본 프로토콜은 일차 뼈 세포 또는 관련 세포주의 배양에서 지방산 산화 능력을 평가하기 위한 분석을 설명합니다.
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본 프로토콜은 일차 뼈 세포 또는 관련 세포주의 배양에서 지방산 산화 능력을 평가하기 위한 분석을 설명합니다.
조골세포를 분화하여 뼈를 형성하려면 이러한 특수 세포가 뼈 조직을 구성하는 큰 세포외 기질 단백질을 합성한 다음 광물화에 필요한 이온을 농축해야 하기 때문에 상당한 에너지 입력이 필요할 것으로 예상됩니다. 뼈 형성에 필요한 대사 요건에 대한 데이터가 빠르게 등장하고 있습니다. 아직 밝혀야 할 점이 많지만, 중간 신진대사의 혼란이 골격계 질환의 원인이 될 것으로 예상됩니다. 여기에서는 14개의 C 표지 지방산을 14개의CO2 및 산용해성 대사 산물로 산화하는 조골세포 세포의 능력을 평가하기 위한 프로토콜이 요약되어 있습니다. 지방산은 섭식 후 또는 지방 조직 저장에서 해방된 후 순환계에서 흡수될 수 있는 풍부한 에너지 비축량을 나타냅니다. T-25 조직 배양 플라스크에서 수행된 이 분석은 지방산 이용에 대한 유전자 이득 또는 기능 상실 및 골량 유지에 필요한 성장 인자 또는 모르포겐 형태의 동화 신호의 영향에 대한 연구에 도움이 됩니다. 글루타민과 같은 아미노산 또는 포도당의 산화를 평가하기 위해 프로토콜을 조정하는 능력에 대한 세부 정보도 제공됩니다.
골수와 골막에 존재하는 전구 세포에서 유래한 조골세포(osteoblast)는 뼈 조직을 구성하는 미네랄화된 콜라겐이 풍부한 기질의 합성과 분비를 담당합니다. 이러한 에너지 비용이 많이 드는 노력을 완수하고 골격 무결성의 평생 유지에 기여하기 위해 이러한 특수 세포는 세포 외 기질 단백질 1,2 및 연료 기질에서 필요한 화학 에너지를 수확하기 위해 수많은 높은 막 전위 미토콘드리아를 합성하는 데 필수적인 풍부한 거친 소포체를 유지합니다 3,4. 이 후자의 기능의 중요성은 뼈 성장의 중단과 칼로리 제한과 같은 에너지 결핍과 관련된 골감소증 5,6의 발달에 의해 예시됩니다. 조골세포가 선호하는 연료원의 정체와 분화 중 또는 동화 신호에 대한 반응으로 조골세포의 대사 요구 사항에 대한 데이터가 부상하고 있습니다 7,8.
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이 프로토콜은 [1-14C]-올레산을 14CO2 로 변환하는 것을 지방산 산화 용량의 지표로 사용합니다. 지역 방사선 안전 사무소는 실험을 시작하기 전에 방사성 물질 사용에 대한 프로토콜을 승인했습니다. 모든 방사선 절차는 플렉시글라스 차폐 뒤에서 적절한 개인 보호 장비를 사용하여 수행되었습니다. 지역 동물 관리 및 사용 위원회(Local Animal Care and Use Committee)는 일차 세포를 사용하기 전에 프로토콜을 승인했습니다.
1. 배양된 조골세포의 지방산 산화
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카르니틴 팔미토일트랜스퍼라제-1(Cpt1)과 카르니틴 팔미토일트랜스퍼라제-2(Cpt2)의 효소 활성은 미토콘드리아 장쇄 지방산 산화에 필요합니다. Cpt1은 대사 경로의 속도 제한 효소이지만 포유류 게놈에는 세 가지 동형(Cpt-1a, Cpt-1b 및 Cpt-1c)이 암호화되어 있으며 한 동형의 유전적 파괴는 다른 동형의 보상 상향 조절로 이어질 수 있습니다13. 대조적으로, Cpt2는 단일 유전자에 의해 암호화됩니다. 그림 2A에 예시된 실험에서, Cpt2의 유전자 절제는 [1-14C]-올레산이 14CO2로 산화되는 것을 ~60% 감소시키고, 7일 동안 분화된 1차 마우스 calvarial osteoblasts의 배양에서 대조군에 비해 산성 대사 산물의 표지를 ~27% 감소시킵니다. 돌연변이 조골세포에서 올레산을CO2로 산화시키는 나머지 용량은 과산화솜 .......
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위에서 설명한 절차는 측정 된 출력이 NaOH에 담근 여과지에 수집 된 14CO2 및 과염소산으로 배양액의 산성화 후 수집 된 산 용해성 대사 산물이므로 지방산 산화를 직접 평가할 수 있습니다. 형광 표지된 지질 분자 또는 지질 유사체를 사용하는 시판되는 분석 키트는 지질 흡수를 측정할 수 있지만 에너지 생성을 위한 이화작용은 측정하지 않습니다. 13C-metabolic flux14와 같은 다른 이화 작용 측정에는 특수 분석 장비가 필요합니다. 이 분석은 14CO2 수준만 필요한 경우 하루 만에 완료할 수 있으므로 민감하고 상대적으로 빠릅니다(그림 2). 또는 여과지를 섬광 액체에서 하룻밤 동안 배양하고 두 결과의 결정이 필요한 경우 산성 용해성 대사 산물로 동시에 판독할 수 .......
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저자는 경쟁 이익이 없음을 선언합니다.
이 연구는 재향 군인 사무국 연구 개발국(BX003724)의 생물의학 실험실 연구 개발 서비스(Biomedical Laboratory Research and Development Service)의 Merit Review Award와 미국 국립 당뇨병, 소화기 및 신장 질환 연구소(National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, DK099134)의 보조금으로 지원되었습니다.
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| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| [1-14C]-올레산 | Perkin Elmer | NEC317050UC | |
| 15 x 30mm 고무 슬리브 스토퍼 | VWR | 89097-542 | |
| 1mL 주사기 | BD 정밀 | 309628 | |
| 25G 바늘(25G x 1 1/2인치) | BD 정밀 | 305127 | |
| 아스코르브산 | 시그마 알드리치 | A4403 | |
| BCA 단백질 분석 키트 | Thermo Fisher | 23225 | 다른 키트도 적합합니다 |
| Beckman Scintillation Counter 또는 Beckman | Coulter | LS6000SC | |
| Beta-glycerol phosphate | Sigma Aldrich | G6626 | |
| 소 혈청 알부민 | Sigma Aldrich | 126609 | |
| Carnitine | Sigma Aldrich | C0283 | |
| 세포 용해 완충액 | 프로토콜은 일반적인 용해 완충액(예: RIPA)해 | ||
| 부 겸자에 | 출처에서 사용 가능 | ||
| DNA 정량 분석 키트 | 여러 출처에서 사용 가능 | ||
| Dulbecco' s 인산염 완충 식염수 | Corning | 20-030-CV | |
| 소 태아 혈청 | 여러 출처에서 사용 가능 | ||
| 마이크로 원심분리기 튜브, 1.5mL | 여러 출처에서 사용 가능 | ||
| 최소 Essensial Medium, 알파 변형 | Corning | 10-022-CV | |
| 페니실린-스트렙토마이신 | Gibco | 15140122 | |
| 과염소산 | 시그마 알드리치 | 50439 | |
| 폴리 프로필렌 센터 웰 | VWR | 72760-048 | |
| 수산화 나트륨 | 시그마 알드리치 | S5881 | |
| T-25 경사 목 조직 배양 플라스크 | 코닝 | 430639 | |
| 조직 배양 인큐베이터 | |||
| 트립신 (0.25 %) -EDTA | Gibco | 25200056 | |
| Ultima Gold (섬광 용액) | PerkinElmer | 6013329 | |
| Whatman 크로마토그래피 종이 | Sigma Aldrich | WHA3030917 |
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