Name: Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection에서 유전 된 면역 연구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-06T14:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: 학습하세요 Caenorhabditis elegans를 이용한 대대적 면역 연구 방법으로, 미세포자충 감염에서 자손의 면역 전달 메커니즘을 밝히는 실험 기술을 익힐 수 있습니다.

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원고에 대한 유용한 의견을 제공 한 Winnie Zhao와 Yin Chen Wan에게 감사드립니다. 이 연구는 캐나다 자연 과학 및 공학 연구위원회 (Grant #522691522691)의 지원을 받았습니다.

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본 프로토콜은 단순하고 유전적으로 다루기 쉬운 N. parisii-C. elegans 감염 모델에서 microsporidia 및 유전 된 면역의 연구를 설명합니다.
포자 준비는 생산성24에 따라 일반적으로 6 개월의 실험 동안 충분한 포자를 산출하는 집중적 인 프로토콜입니다. 중요하게도, 감염성은 실험에 사용하기 전에 각각의 새로운 포자 "제비"에 대해 결정되어야 한다. 포자 제제 사이의 감염성의 가변성으로 인해, 단일 로트는 실험의 모든 반복에 대해 일관되게 사용되어야 한다. 해동하면 포자가 발사되고 감염성이 감소 할 수 있으므로 개별 분취량을 해동하거나 다시 얼려서는 안됩니다. 따라서 포자는 감염 직전에 -80 °C 냉동고에서만 제거되어야하며 벤치에있는 동안 얼음 위에 유지되어야합니다.
단계 5-6에서, 감염 분석이 윤곽을 드러냈다. 감염 분석 중에는 ...

유전 된 면역은 병원균에 대한 부모의 노출로 감염 저항성 자손의 생산을 가능하게하는 후성 유전 적 현상입니다. 이러한 유형의 면역 기억은 적응 면역 체계가 부족하고 바이러스, 박테리아 및 곰팡이 질환으로부터 보호 할 수있는 많은 무척추 동물에서 나타났습니다1. 유전 된 면역은 건강과 진화를 이해하는 데 중요한 영향을 미치지 만,이 보호의 기초가되는 분자 메커니즘은 크게 알려지지 않았습니다. 이것은 부분적으로 유전 된 면역이 묘사 된 많은 동물들이 연구를위한 모델 유기체가 확립되지 않았기 때문입니다. 대조적으로, 투명한 선충류 Caenorhabditis elegans에 대한 연구는 광범위한 유전 및 생화학 적 툴킷 2,3, 고도로 주석이 달린 게놈 4,5 및 짧은 생성 시간의 이점을 얻습니다. 실제로 C. elegans의 연구는 후성 유전학 및 선천적 면역 6,7 분야에서 근본적인 발전을 가능하게했으며, 이제는 면역 기억 8,9을 연구하기위한 확립 된 모델입니다.
Microsporidia는 거의 모든 동물을 감염시키고 면역 저하 된 인간10에서 치명적인 감염을 일으키는 곰팡이 병원체입니다. 감염은 미세 스포리 디아 포자가 극성 튜브 (polar tube)라는 구조를 사용하여 세포 내용물 (스포로 플라즈마)을 숙주 세포에 주입하거나 "발사"할 때 시작됩니다. 기생충의 세포 내 복제는 메론트의 형성을 초래하며, 이는 궁극적으로 세포11,12를 빠져 나올 수있는 성숙한 포자로 분화됩니다. 이러한 기생충은 인간의 건강과 식량 안보 모두에 해롭지 만, 감염 생물학12에 대해 배울 것이 많이 있습니다. Nematocida parisii는 웜의 장 세포에서만 독점적으로 복제되는 천연 미세 스포리디안 기생충으로 번식력을 감소시키고 궁극적으로 사망을 초래합니다. N. parisii-C. elegans 감염 모델은 (1) 병원체 클리어런스에서 자가포식의 역할 13, (2) 미세 스포리디아가 감염된 세포를 비언어적으로 빠져 나올 수있는 방법14, (3) 병원체가 syncytia 15를 형성하여 세포 간 확산 할 수있는 방법, (4) 단백질 N. parisii가 숙주 (16)와 계면하기 위해 사용하는 방법, 및 (5) 전사 세포 내 병원체 반응(IPR)17, 18.
C. elegans의 감염에 대한 프로토콜은 현재 연구에 설명되어 있으며 독특한 microsporidia 생물학을 밝히고 감염에 대한 숙주의 반응을 해부하는 데 사용할 수 있습니다. 키틴 결합 염료 다이렉트 옐로우 96 (DY96)으로 염색된 고정 웜의 현미경 검사는 장 전체에 걸쳐 키틴 함유 미세 스포리디아 포자의 감염 확산을 보여줍니다. DY96 염색은 또한 숙주 적합성의 판독으로서 웜 중량 (배아를 생산하는 능력)의 동시 평가를 위해 키틴 함유 웜 배아의 시각화를 가능하게합니다.
최근 연구에 따르면 N. parisii에 감염된 C. elegans는 동일한 감염에 강하게 저항하는 자손을 생산합니다19. 이 유전 된 면역은 단일 세대에 지속되며 더 심하게 감염된 부모의 자손이 microsporidia에 더 강하기 때문에 용량에 따라 다릅니다. 흥미롭게도, N. parisii-primed 자손은 또한 박테리아 장내 병원균 인 Pseudomonas aeruginosa에 더 내성이 있지만, 천연 병원균 Orsay virus19로부터 보호되지는 않습니다. 본 연구는 또한 면역-프라이밍된 자손이 미세 스포리디아에 의한 숙주 세포 침윤을 제한한다는 것을 보여준다. 이 방법은 또한 면역-프라이밍된 자손의 수집과 FISH가 숙주 세포 침윤 및 포자 발사(20)를 분석하기 위해 장내 세포에서 N. parisii RNA를 검출하는데 어떻게 사용될 수 있는지를 기술한다.
함께,이 프로토콜은 C. elegans에서 microsporidia 및 유전 된 면역을 연구하기위한 견고한 토대를 제공합니다. 이 모델 시스템의 향후 연구가 유전 된 면역의 초기 분야에서 중요한 발견을 가능하게하기를 희망합니다. 이러한 기술은 또한 다른 숙주 유기체에서 미세 스포리디아 유도 유전 면역을 조사하기위한 출발점이 될 가능성이 큽니다.

<table><tbody><tr><td>2.0mm 지르코니아 구슬</td><td>Biospec Products Inc.</td><td>11079124ZX</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 주사기</td><td>Fisher Scientific</td><td>1482613</td><td></td></tr><tr><td>5 &mu; m 필터</td><td>Millipore Sigma</td><td>SLSV025LS</td><td></td></tr><tr><td>Axio Imager 2</td> <td>현미경 슬라이드의 DY96 및 FISH 염색 벌레 이미징을 위한</td><td>Zeiss</td><td>-</td>형광 현미경</tr><tr><td>Axio Zoom V.16 형광 스테레오 줌 현미경</td> <td>Zeiss-IPR</td><td>을 시각화하기 위한 형광 형질전환 동물의 실시간 이미징용</td><td></td></tr> <tr><td>Baked EdgeGARD Horizontal Flow Clean</td><td>Bench Baker</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>비드 디스럽터, 지니 SI-D238 아날로그 디스럽터 지니 세포 디스럽터, 120V</td><td>글로벌 산업용</td><td>T9FB893150</td><td></td></tr><tr><td>셀-VU 슬라이드, 밀레니엄 사이언스 일회용 정자 수 세포분석기</td><td>Fisher Scientific</td><td>DRM600</td><td></td></tr><tr><td>다이렉트 옐로우 96</td><td>시그마-알드리치</td><td>S472409-1G</td><td></td></tr><tr><td>EverBrite 마운팅 미디어(DAPI</td><td>비오튬</td><td>23001</td><td></td></tr> <tr><td>포함)DAPI</td><td>Biotium</td><td>23002</td><td></td></tr><tr><td>Fiji/ImageJ 소프트웨어가</td> 없는 EverBrite 장착 매체 <td>ImageJ</td><td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td><td></td></tr><tr><td>기계식 로터</td><td>Thermo Sceintific</td><td>415110 / 1834090806873</td> 하룻밤 부화 MicroB FISH 프로브 Biosearch Technologies Inc.<td>를 위해 표백된 배아의 튜브를 회전시키는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td></td><td>.</td><td>-</td><td>Quasar 570 (Cy3) 5' 변형 및 HPLC 정제, CTCTCGGCACTCCTTCCTG</td></tr><tr><td>N2</td><td>Wild-type, Bristol strain</td><td>Default strain</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771-100G</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨 용액 (5 N)</td><td>Fisher Chemical</td><td>FLSS256500</td><td></td></tr><tr><td>차아염소산나트륨 용액 (6% )</td><td>피셔 케미컬</td><td>SS290-1</td><td></td></tr><tr><td>Stemi 508 스테레오 현미경</td><td>Zeiss</td><td>-</td><td>웜의 일일 유지 보수 및 분석 설정을 위한 L1 웜 계수</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield + A16</td><td>Biolynx</td><td>VECTH1500</td><td></td></tr></tbody></table>

caenorhabditis elegans model of microsporidia infection에서 유전 된 면역 연구

Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection

유전 된 면역은 일부 동물이 이전 감염의 "기억"을 자손에게 전달할 수있는 방법을 설명합니다. 이것은 자손의 병원균 내성을 높이고 생존을 촉진 할 수 있습니다. 유전 된 면역은 많은 무척추 동물에서보고되었지만,이 후성 유전 적 현상의 기초가되는 메커니즘은 크게 알려지지 않았습니다. 천연 microsporidian 병원균 Nematocida parisii에 의한 Caenorhabditis elegans의 감염은 microsporidia에 강력하게 저항하는 자손을 생산하는 웜을 초래합니다. 본 프로토콜은 단순하고 유전적으로 다루기 쉬운 N. parisii-C. elegans 감염 모델에서 세대 간 면역의 연구를 기술한다. 현재 기사는 C. elegans를 감염시키고 면역 프라이밍 된 자손을 생성하는 방법을 설명합니다. 현미경 검사에 대한 염색 및 현미경 검사에 의한 감염을 시각화하여 microsporidia 감염에 대한 내성을 분석하는 방법도 제공됩니다. 특히, 유전 된 면역은 미세 스포리디아에 의한 숙주 세포 침윤을 방지하고, 계내 혼성화 (FISH)에서의 형광은 침윤 사건을 정량화하는데 사용될 수 있다. 면역-프라이밍된 자손에서 생성된 미세 포자의 상대적 양은 포자를 키틴-결합 염료로 염색함으로써 정량화될 수 있다. 지금까지 이러한 방법은 유전 된 면역의 동역학 및 병원체 특이성뿐만 아니라 그 기초가되는 분자 메커니즘에 대해 밝혀 왔습니다. 이러한 기술은 C. elegans 연구에 사용할 수있는 광범위한 도구와 함께 유전 된 면역 분야에서 중요한 발견을 가능하게합니다.

본 연구에서, C. elegans (P0)의 부모 집단은 L1 단계에서 낮은 용량의 N. parisii 포자로 감염되었다. 이러한 감염 조건은 일반적으로 부모의 표백을 통해 많은 수의 미세 스포리디아 내성 F1 자손을 얻는 데 사용됩니다. 감염된 부모 집단 및 감염되지 않은 대조군을 72 hpi로 고정시키고, DY96으로 염색하여 웜 배아 및 미세스포리디아 포자를 시각화하였다(도 1A). 감염된 동물은 작고, 많은 미세 스포자를 함유하고, 건강한 감염되지 않은 대조군보다 적은 배아를 생산합니다. 웜 중량의 평가는 감염되지 않은 동물의 ~ 95 %가 감염된 동물의 80 % 미만에 비해 자손을 생산한다는 것을 보여주었습니다 (그림 1B). 정량화에 따르면 DY96 염색된 포자를 함유하는 웜의 수에 의해 결정된 바와 같이, 미세 스포리디아 처리 집단의 ~90%가 감염되었다는 것을 밝혀냈다(<str...

microsporidian 기생충 Nematocida parisii에 의한 Caenorhabditis elegans의 감염은 웜이 동일한 병원균에 매우 저항력이있는 자손을 생산할 수있게합니다. 이것은 유전 된 면역의 예이며, 잘 이해되지 않는 후성 유전 적 현상입니다. 본 프로토콜은 유전적으로 견인성 웜 모델에서 유전된 면역의 연구를 기술한다.

Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection에서 유전 된 면역 연구

Inherited immunity describes how some animals can pass on the "memory" of a previous infection to their offspring. This can boost pathogen resistance in ...

이러한 프로토콜은 microsporidia에 대한 유전 된 면역의 연구를 가능하게합니다. 여기에 설명 된 기술은 면역이 세대에 걸쳐 어떻게 전달되는지, 그리고 자손의 미세 스포리디아에 대한 면역을 결정하는 분자를 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. C.elegans는 상속을 분석하기위한 짧은 생성 시간을 가진 간단하고 유전적으로 다루기 쉬운 모델입니다.웜에 사용할 수있는 많은 도구는 세대 간 면역의 분자 메커니즘을 밝히는 데 사용할 수 있습니다. P0 동물을 감염시킬 때, 자손을 생산하는 부모의 능력에 큰 영향을 미치지 않는 낮은 포자 용량을 사용하십시오. 이것은 표백이 하류 실험을위한 충분한 F1 동물을 산출한다는 것을 보장한다 시작하기 위해, 계획된 감염 하루 전에 섭씨 4도에서 실온으로 필요한 수의 10 센티미터의 씨를 뿌리지 않은 선충류 성장 배지 플레이트를 이동시킨다.감염 직전에, 약 2, 500개의 동기화된 L1 웜을 마이크로퍼지 튜브에서 1, 400배 G에서 30초 동안 펠릿 다운시킨다. 피펫 팁으로 상층액을 제거하여 50 마이크로 리터의 M9 배지에 웜을 남겨 둡니다. 10X 에스케리치아 콜라이 균주 OP50 1밀리리터를 1단계 웜에 첨가하고, N.parisii 포자를 원하는 농도로 첨가한다.감염되지 않은 대조군으로서, 사용된 포자 제제의 부피와 동등한 M9 배지의 부피를 갖는 L1s 및 OP50의 동등한 튜브를 준비한다. L1 웜 샘플을 간단히 볼텍싱하여 혼합하고, 1밀리리터의 웜 위에 플레이트를 10센티미터 미시드된 선충류 성장 배지 플레이트 상에 올려 놓는다. 액체가 접시 전체에 퍼지도록 소용돌이치십시오.뚜껑을 떼어 낸 깨끗한 캐비닛에서 플레이트를 10 ~ 20 분 동안 또는 완전히 건조 될 때까지 건조한 다음 섭씨 21도에서 72 시간 동안 배양하십시오. 감염 후 72 시간에 해부 현미경으로 플레이트를 검사하십시오. 감염된 웜이있는 플레이트에는 감염되지 않은 웜이있는 플레이트보다 배아가 적어야합니다.그런 다음 플레이트에서 웜을 1 밀리리터 M9 배지를 사용하여 마이크로 원심분리 튜브로 씻어냅니다. 많은 웜이 플레이트에 남아 있으면 1400 배 G에서 30 초 동안 원심분리하여 웜을 펠릿화하십시오. 상층액을 제거하고 추가 플레이트 세척을 수행하십시오.실온에서 30초 동안 1400배 G에서 원심분리하여 웜을 펠릿화하고 1밀리리터의 M9 배지로 또는 상층액이 맑을 때까지 두 번 세척한다. 1

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

기본<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; 방법 : 동기화 및 전망

단백질 항상성, 스트레스 및 노화 사이의 관계를 연구하기 위해 유전적으로 다루기 쉬운 후생동물인 Caenorhabditis elegans를 모델 시스템으로 사용하여 단백질 기능 장애, 세포 내 단백질 국소화 및 유기체, 세포 및 단백질 수준에서의 단백질 안정성을 추적하여 단백질 접힘의 변화를 모니터링했습니다.

사용 예쁜 꼬마 선충 다세포 생물의 단백질 항상성을 연구하는 모델 시스템으로

wormsorter 형광 기자의 표현에 따라 웜을 정렬하여 예쁜 꼬마 선충의 유전자 화면을 용이하게한다. 여기에서, 우리는 새로운 사용 설명 : GFP - 표현 병원체에 의한 식민지에 따라 정렬을, 우리는 면역 반응을 시작하기에 병원체의 인식의 불완전하게 이해 역할을 조사하기 위해 그것을 사용합니다.

의 자동 분리<em&gt; C. 엘레</em&gt; 가변 세균성 병원체에 의해 식민지

C. elegans의 호스트 병원체 상호 작용을 연구 할 수있는 새로운 유전자 모델로 떠오르고있다. 여기에서 우리는 C. 감염 프로토콜을 설명 살모넬라 감염에 대한 방어의 숙주 유전자의 역할을 조사하는 이중 가닥의 RNAi 간섭 기법과 결합 된 살모넬라 티피 뮤 리움과의 elegans.

감염 프로토콜<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em&gt;와<em&gt; 살모넬라 티피 뮤 리움 (Salmonella typhimurium)</em

여기, 선물이 미생물 상호 작용을 공부 하는 다양 한 호스트 모델로 선 충 류 꼬마 선 충 .

선 충 꼬마 선 충-모델을 다양 한 비보에 호스트-미생물 상호작용 연구

이 문서에서는 사용자 지정 미세 장치를 채용 하는 개별 벌레의 라이브 이미징을 설명 합니다. 장치에서 여러 벌레는 개별적으로 별도 챔버, 다양 한 생물 학적 과정의 다중화 경도 감시 허용에 국한 됩니다.

꼬마 선 충 에 경도 이미징을 위한 미세 플랫폼

야생 Caenorhabditis 선충은 많은 미생물과 연관됩니다, 종종 창 자 루멘에서 또는 창 자를 감염. 이 프로토콜은 도어 큐티클의 저항을 활용하여 내장을 식민지화하는 헤아릴 수없는 미생물을 풍부하게하는 방법을 자세히 설명합니다.

장내 미생물군유전체 박테리아를 위해 농축하는 야생 케노르하비티스 선충제의 선택적 세척

세포 외 박테리아와 오르세 바이러스 및 미세 포자충 (곰팡이)과 같은 세포 내 병원체를 포함한 장내 미생물은 종종 야생 Caenorhabditis 선충류와 관련이 있습니다. 이 기사에서는 C. elegans 선충류에 서식하는 미생물을 검출 및 정량화하고 실험실에서 통제 된 감염 후 병원체 부하를 측정하기위한 프로토콜을 제시합니다.

RNA 형광 제자리 혼성화(FISH)를 통해 Caenorhabditis elegans 장에서 미생물 집락화 및 감염을 시각화합니다.

이것은 항체 염색을 통해 면역형광을 위한 생식계열 샘플을 생성하거나 DNA를 시각화하기 위한 간단한 DAPI 염색을 위해 C. elegans 생식선 해부 후 동결 균열에 일반적으로 사용되는 방법입니다. 이 프로토콜은 연구실과 과정 기반 학부 연구 경험의 학부생에게 성공적이었습니다.

C. 엘레 간스 면역형광 및 DAPI 염색을 위한 생식선 해부 및 동결 균열

Caenorhabditis elegans 는 생물학의 주요 모델 종 중 하나이지만 거의 모든 연구는 자연적으로 관련된 미생물이없는 상태에서 수행됩니다. 여기에 설명 된 방법은 미래의 기능적 C. elegans 연구의 기초로서 관련 미생물의 다양성에 대한 이해를 향상시키는 데 도움이 될 것입니다.

모델 선충 Caenorhabditis elegans의 자연 미생물 총의 분리 및 특성화

학습하세요 Caenorhabditis elegans를 이용한 대대적 면역 연구 방법으로, 미세포자충 감염에서 자손의 면역 전달 메커니즘을 밝히는 실험 기술을 익힐 수 있습니다.

Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection에서 유전 된 면역 연구

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