Name: 파인우드 선충류에서의 RNA 간섭의 적용, Bursaphelenchus xylophilus (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: 배우세요 Bursaphelenchus xylophilus에서 RNA 간섭을 이용한 유전자 기능 연구 방법을. dsRNA 침지법으로 ppm-1 유전자 발현을 억제하고 표현형 변화를 관찰하여 병원성 선충류 생물학적 방제 전략 수립에 활용합니다.

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이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (31870637, 31200487)이 자금을 지원했으며 절강 핵심 연구 계획 (2019C02024, LGN22C160004)이 공동으로 자금을 지원했습니다.

이 연구는 절강 농업 및 임업 대학의 동물 실험위원회에서 승인했습니다. B. xylophilus 분리 NXY61은 원래 중국 절강 성 닝보 (Zhejiang)11의 닝보 (Ningbo) 지역의 병든 Pinus massoniana에서 추출되었습니다.
1. 유전자 클로닝
참고: 이 프로토콜에 사용된 프라이머에 대한 자세한 내용은 자료표를 참조하십시오.
<ol><li>선충류를 수집하십시오.<ol><li>Botrytis cinerea의 균사체 상의 B. xylophilus 균주를 감자 덱스트로스 한천 (PDA) 플레이트 상에서 3-5일 동안 25°C에서 배양하였다.</li>
		<li>Bellman 깔때기 방법14를 사용하여 선충류를 수집하십시오.<ol><li>클램핑된 고무 튜브를 깔때기 아래에 놓고 깔때기 입에 여과지 두 겹을 놓습니다. 곰팡이 배양물을 깔때기로 옮기고 물을 추가하여 곰팡이 매트를 담그십시오. 2 시간 동안 기다린 다음 선충류를 수집하십시오.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>다음 단계에 따라 총 RNA 추출 시약( 표 참조)11 을 사용하여 선충류로부터 전체 RNA를 추출한다.<ol><li>500 μL의 추출 시약과 100 μL의 자기 비드를 2 mL 원심분리 튜브에 첨가한다. 선충류 20 μL를 흡인하고, 샘플을 분쇄기로 옮겨 9,000 × g 에서 30 s 동안 분쇄한다. 5분 동안 인큐베이션한 다음, 12,000 × g 및 4°C에서 10분 동안 원심분리한다.</li>
		<li>상청액을 새로운 원심분리 튜브로 옮깁니다. 100 μL의 클로로포름을 첨가하고, 튜브를 캡핑하고, 튜브를 여러 번 뒤집어 혼합한다. 3분 동안 인큐베이션한 다음, 4°C에서 12,000 × g 에서 10분 동안 원심분리한다.</li>
		<li>상청액을 새로운 원심분리 튜브로 옮깁니다. 250 μL의 이소프로필 알코올을 첨가하고 격렬하게 와류하십시오. 12,000 × g 에서 10분 동안 원심분리한다.</li>
		<li>상층액을 버리십시오. 500 μL의 75% 에탄올을 첨가하여 RNA를 세척한 다음, 샘플을 와류시킨다. 이를 12,000 × g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리한다.</li>
		<li>RNA 펠릿을 5분 동안 공기-건조시켰다.</li>
		<li>펠렛을 RNase가 없는 물 30 μL에 재현탁시킨다.</li>
		<li>공식을 사용하여 RNA 농도를 계산하십시오 : A260 × 희석 × 40 = μg RNA / mL. A260/A280 비율을 계산합니다. 참고 : ~ 2의 비율은 순수한 것으로 간주됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>좋은 품질의 RNA의 역전사를 수행하여 cDNA 주형을 얻는다.<ol><li>한 쌍의 특정 프라이머인 ppm-1-F/R(물질표 참조)을 설계하고 사용하여 B. xylophilus에서 Bx-ppm-1 유전자의 부분 코딩 서열을 증폭시킨다(GenBank 수탁번호 QTZ96795). </li>
		<li> ppm-1 유전자 서열을 표준 클로닝 프로토콜11에 따라 T7 프로모터를 포함하는 pGEM-Teasy 벡터로 복제한다.<ol><li>PCR 반응을 다음과 같이 설정한다: cDNA 2 μL, 2x Ex Taq 중합효소 프리믹스 25 μL, 각 프라이머 2 μL(10 pmol/l), 멸균 증류수를 최종 부피 50 μL로 설정한다.</li>
			<li>다음과 같이 증폭 절차를 수행한다: 94°C에서 5분; 이어서 94°C에서 30초, 55°C에서 30초, 및 72°C에서 1분의 35사이클; 및 최종 연장 단계를 72°C에서 5분 동안 포함한다.</li>
			<li>증폭된 제품을 pGEM-T Easy 벡터로 복제하여 시퀀싱합니다.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. dsRNA의 합성
<ol><li>양쪽 말단에 T7 프로모터 부위를 첨가하도록 설계된 프라이머로 PCR을 사용하여 dsRNA 합성을 위한 DNA 주형을 준비한다. T7 프로모터 서열을 프라이머의 5' 말단에 첨가한다.</li>
	<li> ppm-1 유전자 단편(894 bp)을 포함하는 플라스미드를 PCR용 주형으로 사용하여 T7 프로모터11을 포함하는 단편을 회수하였다. 위에서 설명한 PCR 절차 및 시스템을 사용하십시오.</li>
	<li>시험관내 전사 키트를 사용하여 dsRNA11을 합성한다.<ol><li>냉동 시약을 얼음 위에 녹입니다.</li>
		<li>2 μL의 10x 반응 완충액, 2 μL의 효소 믹스, 및 1 μg의 DNA를 원심분리 튜브에 첨가한다. 뉴클레아제가 없는 물을 첨가하여 표준 4 μL 반응을 생성한다. 이어서, 동량의 네 개의 리보뉴클레오티드 용액 (ATP, CTP, GTP 및 UTP)을 함께 혼합하고, 혼합물 8 μL를 튜브에 첨가한다. 완전히 혼합하고 37°C에서 4시간 동안 인큐베이션한다.</li>
		<li>1 μL의 DNase를 첨가하고, 잘 혼합하고, 37°C에서 15분 동안 인큐베이션한다.</li>
		<li>반응을 중지하고 뉴클레아제가없는 물 30 μL와 LiCl 침전 용액 30 μL를 첨가하여 RNA를 침전시켰다. 철저히 섞으십시오. -20°C에서 하룻밤 동안 인큐베이션한다.</li>
		<li>12,000 × g 및 4°C에서 15분 동안 원심분리한다. 상층액을 버리십시오.</li>
		<li>75% 에탄올 1 mL를 첨가하여 RNA를 세척한다. 샘플을 볼텍스하고, 이를 12,000 × g 및 4°C에서 10분 동안 원심분리한다.</li>
		<li>RNA 펠릿을 3분 동안 공기-건조시켰다.</li>
		<li>펠렛을 RNase가 없는 물 30 μL에 재현탁시킨다.</li>
		<li>분광광도계를 이용하여 dsRNA의 품질을 분석한다. dsRNA 샘플 1 μL를 측정 받침대 상에 피펫팅하고 파장을 340 nm로 설정하였다. 1.0 % 아가로스 젤로 제품을 시각화하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 담그기에 의한 RNAi
<ol><li>4 μL의 5x 담금 완충액 (0.05% 젤라틴, 5.5 mM KH2PO4, 2.1 mM NaCl, 4.7 mMNH4Cl, 3 mM 스페르미딘)을 dsRNA 및ddH2O와 혼합하여 총 부피 20 μL의 최종 RNA 농도 및 0.8 μg/mL의 최종 RNA 농도를 생성한다.</li>
	<li>J2 애벌레를 습득하십시오.<ol><li>곰팡이 배양물에서 선충류를 수집하여 직경 6cm의 유리 페트리 접시로 옮깁니다. 선충류가 자유롭게 수영 할 수 있도록 접시에 물 10mL를 넣으십시오. 선충류를 접시에 30 분 동안 보관하고 계란이 바닥에 달라 붙을 때까지 기다리십시오.</li>
		<li>물과 선충류를 조심스럽게 제거하고 알을 방해하지 않도록하십시오. 모든 애벌레와 성인이 제거 될 때까지 단계를 반복하여 접시에 계란 만 남겨 둡니다.</li>
		<li>수집된 알을 25°C의 어둠 속에서 24시간 동안 부화시켜 J2 유충을 얻었다. J2 유충을 수집하여 튜브에 넣은 다음 RNAi 실험15를 위해ddH2O로 3회 세척한다.</li>
		<li>J2 유충을 dsRNA 용액이 들어있는 2 mL 튜브로 옮기고 레조르시놀 용액 (틴포일에 싸서 물에 용해)을 추가하여 최종 농도 1.0 %를 생성합니다. 유충이 dsRNA를 효과적으로 흡수하는지 확인하기 위해 25°C에서 24시간 동안 진탕 테이블 상에서 15 × g 에서 원심분리로 유충을 인큐베이션한다.</li>
		<li>동일한 양의 선충류를 dsRNA 프로브 없이 또는 대조군으로서 GFP dsRNA 프로브와 함께 담그기 완충액에 담그십시오. GFP 유전자 (gfp, M62653.1)를 비내인성 대조군으로 사용하고 유전자 특이적 프라이머 T7-GFP-F/R을 사용하여 gfp 의 dsRNA를 합성한다.</li>
	</ol></li>
</ol>4. qPCR 검출
<ol><li>표적 유전자 간섭, GFP 유전자 간섭 및 방해받지 않은 대조군을 포함하여ddH2O로 J2유충을 청소하십시오. 상기 기재된 방법을 이용하여 각 그룹으로부터 총 RNAs를 추출한다.</li>
	<li>qPCR을 시작하십시오.<ol><li>원하는 소프트웨어를 사용하여 q-ppm-1-F/R 프라이머를 설계 하십시오(재료 표 참조).</li>
		<li>qPCR 반응을 cDNA 1 μL, 형광 프리믹스 6 μL, 각 프라이머 0.4 μL(10 pmol/l) 및 멸균 증류수를 포함하는 12 μL로 설정한다.</li>
		<li>qPCR을 다음과 같이 수행한다: 95°C에서 2분; 이어서 95°C에서 10초, 55°C에서 30초, 72°C에서 1분의 40 사이클을 따랐다.</li>
		<li>actb 유전자(GenBank 기탁번호 EU100952) 및 tbb-2 유전자(GenBank 기탁번호 MT769316) 또는 다른 유전자를 내부 참조 유전자로 사용하여 RNAi15 이후의 유전자 발현 수준의 변화를 평가하였다.</li>
	</ol></li>
	<li>사이클 역치(Ct) 값 및 용해 곡선에 따라, 2-ΔΔCt 방법을 사용하여 표적 유전자의 상대적 발현 수준을 추정하고 간섭 효율을 검증한다.<ol><li>표적 유전자의 Ct 값으로부터 각 샘플의 내부 참조 유전자의 Ct 값을 뺀 다음 ΔCt 값을 구한다. 그런 다음, 대조군의 ΔCt 값으로부터 간섭기의 ΔCt 값을 뺀 후 ΔΔCt 값을 구한다. 참고: ΔΔCt 값이 0보다 크면 간섭이 효과적임을 나타냅니다.</li>
	</ol></li>
</ol>5. RNAi를 따르는 선충류 성인의 몸 길이 평가
<ol><li>RNAi 후, J2 유충을 25°C에서 60시간 동안 PDA 플레이트 내의 B. 시네레아 잔디밭 상에서 성인이 될 때까지15시간 동안 배양하였다.</li>
	<li>Bellman 깔때기 방법을 사용하여 성인을 수집하십시오 (단계 1.1.2.1 참조)14.</li>
	<li>현미경으로 성인 선충류의 이미지를 획득하고 ImageJ 소프트웨어 (또는 기타 측정 소프트웨어)를 사용하여 신체 길이를 측정하십시오.<ol><li>| 분석을 선택하여 ImageJ를 사용하여 길이 측정 배율을 설정합니다. 거리를 알고 있으면 그려진 직선의 길이 값을 입력합니다. 길이 단위를 입력합니다.</li>
		<li>전역(모든 사진에 이 표준 사용) 확인란을 선택하고 확인을 클릭하여 측정할 이미지에서 직선으로 측정할 길이를 선택합니다.</li>
		<li>Ctrl+M(측정) 명령을 사용하여 결과를 표시하고 결과 창에 기록합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>통계 분석을 위해 50 마리의 남성과 50 마리의 여성 선충류를 측정하십시오12.</li>
	<li>각 표본에 대한 평균 및 표준 편차를 계산하여 데이터를 분석합니다. 스튜던트 t-검정을 사용하여 여러 그룹의 표본 평균을 비교합니다.</li>
</ol>

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</ol>

이해 상충은 선언되지 않았습니다.

B. xylophilus의 삶의 역사와 기생 환경은 다른 선충류의 삶과 다르지만,이 식물 병원균의 분자 병인에 대한 연구는 제한적이었습니다. C. elegans 및 기타 선충류에 CRISPR / Cas9 게놈 편집 기술을 적용하는 데 큰 진전이 있었음에도 불구하고 B. xylophilus에 적용된 RNAi 기술 만현재까지 17 일까지 발표되었습니다. RNAi는 선충류의 유전자 기능을 연구하는 데 사용할 수있는 가장 강력한 도구 중 하나이며 B. xylophilus 유전자 기능, 신호 전달 경로 및 유전자 치료18,19,20을 밝히는 연구에 널리 사용되었습니다. 무척추동물 모델에 사용되는 유전자 녹아웃 접근법과는 달리, 선충류에서 표적 유전자의 RNAi 매개...

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An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63645">Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus</a>. The Abstract and Protocol section was updated.

Erratum: Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

식물 기생 선충류 (PPN)는 식량 안보 및 산림 생태계에 대한 지속적인 위협입니다. 그들은매년 1,000 억 달러의 경제적 손실을 초래하며, 그 중 가장 문제가되는 것은 주로 뿌리 매듭 선충류, 낭종 선충류 및 소나무 선충류입니다. 파인우드 선충류인 Bursaphelenchus xylophilus는 소나무 시들음병의 원인균인 이주, 내구생 선충류입니다2. 그것은 전 세계적으로 소나무 숲에 큰 해를 끼쳤습니다3. Van Megen et al.4의 용어를 사용하여, B. xylophilus 는 Parasitaphelenchidae의 구성원이며 clade 10에 속하는 반면, 대부분의 다른 주요 식물 기생충은 clade 12에 속합니다.
독립적이고 최근에 진화 된 식물 기생충 인 B. xylophilus 는 비교 연구를위한 매력적인 모델입니다. 현재까지 clade 12에 속하는 뿌리 매듭 선충류와 낭종 선충류에 대한 상당한 연구가 있었으며, 이는 의무적이며 앉아있는 내생 기생충이며 가장 강렬하게 연구 된 선충류 중 일부입니다. 그러나이 중요한 분야에서 추가 연구를 수행하는 것은 중요한 도전과 함께 온다 : 기생 유전자의 기능은 연구 병목 현상이다. 기능적 연구는 일반적으로 자궁외 발현 및 녹다운 / 아웃 실험을 포함하지만 선충류에 대한 효과적인 유전 적 변형 프로토콜에 의존합니다. 결과적으로, PPN의 역유전학은 거의 독점적으로 RNAi에 의한 유전자 침묵에 의존한다.
진핵 세포에 널리 존재하는 메카니즘인 RNAi는 이중 가닥 RNA(dsRNA)5를 도입하여 유전자 발현을 침묵시킨다. 현재까지 dsRNA에 의해 유도되는 전사 후 유전자-침묵 메카니즘은 모든 연구된 진핵생물에서 발견되었으며, 기능적 유전체학 연구 및 기타 응용의 도구로서 RNAi 기술은 많은 유기체에서 급속히 발전해 왔다. 1998년6년 예쁜꼬마선충에서 RNAi 기계가 발견된 이래로, RNAi 기술은 선충류의 유전자 기능을 확인하는 효과적인 방법이 되었으며, 병원성 선충류7를 효과적으로 조절하는 새로운 방법으로 제안되고 있다.
RNAi는 기술적으로 facile-dsRNA에 청소년을 담그면 충분할 수 있다; 그러나, 이러한 접근법의 효능 및 재현성은 선충류 종 및 표적 유전자8에 따라 광범위하게 다양하다. 뿌리 매듭 선충류, 멜로이도인 인코그니타의 RNAi 경로에 관여하는 20개의 유전자의 침묵은 긴 dsRNAs를 트리거로 사용하여 조사되었으며, 그 결과 일부 유전자의 발현의 증가 및 변화 없음9를 포함한 다양한 반응을 초래하였다. 이러한 결과는 표적 유전자가 RNAi 녹다운에 다르게 반응할 수 있음을 보여주며, RNAi를 통한 선충류 조절을 위한 표적으로서의 적합성에 대한 철저한 평가가 필요하다. 그러나 현재 B. xylophilus의 발달 및 생식 생물학에 대한 연구가 부족합니다.
이전 연구10,11,12,13의 연속으로, 우리는 dsRNA의 합성, 합성 신경 자극제 담금질 및 정량적 중합 효소 연쇄 반응 (qPCR) 검출을 포함하여 B. xylophilus의 ppm-1 유전자의 기능을 연구하기 위해 RNAi를 적용하기위한 프로토콜을 여기에서 설명합니다. 이 실험적 접근 방식에서 얻은 지식은 기본적인 생물학적 시스템을 이해하고 소나무 시들음 질병을 예방하는 데 크게 기여할 것입니다.

<table><tbody><tr><td>베어만 굴뚝</td><td>해당 없음</td><td>해당 없음</td><td>선충을 분리하기 위해</td></tr><tr><td>비콘 디자이너 7.9</td><td>상하이 강유성 정보기술회사.</td><td>해당 없음</td><td>qPCR 프라이머를 설계하기 위해</td></tr><tr><td>보트리티스 시네레아</td><td>해당 없음</td><td>해당 없음</td><td>선충의 먹이로서</td></tr><tr><td><엠>Bursaphelenchus 실로필루스</엠></td><td>해당 없음</td><td>해당 없음</td><td>이 나무의 번호는 NXY61이며, 원래 중국 저장성 닝보의 병균 Pinus massoniana에서 채취되었습니다.</td></tr><tr><td>상온 인큐베이터</td><td>상하이 징홍 실험실 기기 회사</td><td>H1703544</td><td>컬투르 선충에</td></tr><tr><td>전기영동 장치</td><td>바이오-래드 연구소</td><td>1704466</td><td>전기영동 분석을 달성하기 위해</td></tr><tr><td>에탄올, 75%</td><td>시노팜 화학 시약 회사</td><td>80176961</td><td>RNA를 추출하기 위해</td></tr><tr><td>엑스탁 중합효소 프리믹스</td><td>타카라 바이오 주식회사</td><td>RR030A</td><td>PCR을 위해</td></tr><tr><td>엑스탁 중합효소 프리믹스</td><td>타카라 바이오 주식회사</td><td>RR390A</td><td>PCR을 위해</td></tr><tr><td>젤 이미저</td><td>롱진 과학 기기 회사</td><td>LG2020</td><td>핵산 밴드를 보이게 하기 위해</td></tr><tr><td>그래프패드 프리즘 8</td><td>그래프패드 프리즘</td><td>해당 없음</td><td>데이터를 분석하고 피규어를 만드는 것이요</td></tr><tr><td>고속 원심분리기</td><td>항저우 올셩 인스트루먼트 컴퍼니</td><td>AS0813000</td><td>원심분리기</td></tr><tr><td>고플럭스 조직 분쇄기</td><td>베르탱</td><td></td><td>RNA를 추출하기 위해</td></tr><tr><td>ImageJ 소프트웨어</td><td>국립보건원(NIH)</td><td>해당 없음</td><td>신체 길이를 측정하기 위해</td></tr><tr><td>이소프로필 알코올</td><td>상하이 알라딘 생화학 기술 주식회사</td><td>L1909022</td><td>RNA를 추출하기 위해</td></tr><tr><td>라이카 DM4B 현미경</td><td>라이카 마이크로시스템즈 주식회사</td><td></td><td>선충을 관찰하기 위해</td></tr><tr><td>자기 구슬</td><td>아오랑 과학기술회사</td><td>150010C</td><td>RNA를 추출하기 위해</td></tr><tr><td>MEGAscript T7 고수율 전사 키트</td><td>써모피셔 사이언티브 주식회사</td><td>AM1333</td><td>시험관 내에서 dsRNA를 합성하기 위해</td></tr><tr><td>NanoDrop ND-2000 분광광도계</td><td>써모피셔 사이언티브 주식회사</td><td>나노드롭 2000/2000C</td><td>dsRNA의 질을 분석하기 위해</td></tr><tr><td>PCR 증폭기</td><td>바이오-래드 라이프 메디컬 프로덕츠 주식회사</td><td>1851148</td><td>핵산 서열을 증폭하기 위해</td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>해당 없음</td><td>해당 없음</td><td>컬투르 선충에</td></tr><tr><td>pGEM-T 쉬운 벡터</td><td>프로메가 코퍼레이션</td><td>A1360</td><td>복제를 위해</td></tr><tr><td>감자 덱스트로스 아가(미디엄)</td><td>해당 없음</td><td>해당 없음</td><td>베르투르 <엠>보트리티스 시네레아</엠></td></tr><tr><td>Prime Script RT 시약 키트 gDNA 지우개</td><td>타카라 바이오 주식회사</td><td>RR047B</td><td>합성 cDNA로</td></tr><tr><td>프라이머 프리미어 5.0</td><td>프리미어 바이오소프트</td><td>해당 없음</td><td>PCR 프라이머를 설계하기 위해</td></tr><tr><td>프라이머: PPM-1-F/R</td><td>칭커 바이오테크놀로지 주식회사</td><td>해당 없음</td><td>F: 5'-GATGCGAAGTTGCCAATCATCTT -3'; 득점: 5'- CCAGATCCAGTCCACCATACACC -3</td></tr><tr><td>q-ppm-1-F/R</td><td>칭커 바이오테크놀로지 주식회사</td><td>해당 없음</td><td>수비: 5'-CATCCGAATGGCAATACAG-3'; R: 5'-ACTATCCTCAGCGTTAGC-3'</td></tr><tr><td>실시간 열 사이클러 및 nbsp; qTOWER 2.2</td><td>애널리티크 예나 인스트루먼트(베이징) 회사</td><td></td><td>qPCR에 대해</td></tr><tr><td>흔들리는 테이블</td><td>상하이 즈청 분석 기기 제조 회사.</td><td></td><td>선충 담그기</td></tr><tr><td>입체 현미경</td><td>충칭 옵텍 기기 주식회사</td><td>1814120</td><td>선충을 관찰하기 위해</td></tr><tr><td>T7-GFP-F/R</td><td>칭커 바이오테크놀로지 주식회사</td><td>해당 없음</td><td>F: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAAA GGAGAAGAACTTTTCAC-3'; R: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGCTG TTACAAACTCAAGAAGG-3'</td></tr><tr><td>그리고 nbsp; T7 프로모터</td><td>칭커 바이오테크놀로지 주식회사</td><td>해당 없음</td><td>TAATACGACTCACTATATAGGG</td></tr><tr><td>타카라 MiniBEST 아가로스 젤 DNA 추출 키트</td><td>타카라 바이오 주식회사</td><td>9762</td><td>DNA를 회수하기 위해</td></tr><tr><td>TaKaRa TB 그린 프리믹스 엑스타크 (Tli RNaseH Plus)</td><td>타카라 바이오 주식회사</td><td>RR820A</td><td>qPCR에 대해</td></tr><tr><td>트리클로로에탄</td><td>상하이 링펑 화학 시약 회사</td><td></td><td>RNA를 추출하기 위해</td></tr><tr><td>트리졸 시약</td><td>써모피셔 사이언티브 주식회사</td><td>15596026</td><td>총 RNA 추출 시약, RNA 추출</td></tr></tbody></table>

파인우드 선충류에서의 rna 간섭의 적용, bursaphelenchus xylophilus

Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

소나무 선충류 인 Bursaphelenchus xylophilus는 전 세계적으로 가장 파괴적인 침입 종 중 하나이며 소나무의 시들음과 결국 죽음을 초래합니다. 그들의 경제적 및 환경적 중요성에 대한 인식에도 불구하고, 지금까지 기존의 전방 유전학 및 트랜스제닉 방법을 사용하여 식물 기생 선충류 (PPNs)의 상세한 유전자 기능을 연구하는 것은 불가능했습니다. 그러나, 역 유전학 기술로서, RNA 간섭 (RNAi)은 B. xylophilus 를 포함한 선충류의 기능적 유전자에 대한 연구를 용이하게합니다.
이 논문은 B. xylophilus에서 ppm-1 유전자의 RNAi에 대한 새로운 프로토콜을 간략하게 설명하며, 이는 다른 병원성 선충류의 개발 및 재생에 중요한 역할을하는 것으로 보고되었습니다. RNAi의 경우, T7 프로모터를 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 표적 단편의 5'-말단에 연결시키고, 이중 가닥 RNA(dsRNA)를 시험관내 전사에 의해 합성하였다. 이어서, dsRNA 전달은 선충류를 합성 신경자극제와 혼합된 dsRNA 용액에 담그면서 달성되었다. B. xylophilus (대략 20,000 개체)의 동기화된 청소년을 세척하고 25°C에서 어둠 속에서 24 h 동안 담금질 완충액 중의 dsRNA (0.8 μg/mL)에 담갔다.
동일한 양의 선충류를 대조군으로서 dsRNA가 없는 침지 완충액에 넣었다. 한편, 또 다른 동일한 양의 선충류를 대조군으로서 녹색 형광 단백질(gfp) 유전자 dsRNA와 함께 침지 완충액에 넣었다. 침지 후, 표적 전사체의 발현 수준은 실시간 정량적 PCR을 사용하여 결정하였다. RNAi의 효과는 표현형의 현미경 관찰과 그룹 간의 성인의 신체 크기 비교를 사용하여 확인되었습니다. 현재의 프로토콜은 B. xylophilus 및 기타 기생 선충류의 유전자 기능을 유전 공학을 통해 통제 전략을 개발하기위한 연구를 발전시키는 데 도움이 될 수 있습니다.

RNAi 후 B. xylophilus 의 ppm-1 발현 분석 GFP dsRNA와 표적 유전자 dsRNA로 침지시킨 B. xylophilus의 ppm-1 유전자의 상대적 발현량은 각각 0.92 및 0.52이었다(ddH2O 처리 대조군의 ppm-1 유전자 발현량은 1로 설정하였다)(도 1). 따라서, 외인성 dsRNA는 B. 크실로필루스의 ppm-1 발현에 아무런 영향을 미치지 않으며; 그러나, ppm-1 dsRNA는 표적 유전자의 발현을 효과적으로 억제할 수 있다.
ppm-1 ...

여기에서는 유전자 기능 연구를 용이하게하기 위해 Bursaphelenchus xylophilus 에서 RNA 간섭에 대한 상세한 담그는 방법을 소개합니다.

파인우드 선충류에서의 RNA 간섭의 적용, Bursaphelenchus xylophilus

The pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is one of the most destructive invasive species worldwide, causing the wilting and eventual death of ...

RNAi는 선충류에서 유전자의 기능을 확인하는 효과적인 방법이되었으며 병원성 선충류를 효과적으로 제어하는 새로운 방법으로 제안되었습니다. RNAi는 선충류를 dsRNA에 담그고 시술에 충분할 수 있다. 시작하려면 Baermann 깔때기 방법으로 선충류를 수집하십시오.이를 위해 깔때기 아래에 고정 된 고무 튜브를 놓고 깔때기 입구에 두 겹의 여과지를 놓습니다. Botrytis cinerea 곰팡이 배양 물을 깔때기로 옮기고 물을 추가하여 곰팡이 매트를 담그십시오. 선충류가 수집되면 500 마이크로 리터의 추출 시약과 100 마이크로 리터의 자성 비드를 2 밀리리터 원심 분리 튜브에 첨가합니다.20 마이크로 리터의 선충류를 흡인하고 샘플을 9, 000 x g에서 30 초 동안 분쇄합니다. 5 분 동안 배양하고 섭씨 4도에서 10 분 동안 12, 000 x g에서 원심 분리합니다. 상청액을 새로운 원심 분리기 튜브로 옮깁니다.100 마이크로 리터의 클로로포름을 넣고 튜브를 여러 번 뒤집어 혼합하십시오. 3 분 동안 배양 한 다음 섭씨 4도에서 10 분 동안 12, 000 x g에서 원심 분리합니다. 다시, 상청액을 새로운 원심 분리 튜브로 옮깁니다.250 마이크로 리터의 이소 프로필 알코올을 첨가하고 격렬하게 소용돌이칩니다. 12, 000 x g에서 10 분 동안 원심 분리하고 와류. 상청액을 버리고 500 마이크로 리터의 75 % 에탄올을 첨가하여 RNA를 세척합니다.샘플을 와동시킨 후 섭씨 4도에서 5 분 동안 12, 000 x g에서 원심 분리합니다. RNA 펠릿을 5분 동안 자연 건조시키고 30마이크로리터의 RNase 자유수에 재현탁시킵니다. 이 공식을 사용하여 RNA 농도를 계산하고 A260 대 A280 비율을 계산합니다.다음으로, 프라이머 쌍을 사용하여 B.xylophilus로부터 BX ppm-1 유전자의 부분 코딩 서열을 증폭한다. 그 다음 ppm-1 유전자 서열을 T7 프로모터를 포함하는 pGEM-T Easy 벡터로 클로닝한다. 클로닝된 플라스미드를 PCR을 위한 주형으로 사용하여 894 염기쌍의 긴 ppm-1 유전자 단편을 회수한다.그 후, 시험관내 전사 키트를 사용하여 dsRNA를 합성한다. 분광 광도계를 사용하여 dsRNA의 품질을 분석하고 1%아가로스 겔에서 제품을 시각화합니다. 4 마이크로 리터의 5X 담금 버퍼를 추가하고 이중 증류수로 부피를 20 마이크로 리터로 구성하여 밀리리터 당 0.8 마이크로 그램의 최종 RNA 농도를 얻습니다.그런 다음 선충류를 접시에 30 분 동안 넣고 계란이 바닥에 달라 붙을 때까지 기다리십시오. 계란만 접시에 남을 때까지 계란을 방해하지 않고 물과 선충류를 조심스럽게 제거하십시오. 수집 된 알을 섭씨 25도의 어둠 속에서 24시간 동안 부화시켜 J2 유충을 얻습니다.유충을 튜브에 모으고 이중 증류수로 3 번 씻으십시오. 그런 다음 유충을 dsRNA 용액이 들어있는 튜브로 옮깁니다. 여기에 레조르시놀 용액을 추가하여 1% 용액을 얻습니다.유충에 dsRNA가 충분히 흡수되도록 유충을 흔들어 놓습니다. 대조군의 경우, 동일한 양의 선충류를 dsRNA 프로브 없이 또는 GFP dsRNA 프로브를 사용하여 담근 완충액에 담근다. 유전자 발현 수준의 변화를 평가하기 위해 actB 및 tbb-2 유전자를 내부 참조로 사용하여 qPCR을 수행한다.델타 델타 Ct 방법을 사용하여 용해 곡선 및 Ct 값으로부터 상대적인 유전자 발현 수준을 추정합니다. RNAi 후, J2 유충을 PDA 플레이트의 보트리티스 시네레아 잔디밭에서 성체가 될 때까지 배양한다. 섹션 1에 표시된 대로 Baermann 깔때기 방법을 사용하여 성체를 수집합니다.현미경으로 성충류의 이미지를 획득하고 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 50마리의 수컷 선충과 50마리의 암컷 선충의 몸 길이를 측정합니다. 각 표본에 대한 평균 및 표준 편차를 계산하여 데이터를 분석합니다. 스튜던트 t 검정을 적용하여 여러 그룹의 표본 평균을 비교합니다.RNAi 후 상대적인 유전자 발현 분석은 ppm-1 dsRNA가 B.Xylophilus 유전자의 ppm-1 유전자의 발현을 효과적으로 억제할 수 있음을 나타내었다. 반면 외인성 GFP dsRNA는 ppm-1 발현에 영향을 미치지 않았다. RNAi 후, 성인의 크기는 성적 성숙에 도달했음에도 불구하고 현저하게 감소하여 작은 신체 크기의 돌연변이 표현형을 초래했습니다.돌연변이 암컷과 수컷의 평균 몸 길이는 대조군의 971 및 912 마이크로 미터에 비해 544 및 526 마이크로 미터였습니다 가장 중요한 것은 선충류를 이중 가닥 RNA 용액으로 옮기고 다른 시약을 추가하여 선충류를 자극하여 먹이는 것입니다. 이 방법은 대규모 유전자 스크리닝에 적합하며 일반적으로 세포 연구에 사용됩니다. 이 방법으로 B.Xylophilus의 유전자 기능을 연구하는 것은 B.Xylophilus의 생물학적 제어에 대한 지침 가치가 있습니다.

application-rna-interference-pinewood-nematode-bursaphelenchus

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연구

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생물학

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RNA interference (RNAi)는 유전자 기능을 밝히는 데 매우 유용한 도구입니다. 그러나 성체 이전 단계에서 RNAi를 사용하여 유전자를 표적으로 하는 능력은 주요 인간 말라리아 매개체인 Anopheles gambiae에서 제한됩니다. 번데기 발달 중 직접 주입을 통해 유전자 기능을 감소시키는 RNAi 프로토콜에 대해 설명합니다.

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파인우드 선충류에서의 RNA 간섭의 적용, Bursaphelenchus xylophilus

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