Name: 딥 러닝의 지원을 받는 가상 염색을 통한 조직학적 이미징을 위한 고속 자외선 광음향 현미경 검사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: 학습하세요 고속 자외선 광음향 현미경을 활용한 딥 러닝 기반 가상 염색 조직학 이미징 방법을. 18분 내에 수술 중 조직 마진 분석이 가능하여 정확한 종양 절제를 지원합니다.

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저자는 홍콩 혁신 기술위원회 (ITS / 036 / 19)의 재정적 지원을 인정하고 싶습니다.

이 연구에서 수행 된 모든 동물 실험은 홍콩 과학 기술 대학의 동물 윤리위원회의 승인을 받았습니다.
1. 오픈 탑 UV-PAM 시스템 (그림 1)
<ol><li>광학 조명<ol>
<li>Q 스위치 다이오드 펌핑 고체 레이저(266nm 파장)를 여기 소스로 사용합니다.</li>
		<li>두 개의 볼록 렌즈를 사용하여 레이저 빔을 확장하고 핀홀을 첫 번째 볼록 렌즈의 초점에 가깝게 배치하여 공간 필터링을 수행합니다.</li>
		<li>1D 갈바노미터 미러(1D GM)를 사용하여 레이저 빔을 위쪽으로 반사합니다.</li>
		<li>대물 렌즈를 사용하여 레이저 빔에 초점을 맞추고 샘플에 단단히 초점을 맞추기 전에 링 모양의 초음파 변환기 (UT)의 중심을 통과하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>초음파 감지<ol>
<li>링 모양의 집중 UT를 사용하여 초음파를 감지하십시오. UT 활성 영역의 내부 및 외부 직경은 각각 3mm 및 6mm입니다. 초점 거리: 6.3 mm; 중심 주파수: 40 MHz; -6dB 대역폭: 84%.</li>
		<li>UT를 바닥에 광학적으로 투명한 창문이있는 실험실 제작 물 탱크에 고정하고 얇은 석영 커버 슬립으로 덮어 자외선이 통과 할 수 있도록하십시오. UT의 활성 영역이 위쪽을 향하고 있는지 확인하십시오. UT의 측면 위치를 제어하기 위해 물 탱크를 두 축 수동 스테이지에 부착하십시오.</li>
		<li>UV 레이저를 켜고 UT의 위치를 조정하여 레이저 빔이 UT의 중심에서 통과 할 수 있도록하십시오. UV 레이저를 끕니다. 그런 다음, 물 탱크를 탈이온수로 채워 UT를 완전히 침지시킨다.</li>
		<li>UT의 출력을 두 개의 증폭기(총 이득 = 56dB)에 연결하고 두 번째 증폭기의 출력을 데이터 수집 카드(DAQ)에 연결합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>샘플 홀더를 xy 전동 스테이지에 연결된 z축 수동 스테이지에 부착합니다. 샘플 홀더에는 자외선이 통과 할 수있는 빈 구멍이 있습니다. 구멍 주위에 양면 테이프 네 개를 부착합니다.</li>
	<li>시스템 정렬<ol>
<li>검정 테이프를 유리 슬라이드에 부착하고 유리 슬라이드를 배치하여 검은색 테이프가 아래쪽을 향하도록 하여 샘플 홀더의 구멍을 덮습니다. 유리 슬라이드를 눌러 샘플 홀더에 고정되었는지 확인합니다. 그런 다음, 샘플 홀더를 낮추어 유리 슬라이드를 물에 담그십시오.</li>
		<li>링 모양의 UT와 증폭기를 분리하고, UT를 펄스기/수신기에 연결하고, 펄스/수신기의 출력을 오실로스코프에 연결합니다. 펄스/수신기를 펄스-에코 모드로 작동시킵니다. 펄스 진폭과 펄스/수신기의 이득을 각각 6dB와 20dB로 설정합니다.<ol>
<li>펄스/수신기를 활성화하고 샘플 홀더의 z-위치를 조정하여 초음파 신호가 최대인 음향 초점면의 위치를 찾습니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>펄스/수신기를 전송 모드로 변경하고 게인을 60dB로 설정합니다. 레이저 출력을 활성화합니다. 대물 렌즈의 Z 위치를 조정하여 오실로스코프로 측정되는 PA 신호를 최대화합니다.</li>
		<li>링형 UT의 횡방향 위치를 조정하여 생성된 PA 신호를 대칭 및 최대로 만들며, 이는 광학 및 음향 초점이 측면 평면에서 공정렬됨을 나타냅니다. 그런 다음 샘플 홀더의 z-위치를 조정하여 PA 신호를 최대화합니다.</li>
		<li>1.4.3단계와 1.4.4단계를 반복하여 PA 신호의 대칭과 진폭을 모두 최적화합니다. PA 신호가 최적화될 때 오실로스코프에 시간 지연(즉, PA 파동이 UT에 도달하는 데 걸리는 시간)을 기록한다.</li>
		<li>샘플 홀더를 이동하여 검은색 테이프의 다른 위치를 이미지화합니다. 블랙 테이프의 각 위치에서 생성된 PA 신호가 1.4.5단계에서 측정된 것과 동일한 시간 지연을 갖도록 샘플 홀더의 평탄도를 조정합니다.</li>
		<li>레이저를 끄고 UT를 두 증폭기에 연결합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 시료 준비
<ol><li>FFPE 마우스 뇌 조각<ol>
<li>과다 복용 마취로 마우스를 희생하십시오. 이어서, 참조18에 기재된 프로토콜에 따라 마우스 뇌를 수확한다.</li>
		<li>수확 된 뇌를 10 % 중성 완충 포르말린에 24 시간 동안 고정시킵니다.</li>
		<li>등급화된 알코올로 탈수하고, 자일렌으로 클리어링하고, 참조19에 기재된 바와 같이 파라핀으로 임베딩함으로써 고정된 뇌를 처리한다. 참고: 샘플을 흄 후드에서 처리하십시오.</li>
		<li>마이크로톰을 사용하여 매립된 뇌를 얇은 조각(두께 5 μm)으로 슬라이스합니다. 샘플 슬라이스를 석영 슬라이드에 놓습니다. 슬라이드를 60°C의 오븐에서 1시간 동안 건조시킨다.</li>
		<li>클리어링제를 사용하여 섹션을 탈파라핀화( 표 참조)하고, 파라핀은 UV 여기로 고도로 흡수되기 때문에 높은 배경 신호를 피하기 위해 파라핀을 제거합니다. 참고: 샘플을 흄 후드에서 처리하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>신선한 마우스 두뇌 조각<ol>
<li>과다 복용 마취로 마우스를 희생하십시오. 이어서, 참조18에 명시된 프로토콜에 따라 마우스 뇌를 수확한다.</li>
		<li>마우스 뇌를 인산완충식염수(PBS)로 세척하여 혈액을 제거하였다.</li>
		<li>뇌 샘플(∼5 mm 두께)의 조각을 손으로 자르고, PBS로 샘플을 세척한 후 단면상의 혈액을 제거하였다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 실험 절차
<ol><li>샘플 배치<ol>
<li>UV 투명 멤브레인(폴리에틸렌, ∼10 μm 두께)으로 실험실에서 만든 샘플 탱크를 제조하였다. 멤브레인에 물 한 방울을 넣은 다음 생물학적 샘플을 샘플 탱크에 올려 놓고 물을 덮습니다. FFPE 슬라이스 샘플의 경우 테이프를 사용하여 멤브레인에 유리 슬라이드를 고정하십시오.</li>
		<li>샘플 함유 샘플 탱크를 샘플 홀더에 놓고 샘플 홀더의 빈 구멍을 덮으십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>UV 레이저를 외부 트리거 모드로 설정합니다. 실험실에서 제작한 LabVIEW 프로그램( 재료 표 참조)을 사용하여 다음과 같이 스캐닝 파라미터를 설정합니다.<ol>
<li>레이저 반복률을 55kHz로 설정합니다. GM 구동기의 신호 유형e를 삼각형 으로, 구동 전압 범위를 0.018V로 설정하십시오(±0.018V, 배율 계수: 1V/°를 나타냄). GMnum 을 22로 설정하고 dy 를 2로 설정하여 22개의 레이저 트리거 후에 GM이 스캐닝 기간의 분기를 완료하고 y축 모터가 0.3125μm의 스텝 크기를 이동하도록 합니다. dx 를 192로 설정하여 y축 모터가 사전 설정된 위치(예: 5mm)에 도달하면 x축 모터가 30μm의 스텝 크기를 이동하도록 합니다. 참고: 가장 작은 증분 스텝 크기는 x축 및 y축 모터 모두에 대해 0.15625μm로 설정됩니다. 따라서 dy = 2인 경우 스텝 크기는 0.15625 x 2 = 0.3125 μm이고 dx = 192일 때 스텝 크기는 0.15625 x 192 = 30 μm와 같습니다. 5 x5mm2의 전체 영역을 스캔하기 위해 x축 모터는 5000μm/30μm = 167배 이동하므로 전체 이미지를 얻기 위해 167개의 하위 이미지를 스티치합니다. UV-PAM 시스템의 주사 궤적에 대해서는 도 2 를 참조한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>x축 및 y축 모터의 이동 단계 수(xn = 10 및 yn = 1000)를 설정하여 작은 영역에서 시험 스캔 을 시작합니다. 최대 PA 신호를 얻기 위해 z축 수동 스테이지를 조정하여 샘플을 초점면에 배치합니다.</li>
	<li>x축 및 y축 모터를 모두 원하는 시작점으로 이동하고, xn 및 yn 값을 설정하여 스캔 영역을 설정한 다음, 이미지 수집 프로그램을 시작합니다( 자료 표 참조).</li>
	<li>이미지 수집 후 레이저를 끄고 샘플 홀더를 제거한 다음 생물학적 샘플을 저장합니다.</li>
	<li>신선한 생물학적 조직의 경우, 샘플을 10% 중성 완충 포르말린에 보관하십시오.</li>
	<li>FFPE 마우스 뇌 절편의 경우, 참조20 에 명시된 프로토콜에 따라 H&E로 염색하여 상응하는 H&E 염색된 이미지를 획득한다.</li>
	<li>수집된 PA 신호를 사용하여 실험실에서 제작한 이미지 처리 알고리즘을 사용하여 최대 진폭 프로젝션 이미지를 재구성 합니다(재료 표 참조).</li>
</ol>

<ol><li>Kunos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+conservation+surgery+achieving+%E2%89%A5+2+mm+tumor-free+margins+results+in+decreased+local-regional+recurrence+rates%5BTitle%5D)+AND+%22The+Breast+Journal%22%5BJournal%5D)">Breast conservation surgery achieving ≥ 2 mm tumor-free margins results in decreased local-regional recurrence rates.</a> The Breast Journal. 12, 28-36 (2006).</li>
<li>Rosai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+microscopy+will+remain+a+cornerstone+of+surgical+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Why microscopy will remain a cornerstone of surgical pathology.</a> Laboratory Investigation. 87 (5), 403-408 (2007).</li>
<li>Yang, J., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+sublimation%2Frecrystallization+for+imaging+proteins+by+mass+spectrometry+at+high+spatial+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Matrix sublimation/recrystallization for imaging proteins by mass spectrometry at high spatial resolution.</a> Analytical Chemistry. 83 (14), 5728-5734 (2011).</li>
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<li>Sterile Tissue Harvest | Protocol. , Available from: 
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<li>Steps to Tissue Processing for Histopathology. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.liecabiosystems.com/knowledge-pathway/an-introduction-to-specimen-processing/">https://www.liecabiosystems.com/knowledge-pathway/an-introduction-to-specimen-processing/</a> (2022).</li>
<li>An Intro to H&E Staining: Protocol, Best Practices, Steps & More. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.liecabiosystems.com/knowledge-pathway/he-staining-overview-a-guide-to-best-practices/">https://www.liecabiosystems.com/knowledge-pathway/he-staining-overview-a-guide-to-best-practices/</a> (2022).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultraviolet+photoacoustic+microscopy+with+tissue+clearing+for+high-contrast+histological+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Photoacoustics%22%5BJournal%5D)">Ultraviolet photoacoustic microscopy with tissue clearing for high-contrast histological imaging.</a> Photoacoustics. 25, 100313(2022).</li>
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</ol>

T. T. W. W. 및 V. T. C. T.는 PhoMedics Limited에 재정적 인 관심을 가지고 있지만이 작업을 지원하지 않았습니다. 저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

요약하면, 고속 및 오픈 탑 UV-PAM 시스템은 조직학적 이미징을 위해 입증되었다. 시스템 구성, 광학 정렬, 샘플 준비 및 실험 절차에 대한 자세한 지침이 제시됩니다. 이미지 수집 프로그램은 Github에서 자료 표에 제공된 링크를 통해 액세스 할 수 있습니다. 본 시스템의 측방향 분해능은 ∼1.2 μm이며, 이는 최근 간행물21에서 실험적으로 측정되었다. 마우스 뇌 슬라이스를 본원이 뇌 생검22의 전형적인 크기인 5 x 5mm2의 영역에 대해 18분 이내에 조직학적 이미지를 얻을 수 있다는 것을 입증하기 위해 영상화되었다. 원본 이미지는 회색조이지만 딥 러닝 알고리즘에 의해 활성화 된 디지털 가상 염색 도구의 도움으로 본 시스템은 거의 실시간으로 사실상 염색 된 이미지를 추가로 제공 할 수있어 병리학자가 이미지를 해석 할 수 있도록 쉽게 적응할 수 있습니다. 라벨이 없는 이미지 기술로서, 본 UV-PAM 시스템은 또한 처리되지 않은 신선한 조직 샘플에 대한 조직학적 이미지를 제공할 수 있다. 더 많은 예들(냉동-절편화 및 신선한 조직 샘플 포함)이 이전 간행물17에서 입증되었다. 실험 결과는 SMA 애플리케이션에서 현재의 딥러닝 보조 UV-PAM 시스템의 높은 잠재력을 보여줍니다.
UV-PAM 시스템의 장점 중 하나는 시스템이 반사 모드로 구현되어 두꺼운 조직의 이미징을 가능하게한다는 것입니다. 게다가, 오픈 탑 UV-PAM 시스템은 샘플을 스캐닝 창 (샘플 탱크의 멤브레인)에 배치 할 수있게하며, 이는 전통적인 광학 현미경과 유사한 작동을합니다. 따라서, 이 시스템은 샘플이 두 개의 멤브레인(11,14)에 의해 샌드위치될 것을 필요로 하는 다른 시스템들보다 더 사용자 친화적이다. 더욱이, 높은 반복률의 UV 레이저와 함께 1D GM을 사용함으로써, 본 UV-PAM 시스템은 다초점 여기(23)를 사용하는 시스템과 비교할 때 더 높은 비용 효율성으로 높은 이미징 속도를 달성할 수 있다.
현재 이미징 속도는 주로 레이저 및 광자 예산의 반복률에 의해 제한됩니다. 높은 반복률과 높은 펄스 에너지를 가진 레이저를 사용하면 이미징 시간을 더욱 단축 할 수 있습니다. 시스템의 또 다른 한계는 사용자가 샘플에 초점이 맞는지 여부를 시각화할 수 있도록 실시간 이미지를 표시하는 대신 최대 PA 신호를 찾아 대물 렌즈의 초점면에 대해서만 샘플을 대략적으로 조정할 수 있다는 것입니다. 거의 실시간 이미지를 표시하기 위해 2D GM을 적용 할 수 있습니다.
프로토콜에는 두 가지 중요한 단계가 있습니다 : (a) 광학 및 음향 초점의 공초점 요구 사항은 높은 감지 감도를 달성하기 위해 최적화되어야합니다. (b) x축 상의 GM의 주사 범위는 유사한 높은 검출 감도를 유지하기 위해 링형 UT의 음향 초점 스폿보다 작아야 한다(전류 셋업에서, 주사 범위는 ∼30 μm±15 μm이다). 그렇지 않으면 전체 이미지를 얻기 위해 여러 하위 이미지를 함께 꿰매어 가장자리 주변의 명백한 vignetting 효과가 발생합니다.

현미경으로 조직 표본을 검사해야하는 외과 마진 분석 (SMA)은 절제 수술에서 모든 암세포가 환자의 몸에서 제거되는지 여부를 결정하는 데 필수적인 절차입니다1. 따라서 조직학적 이미지를 신속하게 제공할 수 있는 현미경은 SMA가 암세포의 불완전한 제거로 인한 반복적인 수술을 피하기 위해 매우 중요하다. 그러나 밝은 현장 광학 현미경에 기반한 현재의 금 표준 방법에 따르면, 적출 된 조직은 포르말린에 고정되고 파라핀에 묻혀 얇은 조각 (4-7 μm)으로 절편화 된 다음 이미징 전에 헤마톡실린과 에오신 (H & E)으로 염색해야하며 이는 시간이 많이 걸리고 (3-7 일) 힘들고 2,3 . 냉동 절편은 조직을 신속하게 동결, 슬라이스 및 염색함으로써 SMA에 대한 신속한 대안이며, 이는 20-30 분4에서 조직 학적 이미지를 제공 할 수 있습니다. 그러나 조직학적 특징은 종종 왜곡되고 숙련 된 훈련이 필요하며, 이는 여러 유형의 장기에 대한 기술의 적용을 방해합니다5.
조직 처리의 몇 단계 없이 또는 몇 단계와 함께 세포 이미지를 제공할 수 있는 광학 현미경 기술이 SMA를 위해 개발되었다. 그러나 각각은 다른 문제로 고통 받고 있습니다. 예를 들어, 광학 간섭 단층 촬영(6) 및 공초점 반사율 현미경 (7)은 낮은 고유 산란 콘트라스트 때문에 낮은 특이성을 겪는다. 자외선 표면 여기 8 및 광 시트 현미경(9)을 사용한 현미경 검사는 SMA에 대한 고해상도 및 고대비 이미지를 제공 할 수 있지만 독성 및 휘발성 염색 절차는 일반적으로 수술실에서 수행 할 수 없으므로 처리 시간이 연장됩니다. 다중 광자 현미경(10) 및 자극된 라만 현미경(11)은 SMA에 대한 풍부한 정보를 제공할 수 있다. 그러나 비선형 효과를 생성하는 데 사용되는 필요한 초고속 레이저의 높은 비용은 광범위한 적용 가능성을 방지합니다.
최근에, 내재적 광학 흡수를 이용함으로써, 고해상도 조직학적 이미지(12)를 제공하기 위해 라벨이 없는 자외선 광음향 현미경(UV-PAM)이 개발되었다. UV-PAM에서, 여기 UV 광(예를 들어, 266 nm)의 광자 에너지는 먼저 세포 핵(13 )에서 DNA/RNA에 의해 흡수된 다음, 열로 변환되어, 열-탄성 팽창(14)을 통한 음향파 방출을 유도한다. 생성된 음향파를 검출함으로써, 세포 핵의 2차원(2D) UV-PAM 이미지는 음향 신호의 최대 진폭 투영을 통해 얻을 수 있으며, SMA에 대한 조직학적 정보를 제공한다. UV-PAM의 임상 적용을 가능하게 하기 위해, 갈바노미터 미러 스캐닝에 기초한 고속 UV-PAM은 18분 이내에 뇌 생검 샘플(5mm x 5mm)에 대한 조직학적 이미지를 제공하기 위해 개발되었으며, 이는 시간에 민감한 애플리케이션(15)에서 큰 잠재력을 보여준다. 두꺼운 조직 이미징에 대한 UV-PAM의 가능성을 더욱 검증하기 위해, 방수 일축 미세 전자 기계 시스템 스캐너를 갖춘 반사 모드 UV-PAM 시스템이 제안되어 인간 결장 및 간 조직의 수술 내 조직 병리학 적 검사를 성공적으로 시연했습니다16. 원래의 UV-PAM 이미지는 회색조이고 골드 표준 H&E 염색 이미지는 분홍색과 보라색이기 때문에 병리학자가 UV-PAM 이미지를 직접 해석하기가 어렵습니다. 이 문제를 해결하기 위해, 병리학자가 추가적인 훈련 없이 이미지를 이해할 수 있도록 그레이스케일 UV-PAM 이미지를 거의 실시간으로 가상 H&E 염색된 이미지로 전송하는 딥러닝 알고리즘이 제안되었다(17).
이 작업은 기존의 광학 현미경과 유사하게 작동 할 수있는 고속 및 오픈 탑 UV-PAM 시스템을보고하여 원래의 회색 음영 조직 학적 이미지와 딥 러닝 알고리즘에 의해 지원되는 사실상 염색 된 이미지를 모두 제공합니다. 포르말린 고정 및 파라핀 임베디드 (FFPE) 마우스 뇌 조각은 UV-PAM 시스템에 의해 이미지화되어 사실상 염색 된 UV-PAM과 표준 H & E 염색 이미지 간의 유사성을 입증하여 SMA 응용 분야에 대한 잠재력을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>알코올</td><td>시그마 알드리치</td><td>PHR1373</td><td>샘플 탈수</td></tr><tr><td>증폭기</td><td>미니 회로</td><td>ZFL-500LN-BNC +</td> <td>초음파 신호 증폭</td></tr><tr><td>컨트롤러</td><td>내쇼날인스트루먼트</td><td>NI myRIO</td><td>시스템 컨트롤러</td></tr><tr><td>데이터 수집 카드</td><td>Alazar Technologies</td><td>ATS9350</td><td>초음파 신호 수집</td></tr><tr><td>딥 러닝 알고리즘</td><td></td><td></td><td>회색조 UV-PAM 이미지를 가상 H&로 전송하기 위한 용도 E-스테인드 이미지; https://github.com/TABLAB-HKUST/Deep-PAM</td></tr><tr><td>포르말린</td><td>시그마 알드리치</td><td>R04586</td><td>샘플 정착</td></tr><tr><td>H& E staining kit</td><td>Abcam</td><td>ab245880</td><td>Sample staining</td></tr><tr><td>Histo-Clear II</td><td>National Diagnostics</td><td>HS-202</td><td>Sample deparaffinization</td></tr><tr><td>Image acquisition program</td><td>National Instruments</td><td>LabVIEW</td><td>Lab-built program using LabVIEW; https://github.com/TABLAB-HKUST/LabVIEW-program-for-UV-PAM</td></tr><tr><td>Image processing algorithm</td><td>Mathworks</td><td>MATLAB</td><td>MATLAB을 사용하여 실험실에서 구축한 알고리즘; </td></tr><tr><td>https://github.com/TABLAB-HKUST/ImageRec_GM-UVPAM Kinematic platform mounts</td><td>Thorlabs</td><td>KM200B</td><td>샘플을 평평하게 조정</td></tr><tr><td>Membrane</td><td>Glad</td><td>Cling 랩</td><td>샘플 탱크에 끼워 넣음</td></tr><tr><td>현미경 대물 렌즈</td><td>Thorlabs</td><td>LMU-5X-NUV</td><td>대물 렌즈</td></tr><tr><td>전동 스테이지</td><td>Physik Instrumente</td><td>L-509.10SD00</td><td>스캐닝 스테이지</td></tr><tr><td>1차원 갈바노미터 미러</td><td>Thorlabs</td><td>GVS411</td><td>고속 스캐닝 미러</td></tr><tr><td>오실로스코프</td><td>RIGOL Technologies</td><td>DS1102E</td><td>초음파 신호 판독 인</td></tr><tr><td>산염 버퍼 식염수</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3813</td><td>샘플 세척</td></tr><tr><td>핀홀</td><td>Edmund Optics</td><td>#59&ndash; 257</td><td>공간 필터링</td></tr><tr><td>Plano 볼록 렌즈</td><td>Thorlabs</td><td>LA-4600-UV</td><td>초점 렌즈</td></tr><tr><td>Plano 볼록 렌즈</td><td>Thorlabs</td><td>LA-4663-UV</td><td>시준 렌즈</td></tr><tr><td>펄서/수신기</td><td>Imaginant</td><td>DPR300</td><td>펄스 에코 증폭기</td></tr><tr><td>Q 스위치 다이오드 펌핑 고체 레이저</td><td>Bright Solutions</td><td>WEDGE HF 266 nm</td><td>266nm 레이저</td></tr><tr><td>링 모양의 초음파 변환기</td><td>University of Southern California</td><td></td><td>초음파 신호 감지</td></tr><tr><td>샘플 홀더</td><td>Lab-made</td><td></td><td>샘플 탱크 Hold</td></tr><tr>the<td>Sample tank</td><td>Lab-made</td><td></td><td>Hold 생물학적 샘플 단</td></tr><tr><td>축 Z-translational stage</td><td>Thorlabs</td><td>PT1</td><td>수동 스테이지</td></tr><tr><td>2축 수동 스테이지</td><td>Thorlabs</td><td>LX20</td><td>수동 스테이지</td></tr><tr><td>물 탱크</td><td>실험실에서 만든</td><td></td><td>초음파 신호 전송</td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>XX0060</td><td>샘플 클리어링</td></tr></tbody></table>

딥 러닝의 지원을 받는 가상 염색을 통한 조직학적 이미징을 위한 고속 자외선 광음향 현미경 검사

High-Speed Ultraviolet Photoacoustic Microscopy for Histological Imaging with Virtual-Staining assisted by Deep Learning

종양 절제 수술에서 암 조직의 완전한 절제를 확인하는 데 필수적인 절차 인 외과 마진 분석 (SMA)은 긍정적 인 수술 마진으로 인한 반복적 인 수술을 피하기 위해 수술 내 진단 도구가 필요합니다. 최근에는 266nm 파장에서 DNA/RNA의 높은 고유 광학 흡수를 활용하여 자외선 광음향 현미경(UV-PAM)이 개발되어 라벨링 없이 고해상도 조직학적 이미지를 제공하여 SMA의 수술 중 도구로서 큰 기대를 걸고 있습니다. SMA용 UV-PAM의 개발을 가능하게 하기 위해, 여기에서는 기존의 광학 현미경과 유사하게 작동할 수 있는 고속 및 오픈 탑 UV-PAM 시스템이 제시된다. UV-PAM 시스템은 1.2μm의 높은 측면 분해능과 1축 갈바노미터 미러 스캐닝을 통해 55kHz A 라인 속도의 높은 이미징 속도를 제공합니다. 또한, UV-PAM 이미지가 추가 훈련 없이 병리학자가 쉽게 해석할 수 있도록 하기 위해, 원래의 그레이스케일 UV-PAM 이미지는 표준 헤마톡실린 및 에오신-염색된 이미지를 모방하는 딥러닝 알고리즘에 의해 사실상 염색되어, 훈련이 없는 조직학적 분석이 가능하게 한다. 마우스 뇌 슬라이스 이미징은 오픈 탑 UV-PAM 시스템의 높은 성능을 입증하기 위해 수행되며, SMA 응용 분야에 대한 큰 잠재력을 보여줍니다.

도 1은 고속 UV-PAM 시스템의 개략도를 나타낸다. 이 설정에서 광학 여기 및 초음파 감지 경로는 샘플 아래의 동일한 측면과 아래에 있으므로 반사 모드 및 오픈 탑 시스템을 형성합니다. 따라서 사용자 친화적이며 두꺼운 샘플을 이미징하는 데 적합합니다.
도 2는 이미징 동안 UV-PAM 시스템의 주사 궤적을 보여준다. 각 섹션의 서브-이미지(예를 들어, 5 mm x 30 μm의 면적)는 먼저 산란된 보간 알고리즘을 사용하여 생성된 다음, 전체 이미지(예를 들어, 5 mm x 5 mm의 영역)는 커스텀 이미지 프로세싱 알고리즘을 사용하여 모든 서브-이미지들을 스티칭함으로써 획득된다( 재료 표 참조).
도 3A 및 도 3B는 각각 FFPE 마우스 뇌 슬라이스의 UV-PAM 및 H&amp;E 이미지를 보여주며, 이들 둘 다 5 x 5mm2의 시야를 갖는다. 이미지 처리 알고리즘은 재료 표에 제공된 링크를 통해 Github에서 액세스할 수 있습니다. 이미지 획득 시간은 18분 미만이었다. 도 3C-F는 개별 세포 핵이 명확하게 해결될 수 있는 도 3A에서 표시된 영역의 확대된 이미지를 보여준다. 더 중요한 것은, 상응하는 세포 핵이 표준 H&amp;E 염색된 이미지(그림 3G-J)에서 발견될 수 있으며, 이는 세포 이미징을 위한 현재 시스템의 높은 정확도를 보여준다. 그레이스케일 UV-PAM 이미지를 가상 H&amp;E-염색된 이미지로 전송하기 위해, 딥 러닝 알고리즘(17)(재료 표 참조)이 적용되었으며, 이는 8000 x 8000 픽셀의 이미지에 대해 30초 미만이 소요된다. 대응하는 줌인 이미지는 도 3K-N에 도시되어 있다. 사실상 염색된 UV-PAM 이미지는 H&amp;E 염색 이미지와 거의 동일한 구조적 정보를 제공하여 현재 UV-PAM 시스템의 임상 번역에 대한 약속을 보여줍니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63649/63649fig01.jpg"> 그림 1: 고속 및 개방형 UV-PAM 시스템의 회로도. (A) 시스템 설정. (B) 두 축 수동 스테이지에 부착되어 있는 샘플 홀더 및 물탱크의 사진. (c) 시료 홀더의 구멍을 덮고 있는 물탱크와 시료탱크에 고정된 링형 초음파 트랜스듀서의 사진. (d) 샘플 홀더 상에 배치될 멤브레인 및 샘플이 있는 샘플 탱크의 사진. 자외선: 자외선; DAQ: 데이터 수집 카드; GM : 갈바노미터 거울. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63649/63649fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63649/63649fig02.jpg"> 그림 2: 이미징 중 UV-PAM 시스템의 스캐닝 궤적. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63649/63649fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63649/63649fig03.jpg"> 도 3: 딥러닝 기반 가상 염색을 이용한 UV-PAM 이미징의 실험 결과. (a) FFPE 마우스 뇌 슬라이스의 UV-PAM 이미지. (B) 동일한 슬라이스의 표준 H&amp;E 염색 이미지. 배율 막대: 1mm. (C-F) A에서 표시된 영역의 확대 이미지. (G-J) B에서 표시된 영역의 상응하는 H&amp;E 염색된 이미지. (K-N) 딥 러닝 알고리즘을 사용하여 사실상 염색된 이미지에 대응합니다. 배율 막대: 50μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63649/63649fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

수술 마진 분석을 위해 수술 중 조직학적 이미지를 제공할 수 있는 고속 및 개방형 자외선 광음향 현미경이 시스템 구성, 광학 정렬, 샘플 준비 및 실험 절차를 포함하여 시연됩니다.

Surgical margin analysis (SMA), an essential procedure to confirm the complete excision of cancerous tissue in tumor resection surgery, requires ...

수술 내 수술 모니터 분석은 암 조직의 복잡한 절제를 정확하고 신속하게 확인하는 진단 도구가 필요하기 때문에 종양 절제 수술에서 여전히 큰 도전입니다. 그런 다음 긍정적 인 수술 마진으로 인해 반복적 인 수술을 피할 수 있습니다. 당사의 고속 개방 자외선 광음향 현미경은 다섯 밀리미터 정사각형의 이미징 영역으로 18분 이내에 조직 샘플의 조직학적 이미지를 표지할 수 있어 수술 내 수술 마진 분석에 큰 잠재력을 보여줍니다.절차를 시연하는 것은 Xiufeng Li, 내 실험실에서 마지막 학년 박사 과정 학생이 될 것입니다. 파장 266나노미터의 Q 스위치 다이오드 펌핑 고체 레이저를 여기 소스로 사용하여 현미경 시스템의 광 조명 설정부터 시작하십시오. 두 개의 볼록 렌즈를 설치하여 레이저 빔을 확장하고 공간 필터링을 위해 첫 번째 볼록 렌즈의 초점에 핀홀을 배치합니다.1D 갈바노미터 거울을 사용하여 레이저 빔을 위쪽으로 반사하십시오. 대물 렌즈의 도움으로 레이저 빔을 샘플에 집중시킵니다. 얇은 석영 커버 슬립으로 덮인 바닥에 광학적으로 투명한 창문이있는 실험실 제작 물 탱크에 활성 영역이 위쪽을 향하게하는 링 모양의 집중 UT를 고정 한 다음 물 탱크를 현미경의 두 축 수동 단계에 부착하여 UT의 측면 위치를 제어하십시오. 완료되면 UV 레이저를 켜고 UT의 위치를 조정하여 레이저 빔이 UT의 중심을 통과 할 수있게 한 다음 UV 레이저를 끄고 물 탱크를 탈이온수로 채워 UT를 완전히 담그십시오. UT의 출력을 두 개의 증폭기에 연결하여 총 이득 56데시벨을 얻은 다음 두 번째 증폭기의 출력을 컴퓨터에 설치된 데이터 수집 카드 또는 DAQ에 연결합니다.그런 다음 샘플 홀더를 xy 전동 스테이지에 연결된 z축 수동 스테이지에 연결한 다음 샘플 홀더의 빈 구멍을 둘러싸는 양면 테이프 네 개를 배치합니다. 그런 다음 검은 테이프를 유리 슬라이드에 부착 한 다음 유리 슬라이드를 배치하여 검은 색 테이프가 아래쪽을 향하도록 샘플 홀더의 구멍을 덮습니다. 샘플 홀더 위의 유리 슬라이드를 누른 후 샘플 홀더를 내려 유리 슬라이드를 물에 담그십시오.링 모양의 UT와 증폭기를 분리한 다음 UT를 펄스/수신기에 연결하고 펄스/수신기의 출력을 오실로스코프에 연결합니다. 펄스 진폭이 여섯 개이고 이득이 20데시벨인 펄스 에코 모드로 펄스 / 수신기를 작동시킵니다. 파라미터가 설정되면 샘플 홀더의 z-위치를 조정하고 초음파 신호가 최대인 음향 초점면의 위치를 정의합니다.게인을 60데시벨로 설정하기 전에 펄스/수신기를 전송 모드로 변경한 다음 레이저 출력을 활성화하고 대물 렌즈의 z-위치를 조정하여 오실로스코프에서 측정된 광음향 또는 PA 신호를 최대화합니다. 생성된 PA 신호를 대칭 및 최대로 만들려면 링 모양의 UT의 횡 위치를 조정한 다음 샘플 홀더의 z-위치를 조정하여 PA 신호를 최대화합니다. 대물 렌즈의 z-위치 및 샘플 홀더에 대한 조정을 반복하여 PA 신호의 대칭과 진폭을 최적화합니다.PA 신호가 최적화되면 PA 파동이 오실로스코프의 UT에 도달하는 데 걸리는 시간 지연 또는 시간을 기록하십시오. 샘플 홀더를 이동하여 검은색 테이프의 다른 위치를 이미지화합니다. 검정 테이프의 각 위치에서 생성된 PA 신호가 이전에 측정된 것과 동일한 시간 지연을 갖도록 샘플 홀더 평탄도를 조정합니다.시스템 정렬이 완료되면 레이저를 끄고 UT를 두 증폭기에 연결합니다. 포르말린 고정 및 파라핀 포매된 마우스 뇌 조각을 제조하기 위해, 수확된 뇌를 10% 중성 완충 포르말린에 고정시켰다. 24 시간 후, 등급이 매겨진 알코올로 탈수하고, 자일렌으로 클리어링하고, 파라핀으로 임베딩하여 고정 된 뇌를 처리하십시오.마이크로톰을 사용하여 임베디드 뇌의 다섯 마이크로미터 두께의 조각을 얻으십시오. 샘플 조각을 석영 슬라이드에 올려 놓고 섭씨 60도의 오븐에서 한 시간 동안 건조시킵니다. 나중에, 파라핀의 높은 배경 신호를 피하기 위해 클리어링제로 뇌 섹션을 파라핀화하십시오.신선한 마우스 뇌 조각을 제조하기 위해, 수확된 마우스 뇌를 PBS로 세척한 다음, 뇌 샘플의 다섯 밀리미터 두께 조각을 손으로 절단한 다음, 뇌 조각을 PBS로 세척하여 단면상의 혈액을 제거하였다. 샘플 배치를 위해, 두께 10 마이크로미터의 UV 투명 폴리에틸렌 멤브레인으로 실험실 제작 샘플 탱크를 준비한 다음, 멤브레인에 물 한 방울을 첨가하고 생물학적 샘플을 샘플 탱크에 올려 놓고 물을 덮는다. 다음으로, 샘플 홀더의 빈 구멍을 덮을 수 있도록 샘플 홀더 위에 샘플 포함 탱크를 놓습니다.UV 레이저를 외부 트리거 모드로 설정하고 실험실에서 제작한 실험실 뷰 프로그램을 사용하여 원고에 설명된 대로 스캔 파라미터를 설정합니다. x축 및 y축 모터의 이동 단계 수를 설정하여 작은 영역에서 시험 스캔을 시작한 다음 z축 수동 단계를 조정하여 최대 PA 신호를 얻기 위해 샘플을 초점면에 배치합니다. x 축 및 y 축 모터를 원하는 시작 지점으로 이동하고 xn 및 yn 값을 설정하여 스캔 영역을 설정 한 후 이미지 수집 프로그램을 시작하십시오.이미지가 필요한 경우 레이저를 끄고 샘플 홀더를 제거하십시오. 신선한 생물학적 조직을 10% 중성 완충 포르말린에 보관하십시오. 수집된 PA 신호를 사용하여 실험실에서 제작한 이미지 처리 알고리즘을 사용하여 최대 진폭 프로젝션 이미지를 재구성합니다.대표적인 분석은 FFPE 마우스 뇌 조각의 UV-PAM 및 H & E 이미지를 보여줍니다. 확대된 UV-PAM 이미지에서, 개별 세포 핵은 해결될 수 있었다. 해당 세포 핵은 표준 H & E 염색 이미지에서 발견되어 세포 이미징을위한 현재 시스템의 높은 정확도를 보여줍니다.그레이스케일 UV-PAM 이미지를 가상 H&E 염색 이미지로 전송하기 위해 딥 러닝 알고리즘이 적용되었습니다. 시스템 정렬 중에 UV광이 중심을 통과 할 수 있도록 링 모양의 초음파 변환기의 위치를 조정하는 것이 중요합니다. 이를 통해 감지 가능한 광음향 신호를 얻을 수 있으며 레이저가 켜져있을 때 더욱 최적화 할 수 있습니다.우리의 분류 알고리즘은 이미지의 종양과 정상 영역을 분류하기 위해 추가로 통합 될 수 있으며, 의료 전문가를위한 보조 이미징 및 진단 플랫폼 역할을합니다.

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