실험실로 옮기기 위해 4 °C에서 유지하십시오.</li>
	<li>4°C에서 5분 동안 804 x g 에서 원심분리하고 상층액을 버린다.</li>
	<li>펠렛을 30 mL의 Alsever 용액에 재현탁시킨다. 튜브의 내벽을 따라 용액을 밀어 넣고 파스퇴르 플라스틱 피펫을 사용하여 천천히 세포를 재현탁하십시오. 다시 804 x g 에서 5분 동안, 4°C에서 원심분리한다. 상청액이 명확해질 때까지이 과정을 반복하십시오.</li>
	<li>알세버 용액 15 mL를 첨가하는 단계; 파스퇴르 플라스틱 피펫으로 펠렛을 천천히 재현탁하십시오.</li>
	<li>Alsever 용액의 최종 부피를 유지하여 대략 2 x 106 cells/mL의 농도를 달성하십시오. 그런 다음 Neubauer 챔버 또는 혈구 측정기를 사용하여 세포를 계수하십시오. 참고: 혈소세포계 슬라이드의 적혈구를 세십시오 (Neubauer 개선). 슬라이드는 30mm x 70mm x 4mm 슬라이드입니다. 중앙에는 두 개의 은색 풋플레이트(그림 2A)(위쪽 격자 하나와 아래쪽 격자 하나), 각각 3mm x 3mm, 그리드 측면에 두 개의 채널이 있습니다. 셀 계수는 모서리와 가운데 사각형에 있습니다(그림 2B의 빨간색 사각형). 계수를위한 세포의 최적 농도는 10 6 세포의 순서가되어야합니다. 중앙 박스의 표면적은 0.1cm2이며, 이는 0.0001mL에 해당한다.</li>
	<li>슬라이드 위에 커버슬립을 놓습니다.</li>
	<li>샘플 10 μL를 슬라이드와 커버슬립 사이에 놓고 샘플이 지급될 때까지 기다립니다.</li>
	<li>광학 현미경 (배율 60x)에서 첫 번째 사각형 상자에서 카운트를 수행하십시오. 가운데 격자선에 있는 셀과 상자의 위쪽 또는 왼쪽 여백에 닿는 셀만 계산합니다.</li>
	<li>다음 방정식을 사용하여 세포 농도를 결정합니다. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63630/63630eq03v4.jpg" style="margin: auto;">수학식 3 샘플이 매우 농축되고 희석이 필요한 경우 다음 방정식을 사용하십시오. <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/63630/63630eq04v3.jpg" style="margin: auto;">수학식 4 참고 : 용혈 테스트를 위해 적혈구 용액을 복용 할 때 플라스틱 파스퇴르 피펫으로 용액을 천천히 균질화하십시오.</li>
	<li>오류를 줄이기 위해 세 배의 단계를 수행하십시오.</li>
</ol>8. 용혈 분석
<ol><li>표 3에 표시된 용액 혼합물(삼중)을 원뿔형 96-웰 플레이트에서 준비한다. 참고: 적혈구를 천천히 혼합하여 균질한 현탁액을 유지하십시오.</li>
	<li>진탕 없이 37°C에서 1시간 동안 인큐베이션한다.</li>
	<li>플레이트를 4°C에서 5분 동안 804 x g 에서 원심분리한다.</li>
	<li>평평한 바닥을 가진 다른 96-웰 플레이트에서 상청액을 회수하십시오.</li>
	<li>조 추출물에 세포 분해신이 포함되어 있으면 적혈구가 용해되어 헤모글로빈을 방출합니다. 415nm에서 흡광도를 읽습니다.</li>
	<li>다음 방정식을 사용하여 용혈 백분율을 계산합니다. % 용혈 = ((조추출물-AAlsever 완충액)/(AH2O-AAlsever)) x 100 참고: 조추출물, AAlsever 완충액 및AH2O는 각각 조추출물을 사용한 적혈구의 흡광도, 알세버 용액의 흡광도 및 증류수의 흡광도에 해당합니다.</li>
	<li>조추출물로부터 총 단백질 50 μg으로 각각의 동결 및 해동 주기 전후에 용혈 시험을 수행한다.</li>
	<li>100% 용혈 활동에 도달하는 데 필요한 동결 및 해동 주기의 수를 결정합니다.</li>
	<li>적혈구의 50%에서 용혈을 생성하는 추출물의 양을 계산한다(HU50); 표 3에 기재된 동일한 프로토콜에 따라, 바다 말미네 조추출물의 양을 증가시키고, 적절한 소프트웨어(예를 들어, 기원, 재료 표)를 사용하여 시그모이드 조정으로 플롯을 설계한다.</li>
</ol>9. 포스포리파아제 분석
<ol><li>닭고기 달걀 1개를 증류수에 1% SDS로 씻으십시오.</li>
	<li>멸균 조건에서 달걀 노른자와 달걀 흰자를 분리하십시오.</li>
	<li>50 mL의 0.86% NaCl 용액을 준비하고, 0.22 μm 필터를 통해 여과한다. 그런 다음 용액 A를 준비하십시오 : 달걀 노른자 12 mL와 0.86 % NaCl 용액 36 mL를 첨가하십시오.</li>
	<li>용액 B를 준비하십시오: 50 mL의 완충액 (50 mM 트리스, pH 7.5)에 아가로스 300 mg을 혼합하고, 0.22 μm 필터를 통해 여과한다. 끓을 때까지 전자 레인지에서 용액을 가열하십시오. 따뜻한 물에서 식혀 43-45 ° C에 도달하십시오.</li>
	<li>용액 C 준비: 10 mM CaCl2를 준비하고0.22 μm 필터로 여과한다.</li>
	<li>용액 D를 준비하십시오 : 증류수 1mL에 로다민 6G 10mg을 준비하십시오.</li>
	<li>멸균 조건(층류 후드)에서 용액 A 및 C 500μL를 용액 B와 용액 D 100μL에 넣고 혼합한 다음 25mL를 각 페트리 접시(90 x 15mm)에 붓습니다.</li>
	<li>용액이 멸균 조건 (30 분) 하에서 응고될 때까지 기다리십시오.</li>
	<li>얇은 튜브로 우물 (~ 2-3mm 직경)을 만드십시오.</li>
	<li>한 웰에 총 20 μL의 인산염 완충액 (음성 대조군)을 첨가하고 20 μL의 결정된 포스포리파아제 (양성 대조군)를 다른 웰에 첨가한다.</li>
	<li>상이한 양의 조추출물 단백질, 5, 15, 25, 35, 45 μg을 나머지 웰에 넣고, 각각 20 μL의 최종 부피로 둔다.</li>
	<li>한천이 모든 샘플을 흡착 할 때까지 기다리십시오 (30 분).</li>
	<li>37°C에서 20시간 동안 인큐베이션한다.</li>
	<li>후광이 우물 주위에 형성되면, 이것은 포스포리파아제 활성을 나타낸다. 버니어 캘리퍼로 형성된 후광을 측정하십시오. 참고: 실험을 세 배로 수행합니다(9.1-9.14의 단계).</li>
</ol>

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</ol>

저자들은 이 논문의 출판과 관련하여 경쟁적인 이해관계가 없다고 선언한다.

과학 및 산업의 다른 분야에서 응용 프로그램과 새로운 화합물에 대한 높은 수요는 독의 연구로 이어졌다. Venom은 새로운 분자 도구를 생성하기위한 주형 역할을하는 풍부한 분자 공급원을 나타냅니다. 그러나 이러한 독의 복잡성은 그것들을 얻고 연구하기 위해 다양한 방법의 구현과 조합을 필요로합니다.
여기에서, 우리는 동결건조된 표본으로 시작하여 다른 바다 말미잘의 독을 탐구하는 데 사용할 수 있는 바다 말미잘인 Anthopleura dowii, Verrill 1869의 독을 획득하고 분석하는 방법을 보여주고, 그 다음 조추출물 obtention. 동결건조 단계는 실험의 필요에 따라 사용될 때까지 그리고 샘플의 일부가 사용될 때까지 유기체를 보존하여 유기체의 효율적인 적용을 허용하고, 많은 수의 수집을 피하고, 단백질 안정성을 유지할 수있게했습니다 7,16. 신선...

해양 동물은 생물학적 활성 화합물의 풍부한 공급원입니다. 최근 수십 년 동안, 바다 말미잘독의 조성은 용혈성, 세포독성, 효소적(포스포리파제, 프로테아제, 키티나제) 및 단백질 분해 활성에 대한 신경독성 활성 및 억제 효과를 갖는 다양한 폴리펩티드를 포함하기 때문에 과학적인 관심을 끌었다1. 또한, 이들 폴리펩티드는 생명공학 및 치료적 용도2,3에서 분자 도구의 개발을 위한 잠재적 공급원이다.
바다 말미잘독과 그 분자 성분에 대한 보고는 거의 없는데, 이는 독을 얻는 복잡성, 심지어 독소의 분리 및 특성화로 인한 것이다. 보고서에 사용 된 추출 방법은 독 생산과 관련이 있고 관련이없는 세포의 내용물을 용해시키고 비우는 것을 포함했습니다1.
모든 cnidarians의 특별한 특징은 단일 해부학 적 영역에 집중 된 독의 생산 및 방출을위한 시스템이 없다는 것입니다. 대신, 선충류는 독 4,5를 유지하는 구조입니다. 표피선 세포라고 불리는 다른 유형의 세포도 독소를 분비하며 바다 말미잘6의 몸 전체에 분포합니다.
독을 얻는 데있어 첫 번째이자 가장 중요한 도전은 불안정한 단백질의 불활성화 또는 분해없이 후속 과정에서 충분한 조작을 가진 추출물을 생성하는 것입니다. 다음에, 세포는 용해되어야 하고, 성분-이 경우, 폴리펩티드는 효율적이고 신속하게 추출되어야 하며, 단백질 분해 및 가수분해를 피하면서 다른 세포 성분(7)을 제거해야 한다.
바다 말미잘의 조추출물을 얻기 위해 상이한 방법이 사용된다; 일부는 유기체를 희생시키는 것을 포함하고 다른 일부는 유기체가 살아 있도록 허용합니다. 유기체의 전신의 사용을 암시하는 방법은 독9의 일부 구성 요소 만 추출하는 유기체를 살아 있게 유지하는 방법과 비교하여 독8에서 대부분의 독소를 방출 할 수 있습니다. 추출물의 제조는 생체내 또는 시험관내 방법(10)에 의해 약리학적 효과를 관찰하기 위한 전략을 포함하는 특정 생물검정을 통해 관심있는 물질의 존재 및 효능을 평가하는 것을 필요로 한다.
바다 말미네 독은 세포용해성 폴리펩티드, 기공형성 독소(PFTs)11, 및 포스포리파아제12를 함유하고; 이들 분자는 단백질-지질 상호작용, 암 치료의 분자 도구 및 나노기공3에 기초한 바이오센서 연구의 모델이다. 바다 말미네 PFTs의 분류는 5 kDa 내지 80 kDa의 크기 또는 분자량에 따라 수행된다. 가장 많이 연구되고 악티노포린11로 알려진 20kDa PFT는 항암, 항균 및 나노 기공 기반 바이오 센서와 같은 가능한 응용을위한 분자 도구 개발에서 생물 의학적 잠재력에 특히 관심이 있습니다. 포스포리파아제, 구체적으로는 포스포리파제 A2(PLA2)13을 포함하는 또 다른 시톨리신은 지방산을 방출하고 인지질을 가수분해하여 세포막을 불안정하게 만든다. 이러한 작용 메카니즘으로 인해, PLA2는 염증성 질환에서의 연구 및 응용을 위한 필수적인 모델이 될 것을 약속한다. 이는 세포막(14)에서의 지질 거동을 연구하기 위한 모델로서 작용할 수 있다.
여기에서, 우리는 바다 말미잘로부터 조추출물을 수득하기 위한 효율적인 프로토콜을 기술한다 Anthopleura dowii Verrill, 1869, 및 검출 용혈 및 포스포리파아제. 둘 다 새로운 분자 도구를 설계하기위한 주형으로 사용될 수있는 관련 독소입니다.

<table><tbody><tr><td>15mL 원추형 원심분리기 튜브</td>, <td>Corning</td><td>430766</td><td></td></tr><tr><td>2-Bromophenol blue</td><td>, Sigma</td><td>B75808</td><td></td></tr>, <tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td></td></tr>, <tr><td>50mL 원추형 원심분리기 튜브</td>, <td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>Acetic Acid, Glacial</td><td>J.T. Baker</td>, <td>9515-03</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Promega</td><td>V3115</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Promega</td><td>V3125</td><td></td></tr><tr><td>Bisacrylamide</td><td>Promega</td><td>V3143</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 분획 V</td><td>시그마</td><td>A3059-100G</td><td></td></tr><tr><td>Bradford 단백질 분석</td><td>Bio-Rad</td><td>5000006</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 플레이트 96 웰, V-bottom</td><td>Corning</td><td>3894</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 튜브</td><td>Corning</td><td>CLS430829</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc MP 시스템</td><td>Bio-Rad</td><td>1708280</td><td></td></tr><tr><td>Citric</td><td>acid Sigma-Aldrich</td><td>251275</td><td></td></tr><tr><td>Clear flat.bottom 96-Well Plates</td><td>Thermo Scientific</td><td>3855</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie brilliant blue G-250</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610406</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie brilliant blue R-250</td><td>Bio-Rad</td><td>1610400</td><td></td></tr><tr><td>포도당</td><td>J.T. Baker</td><td>1916-01</td><td></td></tr><tr><td>덕트리스 인클로저</td><td>Labconco</td><td>수직</td><td>https://imagej.nih.gov/ij ImageJ 1.53c</td></tr><tr><td>Gel Doc EZ</td><td>Bio Rad.</td><td></td><td>겔 문서화 시스템</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516-4L</td><td></td></tr><tr><td>혈구계</td><td>Marienfeld</td><td>650030</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ (Software)</td><td>NIH, USA</td><td>Version 1.53C</td><td></td></tr><tr><td>Incubator 211</td><td>Labnet</td><td>I5211 DS</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>J.T. Baker</td><td>9049-03</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN tetra cell</td><td>Bio-Rad</td><td>1658000EDU</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>J.T. 베이커</td><td>3824-01</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>J.T. 베이커</td><td>3624-01</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4. H2o</td><td>J.T. Baker</td><td>3818-05</td><td></td></tr><tr><td>Origin 소프트웨어</td><td></td><td>버전 9</td><td>시그모이드 조정으로 플롯을 설계하려면</td></tr><tr><td>Petridish</td><td>Falcon</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman kit</td><td>Gilson</td><td>F167380</td><td></td></tr><tr><td>Precast mini gel</td><td>BioRad</td><td>1658004</td><td></td></tr><tr><td>Prestained Protein Ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>26620</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일</td><td>Roche</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>단백질 분석 염료 시약 농축액</td><td>바이오 라드</td><td>5000006</td><td></td></tr><tr><td>로다민 6G</td><td>시그마-알드리치</td><td>252433</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>시그마-알드리치</td><td>L4509</td><td></td></tr><tr><td>구연산나트륨 이수화물</td><td>JT 베이커</td><td>3646-01</td><td></td></tr><tr><td>분광 광도계</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>G10S UV-VIS</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>볼트 전원 공급 장치</td><td>Hoefer</td><td>PS300B</td><td></td></tr></tbody></table>

간단한 생물 분석법에 의한 바다 아네몬의 조추출물에서 용혈성 및 포스포리파아제 활성의 확인

Identification of Hemolytic and Phospholipase Activity in Crude Extracts from Sea Anemones by Straightforward Bioassays

바다 말미네 독 조성물은 폴리펩티드 및 비단백질 분자를 포함한다. 세포 용해 성분은 새로운 분자 도구를 설계하기위한 높은 생명 공학 및 생물 의학적 잠재력을 가지고 있습니다. 바다 말미잘독은 선충류라고 불리는 외배엽 및 하위 세포 구조의 선 세포에 위치하며, 둘 다 바다 말미잘의 몸 전체에 분포합니다. 이 특성은 세포와 선충류가 다른 독성이없는 분자와 함께 독 성분을 방출하기 위해 용해되어야하기 때문에 도전을 의미합니다. 따라서, 먼저, 독은 조추출물(다양하고 다양한 분자와 조직 파편들의 혼합물)로부터 유래된다. 다음 단계는 특정 생체활성을 갖는 폴리펩티드를 검출하는 것이다. 여기에서, 우리는 시탈리신의 존재를 확인하기 위해 바다 말미네 조추출물 및 생물검정을 수득하기 위한 효율적인 전략을 기술한다. 첫 번째 단계는 시세포 분해신을 방출하는 저렴하고 간단한 기술 (교반 및 동결 해동 사이클)을 포함합니다. 우리는 가장 높은 세포 용해 활성과 단백질 (건조 중량 20g에서 단백질 ~ 500mg)을 얻었습니다. 다음으로, 추출물의 폴리펩티드 복잡성을 SDS-PAGE 겔 검출에 의해 분석하였고, 10 kDa 내지 250 kDa 사이의 분자량을 갖는 단백질을 검출하였다. 용혈성 분석에서 우리는 양 적혈구를 사용하고 HU50 (11.1 ± 0.3 μg / mL)을 측정했습니다. 대조적으로, 조 추출물에서 포스포리파아제의 존재는 아가로스를 갖는 고체 배지에서 기질로서 달걀 노른자를 사용하여 결정되었다. 전반적으로,이 연구는 효율적이고 저렴한 프로토콜을 사용하여 조 추출물을 준비하고 복제 가능한 생물 분석을 적용하여 세포 분해물, 생명 공학 및 생물 의학 관심사를 가진 분자를 확인합니다.

바다 말미잘의 조추출물을 얻기 위해 사용된 프로토콜의 대표적인 결과는 두 가지 기술(동결 및 해동의 교반 및 순환)을 결합하면 선충종을 효율적으로 배출할 수 있었으며 총 단백질 양은 500mg(8mg/mL)이었다(그림 3).
조 추출물의 단백질 복잡성은 SDS-PAGE 전기영동을 통해 10 kDa 및 250 kDa 초과로부터 관찰될 수 있었다. 또한, 시톨리신은 15 kDa 및 20 kDa의 분자량 영역에서 검출되었으며, 포스포리파아제13 또는 악티노포린 3에 상응할 수 있는 분자량의 범위였다(도 4).
동결 및 해동 주기 전과 동안 추출물의 용혈 활성은 100% 용혈까지 증가하였고, 마지막 두 사이클에서 총 조 추출물 단백질 중 50 μg...

여기에서, 우리는 바다 말미잘에서 조독 추출물을 얻고 용혈성 및 포스포리파제 활성을 검출하는 프로토콜을 기술한다.

Sea anemone venom composition includes polypeptide and non-proteins molecules. Cytolytic components have a high biotechnological and biomedical potential ...

바다 말미암 독소 상호 작용은 독소의 큰 다양성과 풍부함을 얻고 특정 독소의 빠른 동정을 얻기 위해 최소한의 유기체와 효율적인 프로토콜을 사용해야합니다. 우리는 다량의 단백질로 조 추출물을 제조하고 재현 가능하고 구체적이며 빠르며 저렴한 분석을 설명하여 바다 말미잘독에서 용혈 및 포스포릭 염기를 확인하는 두 가지 효율적인 기술을 결합했습니다. 상기 방법은 하나 또는 두 가지 유형의 시세포분해신을 동정하기로 결정되는 거의 모든 예에서 사용될 수 있다.이 방법의 효율성은 조 추출물을 준비하는 동안 각 단계에서 시간을 관리함으로써 달성됩니다. 용혈의 핵심은 기계적 용해를 피하기 위해 적혈구를주의 깊게 취급하고 인두 분해 분석에서 플레이트 준비 온도를 관리하는 것입니다. 이 절차를 시연하는 것은 Santos Ramirez-Carreto 박사, 생물 학자 Sandra Salazar Garcia, 생물 학자 Giovanni Macias Martinez가 될 것입니다.먼저 수집된 바다 말미잘인 A.doi를 증류수로 손으로 세척하여 신체에 부착되는 큰 기질 입자를 제거한다. 즉시 72 시간 동안 울트라 냉동고에서 영하 80도에서 유기체를 동결시킵니다. 그런 다음 유기체를 48 시간 동안 동결 건조 조건으로 동결 건조를위한 특수 안경에 넣으십시오.조직 수분 공급을 위해, 동결건조된 유기체의 건조 중량 20그램을 50밀리몰 인산나트륨 완충액 60밀리리터와 하나의 억제제 칵테일 정제로 재구성한다. 마그네틱 교반기에서, 샘플을 약 800RPM과 네 °C에서 12시간 동안 연속적으로 교반한다. 세포 용해 및 선충류 배출을 유도하기 위해 샘플을 영하 20도에서 12 시간 동안 동결시킨 후, 용기를 90 %까지 해동 될 때까지 실온에서 물에 넣고이 과정을 세 번 반복하십시오.추출물을 명확히 하기 위해, 샘플을 섭씨 4도에서 40분 동안 25, 400배 G에서 원심분리한다. 상층액을 회수하고 다시 원심분리한다. 이 단계를 서너 번 반복하고 마침내 상청액을 회수하십시오.회수된 상청액 또는 조추출물은 독 성분 및 지질, 탄수화물 및 핵산과 같은 다른 세포 분자를 함유한다. 상용 브래드포드 비색 분석 키트를 사용하여 조 추출물의 단백질 농도를 결정한다. 샘플을 진탕 없이 실온에서 다섯 분 동안 인큐베이션한다.이어서, 595 나노미터에서 흡광도를 측정하였다. 샘플 BSA 흡광도의 평균을 플롯하고 그래프의 방정식을 결정하며, 여기서 y는 흡광도, m은 선의 기울기, x는 단백질 농도, b는 원점에 대한 누진이다. 조 추출물을 분석하기 위해, 단백질을 변성시키기 위해 단백질 로딩 버퍼의 다섯 마이크로리터에 조 추출물의 30 마이크로그램을 첨가한다.최종 부피는 50 마이크로리터 미만이어야 한다. 한 시간 30분 동안 25밀리암페어에서 일정하게 전기영동을 실행합니다. 겔 단백질의 확산을 피하기 위해, 단백질에 고정 용액을 첨가하고, 80RPM에서 진탕하면서 실온에서 40분 동안 인큐베이션한다.이어서, 용액을 데칸트하고 단백질 가교 용액을 첨가한다. 실온에서 30분 동안 진탕하면서 80 RPM에서 인큐베이션한다. 용액을 제거하고 5 분 동안 100 밀리리터의 증류수로 겔을 세척하십시오.그런 다음 물을 제거하고 이 절차를 네 번 반복하십시오. 실온에서 실험실 회전 발진기에서 60RPM으로 교반하는 쿠마시 브릴리언트 블루 R-250 여과 용액 50 밀리리터로 단백질 염색을 15분 동안 수행하십시오. 양의 경정맥에서 한 밀리리터의 혈액을 추출하고 주사기에서 바늘을 제거하십시오.즉시 50 밀리리터의 Alsever 용액이있는 튜브에 혈액을 배출하고 섭씨 4도에서 5 분 동안 804 배 G에서 원심 분리하십시오. 상청액을 버리고 튜브의 내벽을 따라 밀어 30 밀리리터의 Alsever 용액을 첨가하십시오. 파스퇴르 플라스틱 피펫을 사용하여 펠렛을 천천히 재현탁시키고 용액을 섭씨 4도에서 5분 동안 804배 G에서 다시 원심분리한다.상청액이 명확해질 때까지이 과정을 반복하십시오. Alsever 용액의 최종 부피를 유지하여 밀리리터 당 약 2 백만 세포의 농도를 달성하십시오. 그런 다음 Neubauer 챔버 또는 혈구 측정기를 사용하여 세포를 계수하십시오.용액 혼합물을 흔들지 않고 섭씨 37도에서 한 시간 동안 인큐베이션한 다음, 플레이트를 섭씨 4도에서 5분 동안 804배 G에서 원심분리한다. 평평한 바닥을 가진 다른 96-웰 플레이트에서 상청액을 회수하십시오. 조 추출물에 세포 분해신이 포함되어 있으면 적혈구가 용해되어 헤모글로빈을 방출합니다.415 나노 미터에서 흡광도를 읽고 적혈구의 50 %에서 용혈을 일으키는 추출물의 양을 계산하십시오. 바다 말미잘의 조 추출물의 양을 늘리고 적절한 소프트웨어를 사용하여 시그모이드 조정으로 플롯을 설계하십시오. 닭고기 달걀 1개를 증류수에 1%SDS로 씻고 멸균 상태에서 달걀 흰자위와 달걀 노른자를 분리합니다.용액 A, B, C 및 D를 준비합니다.용액 B에 500 마이크로리터의 용액 A와 C를 추가하고 100 마이크로리터의 용액 D.Mix를 넣고 25 밀리리터를 각 페트리 접시에 붓습니다. 용액이 멸균 조건에서 응고 될 때까지 기다렸다가 얇은 튜브로 직경이 약 두 ~ 세 밀리미터 인 우물을 만드십시오. 한 웰에 음성 대조군으로서 총 20 마이크로리터의 인산염 완충액을 첨가하고, 다른 웰에 양성 대조군으로서 결정된 포스포리파아제의 20 마이크로리터를 첨가한다.상이한 양의 조추출물 단백질 5, 15, 25, 35, 및 45 마이크로그램을 나머지 웰에 놓고, 각각 20 마이크로리터의 최종 부피로 놓는다. 섭씨 37도에서 20 시간 동안 배양하십시오. 바다 말미잘의 조 추출물을 얻기 위해 사용 된 프로토콜의 대표적인 결과는 동결과 해동의 교반과 사이클이라는 두 가지 기술을 결합하여 선충류의 효율적인 배출을 일으킨다는 것을 보여주었습니다.자극 전후의 선충세포가 여기에 표시됩니다. 선충 낭종 세뇨관은이 이미지에 노출되어 독소 방출을 나타냅니다. 바다 말미암 조추출물의 전기영동 프로파일이 여기에 도시되어 있다.바다 말미암 조 추출물은 SDS-PAGE 15% 폴리아크릴아미드 겔로 분석하였고, 10 킬로달톤에서 250 킬로달톤의 분자량까지 단백질을 나타내었다. 여기서, 레인 1은 단백질 사다리이고 레인 2는 바다 말미잘독이다. 시토리신은 15킬로달톤 및 20킬로달톤의 분자량 영역에서 검출되었다.여기에 표시된 것은 양으로부터의 적혈구에서의 용혈 분석이다. 동결 및 해동 주기 전과 동안 추출물의 용혈 활성은 마지막 두 사이클에서 총 조 추출물 단백질의 50 마이크로그램으로 100% 용혈까지 증가하였다. 50 % 양 적혈구를 용해시키는 데 필요한 양은 밀리리터 당 11.1 0.3 마이크로 그램입니다.포스포리파아제 활성은 조추출물 샘플이 적용된 한천 플레이트의 영역에서 투명한 후광의 형성에 의해 검출되었다. 결과는 총 단백질의 15 마이크로그램으로부터 포스포리파아제 활성의 존재를 보여준다. 할로의 직경이 용량 의존적 방식으로 증가하였다; The diameter of the halo increased in a dose-dependent manner; 즉, 조 추출물의 양이 증가하면, 할로의 직경이 증가하였다.절차를 시도하는 동안 선충류 배출을 유도하고, 총 단백질을 정량하고, SDS-PAGE 전기영동으로 조 추출물을 분석하고, 용혈의 50 %를 생산하는 조 추출물 단백질의 양을 계산하고, 포스포리파아제 분석에서 다른 양의 단백질을 사용하십시오. 우리는 프로테오믹 기술로 조 추출물을 분석하여 생명 공학 및 생물 의학에서 큰 관련성을 가진 폴리펩티드를 확인하고 고유 한 분자를 프로파일 링하고 특성화 한 다음 실험실에서 생산하여 적용 할 수 있습니다. 우리는 인간 완결한 폐 암종 상피 세포에서 항종양 활성을 갖는 수행 단백질의 서열의 일부를 수득하였다.마찬가지로, 우리는 생명 공학 관심의 포스포리파아제의 서열을 확인합니다.

identification-hemolytic-phospholipase-activity-crude-extracts-from

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 비디오에서는 해양 말미잘인 Anthopleura dowii의 조독 추출물에서 포스포리파아제의 존재를 확인하는 분석을 보여줍니다. 이 분석은 효소 포스포리파아제(Enzyme phospholipase)가 방사형 방식으로 고체 매체에 통합된 인지질을 확산시키고 분해하는 아가로스 겔 확산 기술을 사용합니다.

Phospholipase Activity Assay: Anthopleura dowii 의 조독 추출물에서 Phospholipase 활성을 결정하기 위한 겔 확산 분석

이러한 생물학적 검정은 식품 영양 학적으로 유사한 매트릭스를 이용 농도 천연 해양 생물의 조직 유기 추출물로부터 병입 억지 대사의 존재를 평가하기위한 모델 육 물고기를 이용한다.

물고기 먹이 실험 생물 검정은 해양 생물의 조직에서 이차 대사 산물의 Antipredatory 활동을 평가하기 위해

본 보고서는 리슈마니아 세포 추출물을 사용하여 포스파티딜에탄올아민 메틸전이효소 활성을 측정하기 위한 체외 효소 분석을 설명합니다. 이 분석은 방사성 메틸기가 S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine에서 내인성 포스파티딜에탄올아민으로 전달되는 것을 기반으로 합니다.

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많은 예측된 (포스포) 리파제는 기질 특이성 및 생리학적 기능과 관련하여 제대로 특성화되지 않았습니다. 여기에서 우리는 효소 활성을 최적화하고, 천연 기질을 검색하고, 이러한 효소에 대한 생리학적 기능을 제안하는 프로토콜을 제공합니다.

리파제 및 포스 후보자에 대한 기질 특이성을 정의

우리는 옵신으로 재구성된 큰 단층 리포좀에서 인지질 스크램블을 측정하기 위한 형광 기반 분석을 설명합니다.

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여기, 선물이 분리 하 고 특성 구조, 후 각 힘, 및 바다 lampreys의 상 상속 페로몬 화합물의 행동 응답 프로토콜.

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중증 환자에서 전혈 내독소 혈증 검출을 위한 내독소 활성 분석

여기서, 우리는 단백질 추출물과 트랜스포파디딜리노시톨 4-인산염이 체외에서인산염을 배출하는지 여부를 결정하기 위해 형광 지질 센서와 리포좀을 사용하는 프로토콜을 설명합니다.

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이 작업은 소금물 새우 치사 분석으로도 확인된 Artemia salina 치사율 생물학적 분석 절차를 평가하고 검토하는 것을 목표로 합니다. 이 간단하고 저렴한 방법은 샘플, 즉 천연물의 일반적인 독성 (예비 독성 평가로 간주 됨)에 대한 정보를 제공합니다.

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인간 진균 병원체인 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans )는 숙주 내에서 생존을 촉진하기 위해 다양한 독성 인자(예: 펩티다아제)를 생성합니다. 환경적 틈새는 새로운 천연 펩티다아제 억제제의 유망한 공급원입니다. 이 프로토콜은 연체 동물 추출물의 준비와 곰팡이 독성 인자 생산에 미치는 영향에 대한 평가를 간략하게 설명합니다.

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우리는 기존 기술보다 우수한 감도와 분해능으로 리포솜 막 투과성을 평가하는 비용 효율적인 방법을 제시합니다. 새로운 캡슐화된 리간드 치환 반응을 사용하여 이 기술은 모델 막에서 포스포리파제 A2 유도 변화를 검출합니다. 표준 분석과 쉽게 통합되는 이 접근 가능한 접근 방식은 막 생물물리학 및 독소 상호 작용 연구를 위한 해상도를 향상시킵니다.

포스파티딜이노시톨 인산염 그룹이 독 PLA2의 멤브란트로픽 작용에 미치는 영향을 조사하기 위한 리포솜 막 투과성 분석

배우세요 바다 아네모네 조추출물에서 용혈성 및 포스포리파아제 활성을 확인하는 생물 분석법을. 효율적인 추출과 독소 식별을 위한 재현 가능한 프로토콜을 통해 신경과학 및 독성학 연구에 활용할 수 있습니다.

간단한 생물 분석법에 의한 바다 아네몬의 조추출물에서 용혈성 및 포스포리파아제 활성의 확인

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